硒脅迫對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響及對中華羊茅的化感作用

周連玉，云成玉，米 琴，喬 楓

（青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008）

硒脅迫對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響及對中華羊茅的化感作用

周連玉，云成玉，米 琴，喬 楓

（青海師范大學生命與地理科學學院，青海 西寧 810008）

通過液體和固體培養(yǎng)方式研究硒對黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens）生長的影響及其發(fā)酵液對中華羊茅（Festuca sinensis）種子萌發(fā)特性的化感作用。結果表明：與無硒培養(yǎng)基相比，濃度為1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1亞硒酸鈉對菌落直徑和菌絲體生物量具有顯著抑制作用（P＜0．05）。黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標的化感作用表現(xiàn)在稀釋倍數(shù)越小，抑制作用越大；對幼苗不同生長指標的抑制作用由高至低依次為根長、苗長、苗鮮重、根鮮重；各生長指標之間存在顯著的正相關性。

黃綠蜜環(huán)菌；硒；菌絲生長；化感作用

黃綠蜜環(huán)菌（Armillaria luteo-virens） 是一種大型真菌，在青海主要生長在海拔3 000 m～4 300 m的草甸上，大多分布于海北（祁連、海晏、剛察）、黃南（澤庫、河南）、海南（共和、貴德、興海）、果洛（瑪沁、甘德、久治） 及高海拔的玉樹地區(qū)。此外，四川、西藏、河北、陜西、甘肅等省區(qū)也有分布[1]。其研究多集中于生理生態(tài)特性、生物學特征、人工培養(yǎng)、化學成分分析、分子鑒定等[2-11]。有研究報道黃綠蜜環(huán)菌蘑菇圈生長能明顯增加植物群落的物種多樣性及物種豐富度[2-5]。

硒（Se） 是維持人和動物正常生理功能的必需微量元素[12]，人和動物缺硒會引起多種疾病。無機硒在體內(nèi)不易吸收且毒性強，只有通過生物作用使施加的外源無機硒轉(zhuǎn)化為易被體內(nèi)吸收利用的有機硒。諸多微生物如細菌、真菌具有富集硒的能力[13-17]，能轉(zhuǎn)化硒的形態(tài)[18]，這些特性提高了菌類產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和應用范圍。

許多微生物的代謝產(chǎn)物如細菌、放線菌、真菌，具有不同程度的化感效應[19-21]。研究表明，低濃度的無機硒對種子萌發(fā)特性有促進作用，高濃度發(fā)揮抑制作用[22-26]；而研究微生物富硒發(fā)酵的代謝產(chǎn)物對種子萌發(fā)特性的影響少見報道。目前黃綠蜜環(huán)菌還屬于野生，無法進行人工栽培。本試驗以黃綠蜜環(huán)菌和中華羊茅（Festuca sinensis）為材料，結合液體和固體培養(yǎng)，研究不同濃度的亞硒酸鈉對黃綠蜜環(huán)菌生長產(chǎn)生的作用，以及黃綠蜜環(huán)菌的富硒培養(yǎng)液對中華羊茅種子萌發(fā)特性的影響，以期為富硒黃綠蜜環(huán)菌和化感物質(zhì)的生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1．1．1 菌種

黃綠蜜環(huán)菌菌株由青海師范大學微生物實驗室提供。

1．1．2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH自然。

深層發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖4%、牛肉膏0．1%、KH2PO40．1%、MgCO30．1%。

1．1．3 植物種子

中華羊茅種子由蘭州大學草地保護所提供。

1.2 試驗方法

1．2．1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響

分別以硒濃度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到90 mm PDA平板中，用打孔器將黃綠蜜環(huán)菌菌落打孔成直徑4 mm的菌塊，接種于平板中央，每個處理重復3個培養(yǎng)皿，25℃培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑。

1．2．2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量影響

分別以硒濃度 0（CK）、1．0 mmol·L-1、2．0 mmol·L-1、4．0 mmol·L-1、8．0 mmol·L-1添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，將3塊4 mm的菌塊接到發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶中裝入培養(yǎng)液100 mL，25℃、130 r·min-1培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)液過濾獲得菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體于60℃干燥至恒重，電子天平稱重測得菌絲體生物量。發(fā)酵液用于活性測定。

1．2．3 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

挑選籽粒飽滿的中華羊茅種子，首先用75%的酒精表面消毒1 min，然后用無菌水沖洗3次，將種子分別在不同硒濃度的發(fā)酵液原液（X）、2倍（2X）稀釋液、3倍（3X） 稀釋液、4倍（4X） 稀釋液中浸泡24 h，以無菌水作對照，將種子放到鋪有二層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，每日補充無菌水，以潤濕濾紙為準，設3個重復，14 d后測定根長、苗長，并稱量其鮮重。用抑制率來衡量富硒發(fā)酵液對中華羊茅的化感作用情況，抑制率（P） 公式為：

式中：L1表示對照值；L2表示處理值。

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)結果均采用平均值±標準誤表示，各項測定指標采用SPSS16．0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析（LSD，P＜0．05）。采用Spearman’s rho方法進行生長指標之間的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響硒對黃綠蜜環(huán)菌菌絲生長的影響見圖1。

圖1 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌落直徑的影響Fig．1 Effect of the concentration of Se on the mycelial diameter of Armillaria luteo-virens

由圖1可見，隨著硒濃度的升高，黃綠蜜環(huán)菌菌落生長速度逐漸減慢，對照濃度的菌落直徑顯著大于硒濃度的菌落直徑（P＜0．05）。在硒處理組中，濃度為2．0 mmol·L-1和4．0 mmol·L-1時，菌落直徑顯著小于濃度為1．0 mmol·L-1的菌落，但顯著大于濃度為8．0 mmol·L-1的菌落（P＜0．05）。

2.2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響

不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響見圖2。

圖2 不同硒濃度對黃綠蜜環(huán)菌菌絲體生物量的影響Fig．2 Effect of the concentration of Se on the mycelial biomass of Armillaria luteo-virens.

由圖2可知，黃綠蜜環(huán)菌對硒具有很強的耐受力，在液體培養(yǎng)基硒濃度高達8．0 mmol·L-1時，菌絲生物量仍達到0．68 mg·mL-1。不添加硒的菌絲體生物量顯著高于添加硒的菌絲體生物量（P＜0．05），且隨著硒濃度的增加生物量逐漸下降。當硒濃度為4．0 mmol·L-1和8．0 mmol·L-1時，菌絲體生物量顯著低于硒濃度為1．0 mmol·L-1（P＜0．05）。

2.3 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響

黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響見表1。

由表1可見，各處理組與對照相比，不同濃度的富硒發(fā)酵液對中華羊茅種子萌發(fā)后苗長、根長、苗鮮重和根鮮重均表現(xiàn)為顯著的抑制作用（P＜0．05)。相同濃度的富硒發(fā)酵液稀釋倍數(shù)越小，其抑制作用越大，對中華羊茅的不同生長指標抑制作用由高到低普遍表現(xiàn)為根長＞苗長＞苗鮮重＞根鮮重。

富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標的相關分析見表2。

由表2相關性分析可知，富硒發(fā)酵液作用下苗長與根長、苗鮮重或根鮮重之間相關系數(shù)較高，分別為 0．696、0．954、0．945，均達到極顯著水平（P＜0．01）；根長與苗鮮重、根鮮重之間呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0．938和0．884；苗鮮重與根鮮重之間相關系數(shù)高達0．961?？梢?，在富硒發(fā)酵液的作用下，中華羊茅的各項生長指標相關性較高。

表1 黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長的影響Tab．1 Effect of the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens on Festuca sinensis seedling growth

表2 富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標的相關分析Tab．2 Correlation of seedling growth criteria of Festuca sinensis affected by the Se-enriched fermentation of Armillaria luteo-virens

3 討論

近年來靈芝 （Ganoderma lucidum）、蜜環(huán)菌（Armillaria mella） 等食用菌作為富硒載體開發(fā)為富硒產(chǎn)品，已引起學者們的關注。許多研究發(fā)現(xiàn)適當濃度的硒能促進真菌生長，但高濃度的硒抑制真菌生長[27-29]。何冬蘭等[27]研究Na2Se2O3對靈芝菌絲生長的影響，0．05 mmol·L-1～1．0 mmol·L-1的Na2Se2O3可促進菌絲生長，硒濃度高于1．0 mmol·L-1時菌絲體生長量呈現(xiàn)下降趨勢。王蓉等[28]研究硒對2種靈芝菌生長的影響，認為硒抑制固體培養(yǎng)基上靈芝菌的生長，2種靈芝菌的耐受能力不同，其固態(tài)培養(yǎng)的耐硒能力顯著高于液態(tài)培養(yǎng)。唐巧玉等[29]發(fā)現(xiàn)硒濃度小于10 mg·L-1時能夠促進蜜環(huán)菌生長，超過此濃度起到抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)黃綠蜜環(huán)菌在固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)時，硒濃度為1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1時均對其產(chǎn)生不良影響，可能是因黃綠蜜環(huán)菌比較敏感，而培養(yǎng)基中添加硒的濃度過高所引起。

有相關研究報道，低濃度外源硒對植物幼苗生長有促進作用，而高濃度的硒表現(xiàn)出顯著的抑制作用[22-26]。真菌發(fā)酵液中存在化感物質(zhì)，對植物生長表現(xiàn)出促進或抑制作用[20-21]。吳麗偉等[21]報道不同濃度的蜜環(huán)菌發(fā)酵液促進油菜幼苗的伸長，增加單株的干重，但對根系的伸長表現(xiàn)抑制作用。目前真菌在無機硒作用下的發(fā)酵液影響植物幼苗生長的研究報道較少，本試驗研究黃綠蜜環(huán)菌富硒發(fā)酵液對中華羊茅幼苗生長指標的化感作用，發(fā)現(xiàn)富硒發(fā)酵液稀釋倍數(shù)越小抑制作用越大，對幼苗不同生長指標的抑制作用由高至低依次為根長、苗長、苗鮮重、根鮮重（表1），且各生長指標之間存在顯著的正相關性（表2）；通過各濃度之間的比較發(fā)現(xiàn)，富硒發(fā)酵液對各生長指標的抑制作用，隨著濃度的升高而表現(xiàn)出加強的趨勢，除濃度為1．0 mmol·L-1和2．0 mmol·L-1富硒發(fā)酵液的4倍稀釋液外，其它硒濃度下的發(fā)酵液對根長和苗長的抑制率均在90%以上，化感效果好。本研究中，有些相鄰濃度處理之間存在作用趨勢不明顯的結果，這可能是由于富硒發(fā)酵液中包含多種具有化感作用的物質(zhì)，其對幼苗各項生長指標的作用是受多種代謝物共同作用所致，這些結果與前人的研究具有一定的一致性[20-21]。對于發(fā)酵液中硒的化學形態(tài)及含量是否與化感作用有關，需要做進一步的研究。

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Effects of Selenium on the Mycelial Growth of Armillaria luteo-virens and Allelopathy of Fermentation Broth on Festuca sinensis

ZHOU Lian-yu,YUN Cheng-yu,MI Qin,QIAO Feng
(College of Biology and Geography,Qinghai Normal University,Xining 810008,China)

The effects of selenium on the mycelial growth of Armillaria luteo-virens when the strain grew in solid and liquid media,and allelopathy of fermentation broth of the strain on Festuca sinensis seed germination were studied．The results showed that Na2Se2O3(1．0 mmol·L-1～8．0 mmol·L-1)could inhibit significantly mycelial diameter and biomass (P＜0．05)compared with the control cultures．Effects of the Se-enriched fermentation of A.luteo-virens on F.sinensis seedling growth demonstrated that growth inhibitions increased as the concentration of the Se-enriched fermentation increased,and inhibitory of different growth criteria was root length＞seedling length＞seedling fresh weigh＞root fresh weigh．There were significant positive correlation among different growth criteria (P＜0．01)．

Armillaria luteo-virens;selenium;mycelial growth;allelopathy

S646.9

A

1003-8310（2015）06-0045-05

10．13629/j．cnki．53-1054．2015．06．012

周連玉（1976），女，博士，副教授，主要從事微生物方面研究。E-mail:zly7604@163．com

2015-09-10