巴戟天炮制工藝的優(yōu)化及有效成分變化分析

王 鋒，孫君社，胡紹峰，張秀清*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

巴戟天（Morinda officinalis）為茜草科植物巴戟天的干燥根，味甘辛，性微溫，有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效[1]。巴戟天含有多糖類(lèi)、環(huán)烯醚萜苷類(lèi)和蒽醌類(lèi)等多種化學(xué)成分，其中豐富的多糖作為補(bǔ)腎壯陽(yáng)的主要有效成分，能夠?qū)θ祟?lèi)精子中的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）起到保護(hù)作用[2]，同時(shí)其還具有治療老年癡呆癥[3]、抗疲勞等生理作用[4]。水晶蘭苷作為巴戟天環(huán)烯醚萜類(lèi)物質(zhì)的一種重要成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]，能夠抑制軟骨細(xì)胞凋亡[6]，是巴戟天發(fā)揮祛風(fēng)濕作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。巴戟天中含有多種蒽醌類(lèi)化合物，研究表明，巴戟天中提取出的蒽醌對(duì)于糖尿病的治療具有幫助作用[7]。目前已經(jīng)從巴戟天中分離并鑒定的蒽醌類(lèi)成分共有34種，蒽醌類(lèi)物質(zhì)能夠增加成骨細(xì)胞抗骨質(zhì)疏松的能力[8]，并且具有抗菌、抗癌、抗病毒、凝血等生物活性，但是近幾年的研究表明蒽醌類(lèi)化合物在體內(nèi)蓄積會(huì)導(dǎo)致肝腎損傷[9]，而蒽醌類(lèi)化合物的藥效毒效雙向作用與其含量有較大的關(guān)系，因此研究巴戟天中的蒽醌含量具有重要意義。

巴戟天入藥前需要經(jīng)過(guò)炮制，其炮制的方法主要有鹽制、蒸制、甘草水制、煮制，目前巴戟天的炮制研究主要集中在鹽制上。巴戟天的主要功效之一是補(bǔ)腎壯陽(yáng)，而鹽性寒，有補(bǔ)腎、軟堅(jiān)、涼血解毒的作用，用鹽制巴戟天可引藥入腎，達(dá)到助陽(yáng)補(bǔ)腎之功[10]。鹽制巴戟天的方法主要是用食鹽水拌勻，浸漬一定時(shí)間，置于適宜蒸制容器內(nèi)加熱蒸透，趁熱抽去木心，切片，干燥。

本試驗(yàn)選擇巴戟天中的多糖含量作為指標(biāo)，對(duì)巴戟天鹽制方法中的3個(gè)主要影響因素：氯化鈉的質(zhì)量濃度、浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以確定鹽制過(guò)程的最佳工藝。并通過(guò)測(cè)定巴戟天炮制前后其主要活性成分水晶蘭苷的含量變化情況，為巴戟天炮制品的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)，通過(guò)總蒽醌含量的變化情況為巴戟天的炮制機(jī)制解析提供一定試驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴戟天：采自廣東省肇慶地區(qū)；水晶蘭苷（色譜純）：上海源葉生物技術(shù)有限公司；大黃素（純度≥99%）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；葡萄糖（純度≥99%）：北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇、苯酚、濃硫酸等（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1200系列高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Aglient公司；酸度計(jì)PB-10：德國(guó)Sartourius公司；TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器廠；TG 16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 巴戟天炮制工藝的優(yōu)化

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚硫酸法進(jìn)行測(cè)定[19]，標(biāo)曲繪制方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水定容至100mL，取出1mL該溶液定容至100mL，配成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分別置于比色管中，各加蒸餾水使體積為2.0 mL。再各加入6%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL。靜置10 min后，搖勻，待反應(yīng)液完全冷卻后，于波長(zhǎng)490 nm條件下測(cè)定其吸光度值，以水作空白試驗(yàn)。以吸光度值為橫坐標(biāo)，多糖含量為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）樣品中多糖的測(cè)定

稱(chēng)取已過(guò)60目篩的巴戟天粉末0.200 g，按照料液比為1∶40（g∶mL）加入5%的NaOH溶液，超聲提?。?0 W）30 min，4 000 r/min離心15 min，取一定體積的上清液，調(diào)節(jié)pH值至中性（6.8～7.2）；再加入4倍體積的無(wú)水乙醇進(jìn)行醇沉，置于4 ℃冰箱中。靜置12 h后離心（4 000 r/min、10 min），棄去上清液，用水復(fù)溶醇沉多糖后定容至50 mL。吸取樣品液1.2 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的方法操作。以空白試劑作參比，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)量吸光度值。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算多糖的含量。多糖含量按下公式計(jì)算：

式中：w為多糖含量，mg/g；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測(cè)定液的葡萄糖含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質(zhì)量，g；V2為比色時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積，mL。

（3）巴戟天炮制的單因素試驗(yàn)

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)：稱(chēng)取5 g的巴戟天樣品5份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻后浸泡50 min取出，蒸制相同時(shí)間后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過(guò)60目篩，測(cè)定多糖含量。

浸漬時(shí)間：稱(chēng)取5 g的巴戟天樣品6份，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻，分別浸泡10 min、30 min、50 min、70 min、90 min、110 min后取出樣品，蒸制相同時(shí)間后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過(guò)60目篩，測(cè)定多糖含量。

蒸制時(shí)間：稱(chēng)取5 g的巴戟天樣品6份，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液50 mL，攪勻，浸泡50 min后取出樣品，依次蒸制15 min、35 min、55 min、75 min、95 min、115 min后，趁熱抽心，至70 ℃的烘箱烘干，粉碎樣品，過(guò)60目篩，測(cè)定多糖含量。

（4）巴戟天炮制的正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間這3個(gè)因素分別選擇3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇出巴戟天炮制過(guò)程中的最佳工藝，對(duì)最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

表1 巴戟天炮制工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for Morinda officinalis processing technology optimization

1.3.2 巴戟天炮制前后水晶蘭苷的測(cè)定

（1）色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液-甲醇（10%～90%）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：231 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

（2）水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用甲醇定容至100 mL，即得質(zhì)量濃度為50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以該標(biāo)準(zhǔn)溶液為母液，分別配制質(zhì)量濃度為25.000 μg/mL、12.500 μg/mL、6.250 μg/mL、3.125 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以各質(zhì)量濃度的水晶蘭苷標(biāo)準(zhǔn)液色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的水晶蘭苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作水晶蘭苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）樣品中水晶蘭苷含量的測(cè)定

稱(chēng)取已過(guò)60目篩的樣品粉末0.500 g至三角瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲處理（500 W、53 kHz）30 min，抽濾，向不溶物中再加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇超聲提取30 min，抽濾，合并濾液于圓底燒瓶中。將濾液旋蒸至干，向圓底燒瓶中加入體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇，在超聲水浴中重新溶解分析物，溶解后用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇定容至50 mL，搖勻，溶液過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾器，收集濾液上HPLC儀測(cè)定。樣品中水晶蘭苷含量按下公式計(jì)算：

式中：w為水晶蘭苷含量，mg/g；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測(cè)定液水晶蘭苷的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品定容體積，mL；m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.3 巴戟天炮制前后總蒽醌含量的測(cè)定

（1）大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱(chēng)取大黃素標(biāo)品10 mg，用甲醇定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

最大吸收波長(zhǎng)的選擇：取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，沸水浴揮干甲醇，加5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，在190～700 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示其最大吸收峰在310 nm，因此檢測(cè)波長(zhǎng)選擇310 nm。

反應(yīng)時(shí)間的選擇：取標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，沸水浴揮干甲醇，加5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，分別反應(yīng)0、15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min于波長(zhǎng)310 nm處測(cè)定其吸光度值，結(jié)果顯示，在30 min后，其吸光度值達(dá)到了穩(wěn)定，因此選擇反應(yīng)時(shí)間為30 min。

大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，水浴揮干甲醇，加入5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液至10 mL，放置30 min后，于波長(zhǎng)310 nm處測(cè)定吸光度值。

（2）總蒽醌的提取及測(cè)定方法

稱(chēng)取已過(guò)60目篩的樣品粉末2.000 g，加入2.5 mol/L的硫酸30 mL，在沸水浴上回流提取2 h，取出后冷卻至室溫。向溶液中加入20 mL氯仿，置于62 ℃的水浴上回流提取30 min。將提取溶液進(jìn)行萃取，收集下層的氯仿溶液，向上層液體中繼續(xù)加入20 mL氯仿，進(jìn)行水浴回流提取，重復(fù)以上步驟，直至氯仿層為無(wú)色。將得到的氯仿層溶液進(jìn)行混合，棄去上層液體。向氯仿溶液中加入20 mL蒸餾水進(jìn)行洗滌，洗滌數(shù)次，直至水層無(wú)色，棄去水層。向氯仿溶液中加入20 mL的5%氫氧化鈉-2%氨水的混合堿溶液，收集混合堿液，向氯仿液中再次加入混合堿液，重復(fù)操作，直至堿液層為無(wú)色，收集混合堿液層。向混合堿液中加入氯仿20 mL，混勻后靜置萃取，棄去氯仿層，收集混合溶液層，重復(fù)加入氯仿萃取，直至氯仿層為無(wú)色。將收集到的堿液層用5%氫氧化鈉-2%氨水混合堿溶液定容至250 mL，取該溶液于波長(zhǎng)310 nm處測(cè)定吸光度值。樣品中總蒽醌含量按下公式計(jì)算：

式中：w為總蒽醌含量，mg/g；m1為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的樣品測(cè)定液大黃素的含量，mg；V1為樣品定容體積，mL；m2為樣品的質(zhì)量，g；V2為比色時(shí)所移取樣品測(cè)定液的體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)；水晶蘭苷質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)；大黃素含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)；繪制葡萄糖、水晶蘭苷、大黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖(A)、水晶蘭苷(B)及大黃素(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose (A),monotropein (B) and emodin (C)

2.2 巴戟天炮制工藝的單因素試驗(yàn)

選取氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間以及蒸制時(shí)間3個(gè)影響巴戟天炮制效果的因素做單因素試驗(yàn)，以確定相關(guān)因素及各因素的合適范圍。如圖2a所示，在2%～4%的NaCl含量處理范圍內(nèi)，4%的NaCl含量處理所得巴戟天的多糖含量最高達(dá)到17.217 mg/g，顯著高于其他NaCl含量處理組。如圖2b所示，在10～120 min的考察范圍內(nèi)，50 min的浸漬處理最好，其多糖含量最高達(dá)到17.148 mg/g，而時(shí)間不足或者過(guò)長(zhǎng)都會(huì)使得多糖含量降低。如圖2c所示，在15～115 min的考察范圍內(nèi)，15～95 min，多糖含量逐漸升高，在蒸制95 min時(shí)多糖的含量最高為17.738 mg/g，＞95 min后多糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。單因素試驗(yàn)的結(jié)果為：選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉，浸漬50 min，蒸制95 min，多糖含量最高。

圖2 氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(a)、浸漬時(shí)間(b)及蒸制時(shí)間(c)對(duì)多糖含量的影響Fig.2 Effects of NaCl concentration (a),soaking time (b) and steaming time (c) on polysaccharide content

2.3 炮制工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)

由于巴戟天炮制樣品中的多糖含量實(shí)際上是受到氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、浸漬時(shí)間、蒸制時(shí)間3個(gè)因素交叉影響，為了全面考察這3個(gè)因素的影響，設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，以確定最佳炮制工藝的參數(shù)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，各因素分別選擇3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果及分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 巴戟天炮制工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for Morinda officinalis processing technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

由表2可知，各因素對(duì)鹽巴戟天多糖含量影響的大小關(guān)系為：A＞C＞B，即氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞蒸制時(shí)間＞浸漬時(shí)間。試驗(yàn)確定的最佳組合為A2B2C2，即用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液浸漬50 min，加熱蒸制95 min，趁熱除去木心。在此最佳條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖含量平均值為17.443 mg/g，高于其他組合，且有較好的重復(fù)性，說(shuō)明該工藝可確定為巴戟天炮制的最優(yōu)工藝。

由表3可知，3個(gè)因素中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間對(duì)結(jié)果影響均不顯著。

由于巴戟天發(fā)揮其主要藥理作用的物質(zhì)是多糖，因此選用多糖作為巴戟天工藝優(yōu)化的評(píng)價(jià)指標(biāo)要比一些研究者選用水晶蘭苷以及蒽醌含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[11-12]具有更高的可靠性。該工藝與其他研究者得到的巴戟天炮制工藝[13]相比，具有節(jié)省時(shí)間、成本、能源的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

2.4 巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌含量的測(cè)定

巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌的含量結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，按照最優(yōu)的炮制工藝處理巴戟天樣品后，其中的水晶蘭苷和總蒽醌的含量較未處理之前依次降低了7.18%和10.54%。

炮制后水晶蘭苷的含量有所降低，其原因可能是由于水晶蘭苷作為環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類(lèi)化合物，其分子結(jié)構(gòu)中含羧基和較多羥基等極性基團(tuán)，在炮制過(guò)程中加入氯化鈉使得部分水晶蘭苷溶解到氯化鈉溶液中，導(dǎo)致了水晶蘭苷的丟失，使含量降低[14]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與景海漪等[15]的研究結(jié)論一致，因此對(duì)于巴戟天的生品和炮制品在質(zhì)量控制時(shí)水晶蘭苷含量應(yīng)設(shè)定不同的標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)中巴戟天經(jīng)過(guò)炮制后總蒽醌的含量降低，其原因可能是蒽醌在蒸制的濕熱條件下不穩(wěn)定、發(fā)生降解所引起的[16]。蒽醌類(lèi)物質(zhì)雖然具有多種生物活性，但許多含蒽醌類(lèi)物質(zhì)的藥材在入藥之前需要經(jīng)過(guò)炮制，其炮制機(jī)理與蒽醌類(lèi)化合物的含量有重要關(guān)系。研究者通過(guò)研究何首烏提取物對(duì)人體正常干細(xì)胞的作用表明，其中產(chǎn)生影響作用的物質(zhì)主要為大黃素，大黃素對(duì)于正常干細(xì)胞的作用具有雙重性，低劑量時(shí)能夠促進(jìn)干細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高劑量則會(huì)抑制干細(xì)胞的生長(zhǎng)[17]。此外，蒽醌類(lèi)物質(zhì)的藥效毒效雙向作用還與蒽醌類(lèi)物質(zhì)存在的狀態(tài)有關(guān)，蒽醌類(lèi)物質(zhì)按照存在狀態(tài)可以分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)，結(jié)合態(tài)蒽醌在腸道代謝過(guò)程中形成蒽酮這一類(lèi)典型的毒物，從而對(duì)肝腎造成損害[18]。部分研究結(jié)果表明，未炮制的巴戟天中結(jié)合態(tài)蒽醌含量約占總蒽醌含量的80%，而炮制后其所占百分比降至50%[19]，因此巴戟天入藥前經(jīng)過(guò)炮制的機(jī)理可能是降低結(jié)合蒽醌的含量。

表4 巴戟天炮制前后水晶蘭苷和總蒽醌含量Table 4 The contents of monotropein and total anthraquinone in processed and crude pieces

3 結(jié)論

巴戟天在臨床使用中需要進(jìn)行炮制，消除或減少藥物的毒性、烈性和副作用，增強(qiáng)藥物的療效。鹽制作為一種普遍使用的方法，對(duì)其炮制工藝的研究具有很大的價(jià)值。本試驗(yàn)確定巴戟天最佳的炮制工藝為：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氯化鈉溶液浸漬50 min，加熱蒸制95 min，趁熱除去木心。并得到氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)是極顯著影響因素，而浸漬時(shí)間和蒸制時(shí)間為不顯著性影響因素。對(duì)炮制前后的水晶蘭苷和總蒽醌含量進(jìn)行測(cè)定，炮制后水晶蘭苷降低了7.18%，總蒽醌含量降低了10.54%。雖然該炮制工藝會(huì)造成巴戟天的有效成分水晶蘭苷含量的降低，但僅降低了總含量的7%，并未造成較大的損失；本次試驗(yàn)證明了總蒽醌含量在炮制過(guò)程中會(huì)降低，說(shuō)明巴戟天炮制的機(jī)理可能是降低對(duì)肝腎有較大損傷的結(jié)合蒽醌的含量，因此在后期的研究中應(yīng)對(duì)游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量分別進(jìn)行測(cè)定，為巴戟天炮制機(jī)理提供更有利的證據(jù)。

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