酸棗果肉多糖的提取優(yōu)化及抗氧化活性研究

張 璐

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006）

酸棗（Ziziphus jujubaMill.）屬鼠李科棗屬植物，主要多分布于中國(guó)北方，其種仁入藥[1]。酸棗果肉營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、維生素及多種礦質(zhì)元素，具有較高的生物活性和食療價(jià)值，已經(jīng)開發(fā)的產(chǎn)品有酸棗汁、酸棗酒、酸棗果醬、酸棗糕等。有研究報(bào)道酸棗果肉有增強(qiáng)小鼠的肌力、記憶力、食欲等作用[2-4]。近年來對(duì)多糖的保健作用引起人們的廣泛的關(guān)注，發(fā)現(xiàn)很多植物多糖、食用菌多糖均具有多種生物活性[5-6]，但對(duì)酸棗果肉多糖的提取工藝及抗氧化作用報(bào)道的較少。因此，本研究以酸棗果肉為研究對(duì)象，采用熱水浸提法提取酸棗果肉多糖，正交試驗(yàn)法考察料液比、提取溫度和提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)多糖提取率的影響。通過體外抗氧化評(píng)價(jià)體系研究酸棗果肉多糖對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基清除活性，為酸棗的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酸棗：采自山西省運(yùn)城市降縣山區(qū)。

1.1.2 試劑

石油醚（分析純）、乙醇（分析純）：天津歐博凱化工有限公司；氯仿（分析純）：上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司；正丁醇（分析純）：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，2,2-二苯代苦味肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrzyl，DPPH）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCS-290電子天平：瑞士PRECISA；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器設(shè)備有限公司；UV757CRT紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酸棗果肉預(yù)處理[7]

取新鮮酸棗去除果核，果肉在105 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩，按料液比1∶10（g∶mL），用沸程60～90 ℃的石油醚80 ℃回流脫脂2次，每次2 h，收集酸棗果肉濾渣，干燥，備用。

1.3.2 提取方法

取預(yù)處理過的酸棗果肉渣，按一定料液比設(shè)定不同的溫度浸提、過濾、合并濾液、濃縮，加入4倍體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4 ℃醇沉多糖24 h，離心，收集多糖沉淀物。再將多糖溶解于適量的蒸餾水中，按Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1，V/V）與多糖溶液1∶4（V/V）混勻，采用Sevage法去除蛋白3次，分液漏斗去除有機(jī)層，濃縮多糖水溶液醇沉多糖，真空干燥，得到酸棗果肉多糖[8]。

1.3.3 多糖含量測(cè)定

采用蒽酮-硫酸法對(duì)酸棗果肉多糖進(jìn)行測(cè)定[9]。多糖提取率計(jì)算公式如下：

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取5.0 g酸棗果肉渣，固定提取溫度90 ℃，提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)2次，在料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL），提取溫度60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃，提取時(shí)間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h，提取次數(shù)1次、2次、3次條件下，考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)酸棗果肉多糖提取率的影響。

1.3.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)綜合考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，因素與水平見表1，每組做3次重復(fù)試驗(yàn)。在選取的最佳條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算酸棗果肉多糖的提取率。

表1 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

1.3.6 酸棗果肉多糖體外抗氧化活性測(cè)定

（1）清除羥基自由基能力測(cè)定

采用H2O2/Fe2+氧化法測(cè)定酸棗果肉多糖清除羥基自由基的能力[10-12]。準(zhǔn)確量取2 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，混勻，6 mmol/L的H2O2溶液1.0 mL，混勻，靜置10 min，加入6 mmol/L 的水楊酸0.5 mL，混勻，靜置30 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度值（Ai）。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，空白組以雙蒸水代替多糖溶液，測(cè)定吸光度值（A0）；對(duì)照組以蒸餾水代替水楊酸的多糖溶液測(cè)定吸光度值（Ac）。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

（2）清除超氧陰離子自由基

采用鄰苯三酚自氧化法[13]，測(cè)定酸棗果肉多糖對(duì)（O2-·）的清除能力[14-15]。分別精確量取1 mL質(zhì)量濃度為10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，各加入4.5 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和3.2 mL去離子水，25℃水浴中保溫30 min，再加入25℃水浴中預(yù)熱的6 mmol/L鄰苯三酚（用10 mmol/L鹽酸配制）0.3 mL，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)320 nm處每30 s測(cè)定溶液的吸光度值（ΔAi）。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)照組用等體積的去離子水代替樣品溶液，測(cè)定吸光度值（ΔA0），每個(gè)樣品測(cè)3個(gè)重復(fù)，取平均值。超氧陰離子清除率計(jì)算公式如下：

（3）清除2,2-二苯代苦味肼（DPPH）自由基[16-18]

取1 mL濃度為1.0×10-4mol/L 的DPPH溶液，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇定容至10 mL，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度值（A0）。分別精確量取1mL質(zhì)量濃度為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL的酸棗果肉多糖水溶液，各加入1 mL 濃度為1.0×10-4mol/L 的DPPH 溶液，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶劑定容至10 mL，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值（Ai）；再分別量取0.5mL質(zhì)量濃度為10μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL酸棗果肉多糖水溶液，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶劑定容至10 mL，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)517 nm 處測(cè)定吸光度值（Ac）。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1 可知，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=0.007 4x+0.038 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

圖2 料液比對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，隨著料液比的增大，酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，料液比為1∶20（g∶mL）以后提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定1∶15（g∶mL）、1∶20（g∶mL）和1∶25（g∶mL）為正交試驗(yàn)中料液比的3個(gè)水平。

2.2.2 提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，提取溫度提高到80 ℃以后酸棗果肉多糖的提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定80 ℃、90 ℃和100 ℃為正交試驗(yàn)中提取溫度的3個(gè)水平。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)酸棗果肉多糖的提取率逐漸增大，提取時(shí)間延長(zhǎng)到2.0 h以后酸棗果肉多糖的提取率逐漸穩(wěn)定，因此選定1.5 h、2.0 h和2.5 h為正交試驗(yàn)中提取時(shí)間的3個(gè)水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

圖5 提取次數(shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharides

由圖5可知，第1次提取的酸棗果肉多糖得率最高，隨著提取次數(shù)的增多酸棗果肉多糖得率有所提高，但增幅不大，考慮提取成本費(fèi)用，故提取2次為宜。

2.3 酸棗果肉提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多糖提取率為考察指標(biāo)，采用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)綜合考察料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）的影響，結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for the extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響酸棗果肉多糖提取得率的因素主次關(guān)系為：提取溫度對(duì)酸棗果肉多糖提取率影響最大，其次為料液比，提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響相對(duì)較小，其最佳提取條件為A2B3C2，即料液比1∶20（g∶mL），提取溫度100 ℃，提取時(shí)間2.0 h，提取2次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)（n=3），多糖提取率為（0.951±0.028）%。

由表3方差分析可知，提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），料液比和提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

2.4 體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 酸棗果肉多糖清除羥基自由基的結(jié)果

圖6 酸棗果肉多糖對(duì)羥基自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of polysaccharides on hydroxyl radical

羥基自由基是活性氧中活性最強(qiáng)的一種自由基，其可以與細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)化合物反應(yīng)，通過破壞脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝來?yè)p傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致機(jī)體病變。因此對(duì)羥基自由基清除率是抗氧化作用的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖6可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增大至1.0 mg/mL，對(duì)羥基自由基的清除能力也在增加。酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.0mg/mL時(shí)，清除率達(dá)最大值48.35%。多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增大至0.6 mg/mL，對(duì)·OH的清除率顯著增加；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度＞0.6 mg/mL，隨質(zhì)量濃度的增加，清除率增加減緩，但清除率均小于VC。因此，酸棗果肉多糖對(duì)羥自由基具有一定的清除效果。

2.4.2 酸棗果肉多糖清除超氧陰離子自由基結(jié)果

超氧陰離子自由基具有一定的毒性，還可以通過反應(yīng)生成其他氧自由基，從而損傷機(jī)體引起疾病。由圖7可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從10 μg/mL增大至80 μg/mL，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度80 μg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基清除率達(dá)最大值43.77%，但清除率均小于VC。酸棗果肉多糖對(duì)超氧陰離子自由基也具有一定的清除效果。

圖7 酸棗果肉多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.7 Scavenging rate of wild jujube polysaccharides on superoxide anion radical

2.4.3 酸棗果肉多糖清除DPPH自由基的結(jié)果

圖8 酸棗果肉多糖對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of wild jujube polysaccharides on DPPH radical

DPPH 是一種穩(wěn)定的氮中心自由基，可以捕獲或清除其他的自由基，而被廣泛用于測(cè)定生試樣的抗氧化能力。由圖8 可知，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度從10 μg/mL增大至80 μg/mL，對(duì)DPPH自由基的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度80 μg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)最大值52.76%，但清除率均小于VC。酸棗果肉多糖對(duì)超氧陰離子自由基也具有一定的清除效果。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化出酸棗果肉多糖的最佳提取條件為：料液比1∶20（g∶mL），提取溫度100 ℃下，提取時(shí)間2.0 h，提取2次。在此條件下多糖提取率為（0.951±0.028）%。對(duì)酸棗果肉多糖的抗氧化活性的研究表明，酸棗果肉多糖對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用，酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率為48.35%；在多糖質(zhì)量濃度為80 μg/mL時(shí)，對(duì)O2-·的清除率為43.77%，對(duì)DPPH自由基的清除率為52.76%。酸棗果肉多糖具有一定的開發(fā)利用價(jià)值，本研究結(jié)果為酸棗的多功能產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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