微波輔助PEG提取金銀花葉中綠原酸的工藝優(yōu)化

黃 榮，向 福，2 *，馬文靜，吳 偉，項(xiàng) 俊，2

（1.黃岡師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000；3.湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003）

金銀花（Lonicerae japonicaThunb）又名忍冬，是我國一種傳統(tǒng)的中草藥植物。綠原酸是金銀花中主要的活性成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降血脂、降血壓、保肝利膽以及清除自由基等功能[1]，被譽(yù)為“植物黃金”，廣泛用于食品、保健、醫(yī)藥、衛(wèi)生和化工等領(lǐng)域。金銀花葉中含有豐富的綠原酸，山東、河南等地金銀花葉中的綠原酸含量均超過了同一時(shí)期的金銀花[2]，而黃岡地標(biāo)產(chǎn)品—羅田金銀花，其葉中綠原酸含量達(dá)7%左右[3]。另外，金銀花葉的產(chǎn)量是同期花產(chǎn)量的10倍左右[4]。因此，金銀花葉中的綠原酸比金銀花中的更豐富且采集更容易、成本更低廉，科學(xué)利用金銀花資源，對(duì)促進(jìn)大別山地區(qū)金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

以金銀花為原料提取綠原酸的工藝主要有醇提法、水提法、半仿生法等[5-8]。但這些提取方法存在耗時(shí)長、成本高、提取率低、有機(jī)溶劑消耗量大、雜質(zhì)多等問題。研究一種成本低、產(chǎn)率高、簡單快速、環(huán)境友好的綠原酸提取工藝對(duì)大別山金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大。

微波法提取具有選擇性好、穿透力強(qiáng)、溶劑用量少、提取時(shí)間短、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)[9-12]，且能有效克服中藥材細(xì)粉煎煮提取過程中的堵塞、糊化等問題，適合工業(yè)化生產(chǎn)[13]。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）具有良好的生物相容性和低免疫原性，不易燃、耐酸堿、耐高溫、成本低、溶解性好、可生物降解、環(huán)境友好、低分子質(zhì)量的PEG（如PEG-200）不揮發(fā)等諸多優(yōu)良性質(zhì)，且美國食品藥物管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）已證實(shí)其安全無毒[14]。因此，將PEG用于藥用植物中活性成分的提取具有廣闊的應(yīng)用前景。

本研究以金銀花葉為原料，采用微波輔助PEG-200提取金銀花葉中綠原酸。以綠原酸的提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)提取溫度、PEG-200體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間等關(guān)鍵影響因素，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探討微波輔助PEG-200提取金銀花葉中綠原酸的優(yōu)化工藝，對(duì)科學(xué)利用金銀花資源、促進(jìn)大別山地區(qū)金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的應(yīng)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花葉：采于湖北楚天舒藥業(yè)有限公司金銀花基地，陰干，粉碎備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），批號(hào)20120117：上海源葉生物科技有限公司；PEG-200（分析純）：上海山浦化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian Cary 100 Scan型紫外可見分光光度計(jì)：美國Varian公司；MM721NH1-PW型微波爐：廣東美的微波電器制造有限公司；Ax-205 METTLER TOLEDO型電子天平：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋：北京西城區(qū)醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠原酸的提取分離

微波輔助PEG-200提取金銀花葉中綠原酸提取液，通過大孔樹脂吸附，乙醇溶液洗脫，濃縮干燥，可分離制得綠原酸提取物。

1.3.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及提取率測定

精確稱取10.8 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200定容，搖勻即可得質(zhì)量濃度為108 μg/mL的綠原酸參照液。取2 mL參照液于10 mL容量瓶，用體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200定容至刻度，搖勻，以體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200為空白，在波長200～800 nm范圍掃描，確定檢測波長為327 nm。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：吸取綠原酸參照液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL分別置于6個(gè)10 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200定容，搖勻，以體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200為空白，在波長327 nm處測定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以綠原酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.056 4C+0.004 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，綠原酸在10.8～54.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

綠原酸提取率計(jì)算公式：

式中：Y為綠原酸提取率，%；V為綠原酸提取液體積，mL；m為金銀花葉的質(zhì)量，g；A為吸光度值；N為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取5份陰干、粉碎后的金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按照一定的料液比加入不同體積分?jǐn)?shù)的PEG-200，在不同的微波功率條件下處理不同時(shí)間，然后在一定溫度條件下回流一定時(shí)間提取金銀花葉中綠原酸。通過單因素試驗(yàn)分別考察微波功率、微波時(shí)間、PEG-200體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間等因素對(duì)金銀花葉中綠原酸提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（X1）、PEG-200體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3）3個(gè)對(duì)金銀花葉中綠原酸提取率影響較為顯著的因素，以綠原酸提取率（Y）為響應(yīng)值，利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面分析因素和水平如表1所示。

表1 綠原酸提取響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Variables and levels of response surface design for chlorogenic acid extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200，在70 W、210 W、350 W、490 W、630W功率條件下，微波處理60 s，然后80 ℃回流15 min提取金銀花葉中綠原酸，考察微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響。結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波功率對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of chlorogenic acid

由圖1可知，微波功率為70～350 W時(shí)，隨著微波功率的增加，綠原酸提取率增大；在微波功率達(dá)到350 W時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到峰值，為4.93%；繼續(xù)增大微波功率（＞350 W），綠原酸提取率則急劇降低。這是因?yàn)榉肿舆\(yùn)動(dòng)速度隨著微波功率增加而加快，綠原酸的提取率增加；但微波功率太高，所產(chǎn)生的高溫不僅導(dǎo)致綠原酸分解，還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固，綠原酸難以溶出細(xì)胞壁[15]。因此，選擇微波功率350 W為宜。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按料液比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200，在350 W功率下，微波處理50 s、60 s、70 s、80 s、90 s，然后80 ℃回流15 min提取金銀花葉中綠原酸，考察微波時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。結(jié)果如圖2所示。

圖2 微波時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on the extraction rate of chlorogenic acid

由圖2可知，在試驗(yàn)條件內(nèi)，綠原酸提取率呈波浪形變化，當(dāng)微波時(shí)間為70 s時(shí)，金銀花葉中綠原酸的提取率最高，為5.43%。微波輻射一定時(shí)間內(nèi)對(duì)金銀花葉細(xì)胞破碎作用較大，使細(xì)胞內(nèi)的有效成分快速溶出[15-16]，綠原酸提取率達(dá)到最高，但超過70 s后，微波產(chǎn)生的強(qiáng)熱效應(yīng)導(dǎo)致綠原酸結(jié)構(gòu)破壞，提取率降低。因此，選擇微波時(shí)間70 s為宜。

2.1.3 PEG-200體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按料液比1∶20（g∶mL）分別加入體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%、50%的PEG-200，在350 W功率下，微波處理70 s，80 ℃回流15 min提取金銀花葉中綠原酸，考察PEG-200體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，PEG-200體積分?jǐn)?shù)為10%～30%時(shí)，隨著PEG-200體積分?jǐn)?shù)的增加，綠原酸提取率逐漸增加；在PEG-200體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到峰值，為5.37%，提取效果最好；PEG-200體積分?jǐn)?shù)＞30%以后，綠原酸提取率有所下降。原因可能是PEG能增加了綠原酸的溶解度，同時(shí)也改變了溶液的耗散因素和微波能量傳遞[14]，從而加快能量傳遞速度和提取效率，導(dǎo)致綠原酸提取率隨著PEG-200體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，但PEG-200體積分?jǐn)?shù)的增大會(huì)增加溶液的黏度，從而影響傳質(zhì)，綠原酸提取率降低。因此，選擇PEG-200體積分?jǐn)?shù)30%為宜。

圖3 PEG-200體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of PEG-200 concentration on the extraction rate of chlorogenic acid

2.1.4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，80 ℃回流15 min提取金銀花葉中綠原酸，考察料液比對(duì)綠原酸提取率的影響。結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of the solid liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

由圖4可知，隨料液比的增加，綠原酸提取率先不斷上升，后趨于平緩，當(dāng)料液比為1∶20（g∶mL）時(shí)綠原酸得提取達(dá)最高，為5.24%；料液比＞1∶20（g∶mL）后綠原酸提取率趨于穩(wěn)定?？紤]綠原酸提取后的去除提取溶劑的經(jīng)濟(jì)成本，因此，選擇料液比1∶20（g∶mL）為宜。

2.1.5 提取溫度對(duì)綠原酸提取的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按液料體積質(zhì)量比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃條件下回流15 min提取金銀花葉中綠原酸，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在70～85 ℃時(shí)，隨著提取溫度的增長，綠原酸的提取率不斷上升，在85 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大值，為5.33%。提取溫度＞85 ℃，綠原酸提取率逐漸下降。隨著提取溫度的升高，綠原酸提取率增加，但提取溫度太高會(huì)導(dǎo)致綠原酸分解。因此，選擇85 ℃回流的提取溫度為宜。

圖5 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

2.1.6 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響

稱取5份金銀花葉粉末5 g置于圓底燒瓶，按液料體積質(zhì)量比1∶20（g∶mL）加入體積分?jǐn)?shù)30%的PEG-200，在350 W功率下，微波70 s，在85 ℃分別回流5 min、15 min、25 min、35 min、45 min，提取金銀花葉中綠原酸，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the extraction rate of chlorogenic acid

由圖6可知，在5～25 min時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，綠原酸的提取率不斷上升，在25 min時(shí)綠原酸提取率達(dá)到最大值，為5.88%。提取時(shí)間＞25 min之后綠原酸提取率開始下降。這是由于在85 ℃溫度下，提取時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致綠原酸的分解所致。因此，提取時(shí)間以25 min為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定微波功率、時(shí)間及料液比分別為350 W、70 s和1∶20（g∶mL），采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取溫度（X1）、PEG-200體積分?jǐn)?shù)（X2）和提取時(shí)間（X3）為自變量，以綠原酸提取率（Y）為響應(yīng)值，對(duì)金銀花葉中綠原酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到綠原酸提取率（Y）對(duì)提取溫度（X1）、PEG-200體積分?jǐn)?shù)（X2）和提取時(shí)間（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型方程如下：

由表3方差分析可知，各因子F值反映了對(duì)響應(yīng)值的重要性，F(xiàn)值越大，則P值越小，該因素對(duì)響應(yīng)值作用越大。F（X2）=848.28＞F（X3）=9.17＞F（X1）=0.017，表明各因子對(duì)綠原酸提取率影響程度大小為：PEG-200體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞提取溫度。就顯著性而言，X2、X22對(duì)響應(yīng)值Y有極顯著影響（P＜0.000 1），X3、X1X2、和X32等因素對(duì)響應(yīng)值Y有顯著影響（P＜0.05）。因此，盡管提取溫度、提取時(shí)間、PEG-200體積分?jǐn)?shù)等3個(gè)因素的交互作用對(duì)綠原酸的綠的影響較小，但各因素與響應(yīng)值Y之間不存在簡單的線性關(guān)系，綠原酸提取率同時(shí)也受到二次項(xiàng)的影響。模型分析結(jié)果表明，模型的P＜0.000 1，表明模型極其顯著；失擬項(xiàng)P值為0.623 2＞0.05，即模型失擬項(xiàng)不顯著，表明模型對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度較好，試驗(yàn)誤差?。蛔儺愊禂?shù)較小，為0.57%，表明操作可信；模型信噪比值很高，為32.498，遠(yuǎn)＞4，表明模型可信度高，有意義，可用于預(yù)測，且預(yù)測擬合度0.961 8和校正擬合度0.988 7比較一致，說明該模型較為合適。相關(guān)系數(shù)R2=0.996 0表明回歸方程中99.60%的因變量變化可以由其自變量的變化進(jìn)行解釋，也就是說在該工藝中，未計(jì)入回歸方程的變量對(duì)金銀花葉中綠原酸的提取效果影響較小。因此，可用該模型代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)金銀花葉中綠原酸提取過程進(jìn)行分析和預(yù)測。

由多元擬合模型產(chǎn)生的響應(yīng)面及其等高線，結(jié)果見圖7。表示用于響應(yīng)面分析的提取溫度、提取時(shí)間、PEG-200體積分?jǐn)?shù)等3個(gè)因素中，某個(gè)因子為零水平時(shí)，另外兩個(gè)因子對(duì)綠原酸提取率的影響，直觀地反映各因子及其相互間的交互作用。由圖7可知，提取時(shí)間和PEG-200體積分?jǐn)?shù)間不存在交互作用，表現(xiàn)為等高線中心區(qū)域呈明顯圓形；提取時(shí)間和提取溫度間的交互作用明顯，表現(xiàn)為等高線中心區(qū)域呈明顯的橢圓形；提取溫度和PEG-200體積分?jǐn)?shù)間的交互作用不明顯，表現(xiàn)為等高線中心區(qū)域不構(gòu)成橢圓。此外，響應(yīng)面均為開口向下的凸面，提取溫度、提取時(shí)間、PEG-200體積分?jǐn)?shù)等3個(gè)因素與綠原酸提取率基本呈拋物線關(guān)系，說明在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)存在最佳值。多元回歸模型預(yù)測的最佳提取工藝條件為溫度81.53 ℃，PEG-200體積分?jǐn)?shù)41.50%，提取時(shí)間23.58 min，該條件下綠原酸提取率預(yù)測值為5.86%。

圖7 提取溫度、PEG-200體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間交互作用對(duì)綠原酸提取率的響應(yīng)面及等高線Fig.7 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between extraction temperature,PEG-200 concentration and extraction time on extraction rate of chlorogenic acid

2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

驗(yàn)證時(shí)考慮實(shí)際操作問題，將最佳條件修正為：微波功率350 W，微波時(shí)間70 s，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度82 ℃，PEG-200體積分?jǐn)?shù)40%，提取時(shí)間24 min。在修正后的最佳條件下，利用微波輔助PEG從金銀花葉中提取綠原酸，進(jìn)行了5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，綠原酸實(shí)測平均提取率為5.87%，相對(duì)誤差為0.17%，與理論預(yù)測值5.86%吻合度較高，說明響應(yīng)面優(yōu)化回歸模型對(duì)實(shí)際工藝操作具有一定的指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)金銀花葉中綠原酸提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了微波輔助PEG提取金銀花葉中綠原酸的最佳工藝為微波功率350 W，微波時(shí)間70 s，料液比1∶20（g∶mL），提取溫度82 ℃，PEG-200體積分?jǐn)?shù)40%，提取時(shí)間24 min。在最佳條件下綠原酸提取率為5.87%。該工藝簡單可行、快速有效、綠色環(huán)保，適合于提取金銀花葉中綠原酸工業(yè)化生產(chǎn)。

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