發(fā)酵劑用量對(duì)硬質(zhì)蒙古干酪風(fēng)味變化的影響

高 鑫，張 亮，李 博

（1.上海工會(huì)管理職業(yè)學(xué)院 健康安全系，上海 201415；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200240）

干酪是乳經(jīng)適當(dāng)?shù)娜樗岚l(fā)酵后凝乳并分離出乳清后的乳制品，其組織結(jié)構(gòu)好，營養(yǎng)價(jià)值高[1]。近年來，干酪產(chǎn)量一直保持著上升趨勢(shì)，2011年世界干酪產(chǎn)量已經(jīng)超過2 000萬t。受居民飲食習(xí)慣、對(duì)奶酪的認(rèn)知情況和消費(fèi)能力等影響，我國干酪的發(fā)展正處于市場(chǎng)培育階段[2-3]。有學(xué)者建議，中國應(yīng)借鑒日本和韓國的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)傳統(tǒng)干酪進(jìn)行配方和工藝優(yōu)化，制造適合中國人的干酪食品，如蒙古族干酪，藏族、維吾爾族的奶疙瘩，白族的乳扇等[4]。長期以來，這些傳統(tǒng)干酪基本上是家庭作坊式生產(chǎn)，沒有形成規(guī)模以及培育穩(wěn)定的消費(fèi)群體，對(duì)我國干酪市場(chǎng)發(fā)展的影響有限。因此，如何加大干酪產(chǎn)品的生產(chǎn)和市場(chǎng)引導(dǎo)的力度，引導(dǎo)消費(fèi)，研制適合于國人消費(fèi)的干酪加工技術(shù)迫在眉睫[5]。本試驗(yàn)探討了一種硬質(zhì)蒙古干酪制作過程中發(fā)酵劑的使用量對(duì)干酪風(fēng)味變化和微生物多樣性的影響，為進(jìn)一步研制和開發(fā)該干酪提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳、乳清粉、奶油：光明乳業(yè)股份有限公司；干酪發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）：北京川秀國際：丹麥丹尼斯克（中國）有限公司；美國材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)D2887-01 N-烷烴標(biāo)準(zhǔn)樣品：美國Restek公司。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（plate count agar，PCA）：蛋白胨貿(mào)易有限公司；凝乳酶10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，MgSO40.2 g，MnSO40.05 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

大腸桿菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，3號(hào)膽鹽1.5 g，乳糖5 g，K2HPO44 g，KH2PO41.5 g，NaCl 5 g。

金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 100 g，K2HPO42.5 g，葡萄糖2.5 g，丙酮酸鈉10 g。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏粉8 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，K2HPO42 g，檸檬酸三氨2 g，乙酸鈉·3H2O 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，吐溫-80 1 g。

改良MC培養(yǎng)基：大豆蛋白胨5 g，牛肉膏粉3 g，酵母膏粉3 g，葡萄糖20 g，乳糖20 g，CaCO310 g，瓊脂15 g，中性紅0.05 g。

1.2 儀器與設(shè)備

VARIOKLAV高壓蒸汽滅菌鍋：美國賽默飛世爾科技公司；FE20pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多公司；HPH2000/4-DH5高速剪切均質(zhì)機(jī)：美國IKA公司；MCO-15AC生化培養(yǎng)箱：日本三洋機(jī)電有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS固相萃取探針：美國Supelco公司；DB-5MS色譜柱：百靈威科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硬質(zhì)蒙古干酪的制作

原料乳標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行巴氏殺菌處理，將殺菌后的原料乳溫度降至30 ℃，采用直投式加入發(fā)酵劑凍干粉，加入量為0.5 g/L、1.0 g/L和1.5 g/L原料乳。發(fā)酵劑通過發(fā)酵產(chǎn)酸，當(dāng)原料乳的pH值降低0.1～0.2時(shí)，加入凝乳酶（3 g/100 L原料乳，1%的滅菌食鹽水溶解）凝乳40 min，用干酪切刀切割凝塊大小為1 cm左右，采用自然排乳清法將乳清排出，排除后在凝乳粒中加鹽，加鹽量為30 g/kg凝塊。加鹽后的干酪進(jìn)行裝模（100 mm×100 mm×50 mm），然后放在壓模機(jī)上以10 g/cm2壓力壓20 min，50 g/cm2壓2 h后翻轉(zhuǎn)，100 g/cm2壓16 h。然后切成大小10 cm×5 cm×5 cm的小塊，放在自封袋中，密封后在8 ℃、相對(duì)濕度（relative humidity，RH）85%條件下成熟，此時(shí)為0 d。根據(jù)發(fā)酵劑使用量的不同，記為硬質(zhì)蒙古干酪A（0.5 g/L）、干酪B（1.0 g/L）和干酪C（1.5 g/L）。每隔60 d（含0 d）取樣一次。

1.3.2 成熟過程中風(fēng)味變化

根據(jù)李博等[6]對(duì)干酪風(fēng)味研究的方法，準(zhǔn)確稱取5.00 g干酪樣品放在20mL頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)，加入5 mL 25%NaH2PO4，蓋好蓋子，在50 ℃的超聲波水浴中平衡30 min，使干酪中的風(fēng)味化合物充分進(jìn)入頂空進(jìn)樣瓶的頂空內(nèi)。將已經(jīng)老化好的固相萃取頭插入到頂空進(jìn)樣瓶的頂空內(nèi)進(jìn)行萃取，吸附30 min后，拔出萃取頭，將吸附了分析組分的萃取頭插入到氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）進(jìn)樣器內(nèi)在250 ℃條件下進(jìn)行解吸，解析后用GC-MS儀器進(jìn)行分析。

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）的條件：

設(shè)備：CTC三位一體自動(dòng)進(jìn)樣器；萃取頭：50/30 μm Divinylbenzene/Carboxen/PDMS；溫度：120 ℃；時(shí)間：加熱25min，萃取15min；振蕩速度：加熱250 r/min，萃取250 r/min；解吸時(shí)間：3 min。

色譜分析條件：

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫：40 ℃保持10 min，以5 ℃/min升至240 ℃，以20 ℃/min升至280 ℃，保持8 min；進(jìn)樣溫度：250 ℃；控制模式：恒流，1.0 mL/min；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：50 ℃；電離方式：電子電離（electron ionization，EI），70 eV；掃描方式：全掃描，20～400 m/z，溶劑延遲3.5 min。

得到完整、數(shù)據(jù)全面的總離子流色譜圖后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過工作站數(shù)據(jù)分析軟件和NIST 2011質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照，通過面積歸一化得到每種化合物的峰面積。

1.3.3 成熟過程中微生物多樣性變化（培養(yǎng)基方法）

依照GB 4789.18—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)—乳與乳制品檢驗(yàn)》進(jìn)行[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪風(fēng)味變化

利用SPME-GC-MS分析方法對(duì)成熟過程中的干酪A、B、C進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味化合物的檢測(cè)，結(jié)果見表1。

由表1可以看出，干酪A在0 d時(shí)，共檢測(cè)出28種化合物，其中酯類化合物10種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物3種。在含量方面，醇類化合物占到70.76%，酯類化合物次之，占到23.48%。隨著干酪的成熟，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類逐漸增多，到第180天時(shí)，共檢出31種化合物，其中酯類化合物由10種增加至15種，含量增加至44.79%。其中，癸酸甲酯由0 d時(shí)的19.94%增加至49.36%（120 d），后降低至38.76%（180 d）。而醇類化合物在180 d時(shí)下降至42.05%，大部分用于酯類化合物的產(chǎn)生。因此，在干酪A的成熟過程的揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，醇類和酯類一直是主要的風(fēng)味物質(zhì)。檢測(cè)中所得酯類物質(zhì)中癸酸甲酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯含量較高，形成了果味特征，給干酪以淡淡的果味氣息。醇類物質(zhì)中主要是乙醇和異戊醇，表現(xiàn)出溫和的花香味。值得注意的是，干酪中很多代謝途徑都與乙醇的合成有關(guān)，如乳糖代謝途徑通過磷酸戊糖途徑產(chǎn)生乙醇等，在干酪成熟后期乙醇參與乙酯類化合物的形成，造成其含量大幅下降，由0 d時(shí)的55.66%下降至180 d時(shí)的15.80%。酸類物質(zhì)以乙酸、辛酸和癸酸為主，主要貢獻(xiàn)了干酪風(fēng)味中的醋味、辛辣味、酸敗味以及部分奶香味。醛、酮類物質(zhì)分離檢測(cè)出的很少，這是由于它們?cè)诟衫页墒爝^程中屬于過渡態(tài)化合物，不會(huì)在干酪中進(jìn)行顯著積累，可以迅速被還原生成伯醇或者被氧化生成相應(yīng)的酸，所以在干酪成熟過程中分離得到的醛、酮類物質(zhì)很少[8]。

干酪B在0 d時(shí)，共檢測(cè)出28種化合物，其中酯類化合物11種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物2種。在含量方面，醇類化合物占72.76%，酯類化合物次之，占19.52%。隨著干酪的成熟，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的種類逐漸增多，到第180天時(shí)，共檢出33種化合物，其中酯類化合物由12種增加至15種，含量增加至47.15%，醇類化合物下降至34.06%。干酪B中的醇類物質(zhì)和干酪A基本一致，由于干酪B使用的發(fā)酵劑量多，所以在0 d時(shí)產(chǎn)生的乙醇量要高于干酪A，但與干酪C差別不大。在成熟過程中，干酪B和C中乙醇的消耗量也大于干酪A，使得乙醇含量下降較快。酯類化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，它們的風(fēng)味特征為果味、奶油味等，

其他酯類化合物表現(xiàn)不明顯，含量較低。酸類化合物中以癸酸、辛酸和乙酸為主，酸的含量都高于A組，主要貢獻(xiàn)了干酪風(fēng)味中的腐臭味、酸味、奶香味等。醛、酮類化合物分離檢測(cè)出的也很少。干酪B成熟過程中風(fēng)味化合物種類多于干酪A，組分更為豐富。但是，干酪B中各風(fēng)味化合物含量略低于干酪A，較高的發(fā)酵劑使用量可以加快揮發(fā)性風(fēng)味化合物產(chǎn)生速度，造成中間產(chǎn)物的減少，終產(chǎn)物的增加。因此，干酪B風(fēng)味更加均勻適中，可以形成更好的風(fēng)味感官。

表1 干酪成熟過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的相對(duì)含量變化Table 1 Relative content changes of volatile compounds from the Mongolian cheese during ripening %

干酪C在0 d時(shí)，共檢測(cè)出32種化合物，其中酯類化合物14種，酸類化合物7種，醇類化合物6種，酮類化合物1種，醛類化合物1種，其他類化合物3種。在含量方面，醇類化合物占71.39%，酯類化合物次之，占19.23%。到第60天時(shí)，酯類化合物增加至15種，含量增加至46.01%，醇類化合物下降至32.47%。干酪C中的醇類、酯類化合物與干酪A、B基本一致。酯類化合物主要是癸酸甲酯和辛酸乙酯，醇類化合物主要是乙醇和異戊醇。酸類化合物中以癸酸、辛酸和乙酸為主，由0 d時(shí)的9.11%增加至19.82%，遠(yuǎn)大于干酪A和B，使得奶酪明顯產(chǎn)生了酸味為主的風(fēng)味構(gòu)成，明顯表現(xiàn)出酸味，影響了干酪的口感。

在硬質(zhì)蒙古干酪的揮發(fā)性風(fēng)味化合物中，以酸、酯、醇三類化合物為主。酯類是硬質(zhì)蒙古干酪中最重要的芳香物質(zhì)，其香味閾值普遍較低（平均值為0.1 mg/kg）。除癸酸甲酯外，乙酯類化合物是最重要的一類，表現(xiàn)出明顯的水果香味[9]，如乙酸乙酯可以提供甜味、果香味；己酸乙酯則可以提供果香味和臘味；癸酸乙酯既有果香味還具有明顯的椰子香味等[10]。醇類物質(zhì)在硬質(zhì)蒙古干酪也具有較高的產(chǎn)生量，一是乳糖代謝途徑產(chǎn)生；二是脂肪酶對(duì)干酪中的脂肪酸進(jìn)行降解所產(chǎn)生[11]。一般來講，醇類物質(zhì)閾值較高，在干酪風(fēng)味中的貢獻(xiàn)較小，但是醇類可以和酸類物質(zhì)進(jìn)一步反應(yīng)生成酯類，可以間接對(duì)干酪風(fēng)味產(chǎn)生影響[12]。醇類物質(zhì)在干酪中起到的作用主要是提供植物香味及酸敗味等。酸類也是硬質(zhì)蒙古干酪的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，主要有甘油三酯水解為脂肪酸或者是代謝過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物。短鏈脂肪酸對(duì)于形成干酪的風(fēng)味結(jié)構(gòu)具有重要的作用，如辛酸則可能帶來臘味、皂味、酸敗味及果味；癸酸則貢獻(xiàn)酸敗味[13]。一些長鏈的烷烴和干酪中存在的某些細(xì)菌有關(guān)，其總量較少，同時(shí)烴類化合物的芳香風(fēng)味閾值較高，其本身不具有風(fēng)味，對(duì)干酪的風(fēng)味影響可以忽略不計(jì)[14]。

2.2 微生物多樣性變化

在硬質(zhì)蒙古干酪成熟過程中，檢測(cè)到的微生物除了腸桿菌外，其余微生物都隨時(shí)間而增長。從表2可以看出，對(duì)于嗜溫好氧菌（total mesophilic aerobic bacteria，TMAB）來講，干酪A、B、C三者都是呈現(xiàn)增長趨勢(shì)。

表2 硬質(zhì)蒙古干酪在成熟過程中的微生物數(shù)目變化Table 2 Microbial counts change of Mongolian cheese during ripening lgCFU/g

在干酪制作過程中，使用的發(fā)酵劑為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌，所以乳酸菌是干酪成熟過程中的優(yōu)勢(shì)菌，在干酪成熟早期，在培養(yǎng)基上，兩種乳酸菌數(shù)目相差較小，成熟過程中呈現(xiàn)快速增加。但到中后期，嗜熱鏈球菌生長速度趨緩，保加利亞乳桿菌生長速度相對(duì)加快。嗜熱鏈球菌的生長與干酪中的鹽分有關(guān)，高鹽分會(huì)抑制嗜熱鏈球菌的生長速度[15]。保加利亞乳桿菌耐受力相對(duì)較好，能夠迅速適應(yīng)不良環(huán)境，占據(jù)優(yōu)勢(shì)[16]。這兩種乳酸菌在干酪成熟過程中的作用非常重要，可以產(chǎn)生小肽、游離氨基酸和游離脂肪酸，直接影響干酪風(fēng)味或者是作為風(fēng)味化合物的前體間接影響干酪風(fēng)味[17]。對(duì)腸桿菌的計(jì)數(shù)是判斷產(chǎn)品是否處于良好衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)之一。如果干酪中腸桿菌的數(shù)目較高，說明在干酪生產(chǎn)中的衛(wèi)生情況較差[14]。在干酪成熟初期，干酪A、B、C都有腸桿菌的檢出，不到1個(gè)數(shù)量級(jí)，可能是和干酪加鹽的過程有關(guān)。葡萄球菌和沙門氏菌在干酪成熟過程中一直沒有檢出，也沒有發(fā)現(xiàn)干酪成熟時(shí)變質(zhì)的表象。

3 結(jié)論

通過SPME-GC-MS方法對(duì)硬質(zhì)蒙古干酪中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行了分離檢測(cè)，在不同成熟期內(nèi)各化合物呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。發(fā)酵劑使用量對(duì)干酪風(fēng)味會(huì)產(chǎn)生影響，當(dāng)使用量為1.5 g/L原料乳時(shí)，酸類化合物會(huì)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致干酪酸味較重。而使用量為1.0 g/L原料乳時(shí)，其成熟過程中風(fēng)味化合物種類多于使用量為0.5 g/L原料乳，組分更為豐富，風(fēng)味更加均勻適中，可以形成更好的風(fēng)味。

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