模擬失重條件下成骨細(xì)胞核基質(zhì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ的改變

王 瀚，胡澤兵，孫中洋，張連昌，李東韜,2，趙學(xué)武,3，張 舒

1第四軍醫(yī)大學(xué)航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032；2海軍總醫(yī)院 心臟中心，北京 100048；393175部隊(duì)醫(yī)院，吉林長春 130051

隨著我國航天事業(yè)的蓬勃發(fā)展，中長期載人航天活動(dòng)已經(jīng)進(jìn)入初步實(shí)施階段。長時(shí)間處于失重環(huán)境對(duì)航天員造成的不良影響亟待我們深入研究并開發(fā)有效的防護(hù)措施。失重導(dǎo)致航天員生理變化的細(xì)胞學(xué)機(jī)制已有深入研究，但對(duì)失重是如何被機(jī)體細(xì)胞感知的問題尚無較好的解釋。已有較多研究表明，細(xì)胞骨架在細(xì)胞感知失重過程中起著關(guān)鍵作用[1]。但有著重要功能的核基質(zhì)(核骨架)在細(xì)胞感知失重中的作用尚無研究涉及。由于核基質(zhì)的成分十分復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其蛋白成分近400種[2]。故核基質(zhì)沒有一種良好的染色或其他原位顯示其結(jié)構(gòu)的方法。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是在DNA復(fù)制過程中必不可少的酶類，它同時(shí)也是一種核基質(zhì)蛋白，即核基質(zhì)結(jié)構(gòu)上的固有成分[3]。本實(shí)驗(yàn)研究了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ(DNA TopoisomeraseⅡβ，TopoⅡβ)在模擬失重后的表達(dá)量與分布位置的變化，進(jìn)而反映核基質(zhì)的改變。

材料和方法

1 材料 出生3 d SD大鼠乳鼠12只，雄性(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，胎牛血清(四季青公司)，DMEM-F12/1：1培養(yǎng)基、雙抗(Hyclone公司)，胰酶(Millipore公司)，Ⅰ型膠原酶(Biosharp公司)，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ兔抗鼠多克隆抗體(一抗)、Lamin B1抗體(一抗)、羊抗兔抗體(二抗)(Abcam公司)，Hochest染液(Sigma公司)，細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒(碧云天公司)，BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)，回轉(zhuǎn)器(2D-RWVs-ISME，中國航天員科研訓(xùn)練中心)，激光共聚焦顯微鏡(FL-1000，Olympus公司)，超凈工作臺(tái)(天津泰斯特公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司)。

2 大鼠乳鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng) 取4只出生3 d的SD大鼠乳鼠，脫頸處死，75%乙醇浸泡消毒。超凈臺(tái)中取出乳鼠的顱頂骨，將取出的顱頂骨表面結(jié)締組織刮凈，剪碎為直徑約1 mm骨片移入培養(yǎng)瓶，加入0.25%胰酶4 ml預(yù)消化90 min，間斷震蕩。棄上清，無血清培養(yǎng)基漂洗2次。加入0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型膠原酶混合液4 ml，消化30 min，間斷震蕩。收集上清液，1 200 r/min離心5 min，棄上清加入2 ml無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。同樣轉(zhuǎn)速時(shí)間再次離心，棄上清后加入1 ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。再重復(fù)胰膠酶消化步驟3次，之后混合所有細(xì)胞并計(jì)數(shù)，以5×105/瓶的密度接種于

50 ml培養(yǎng)瓶[4]。按常規(guī)步驟換液傳代。后續(xù)所有試驗(yàn)均使用第3代細(xì)胞。

3 模擬失重 將細(xì)胞以2×105/ml的密度接種于玻片上，正常培養(yǎng)1 d后，每個(gè)回轉(zhuǎn)艙內(nèi)隨機(jī)裝入4張玻片，充滿完全培養(yǎng)基并排凈氣泡。將裝好玻片的回轉(zhuǎn)艙隨機(jī)分為對(duì)照組和模擬失重組(MG)。將模擬失重組的回轉(zhuǎn)艙安裝至回轉(zhuǎn)器，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)以24 r/min的穩(wěn)定轉(zhuǎn)速回轉(zhuǎn)48 h。對(duì)照組放置在回轉(zhuǎn)器旁邊靜置培養(yǎng)[5]。

4 間接免疫熒光染色 將玻片從回轉(zhuǎn)艙中取出，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min。PBS漂洗3次，0.25% Triton-X100室溫處理15 min。每張玻片滴加1滴山羊血清，室溫封閉30 min，之后小槍頭輕輕吸去。組化筆在玻片中間畫一小圈，在圈中加入一抗(10 μg/ml)，4℃孵育過夜。PBS漂洗3次，后續(xù)步驟避光操作。在圈中滴加熒光二抗(1∶1 000)，37℃孵育1 h。PBS漂洗3次，再向圈中滴加Hochest染液(1∶1 000)。PBS漂洗3次，抗淬滅劑封片，多聚樹脂固定[6]。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，以相同激光參數(shù)拍攝照片。

5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞DNA TopoⅡβ的表達(dá)將玻片從回轉(zhuǎn)艙中取出，用胰酶將細(xì)胞消化并離心，PBS漂洗2次，用小槍頭吸凈殘留液體。使用細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒(碧云天公司)按說明書所述步驟提取細(xì)胞核蛋白，用BCA試劑盒對(duì)核蛋白樣本進(jìn)行蛋白定量。而后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，常規(guī)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后分別孵育DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱβ抗體(1∶1 000)與Lamin B1抗體(1∶1 000)4℃過夜。TBST將膜洗凈后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h。TBST漂洗后以ECL發(fā)光法進(jìn)行發(fā)光，并使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行掃描分析[7]。以Lamin B1為內(nèi)參。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 模擬失重致TopoⅡβ分布位置發(fā)生改變 成骨細(xì)胞TopoⅡβ間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組TopoⅡβ的綠色熒光信號(hào)與DAPI細(xì)胞核襯染的藍(lán)色熒光信號(hào)完全吻合，且呈均勻性點(diǎn)狀分布。模擬失重組TopoⅡβ的熒光信號(hào)與細(xì)胞核襯染的輪廓相符，但綠色熒光的分布失去了對(duì)照組的均一性，出現(xiàn)斑點(diǎn)狀的局部熒光信號(hào)增強(qiáng)(圖1中箭頭所示)，其他部位的熒光信號(hào)減弱。

2 模擬失重致TopoⅡβ表達(dá)量降低 模擬失重組和對(duì)照組成骨細(xì)胞免疫熒光染色圖片中，分別隨機(jī)抽取6個(gè)400倍視野，對(duì)其中細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度使用Image J軟件進(jìn)行分析。對(duì)照組熒光強(qiáng)度為68.3±5.6，模擬失重組熒光強(qiáng)度為51.7±3.9，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模擬失重組TopoⅡβ的蛋白表達(dá)量顯著降低(P＜0.05)(圖3)。

討 論

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是DNA復(fù)制過程中不可或缺的關(guān)鍵蛋白，其重要功能是完成DNA拓?fù)鋵W(xué)異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化，使其能夠完成后續(xù)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶分為Ⅰ型與Ⅱ型。Ⅰ型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA TopoisomeraseⅠ，TopoⅠ)使超螺旋DNA在切斷結(jié)合反應(yīng)中發(fā)生松弛。將互補(bǔ)的單鏈環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成具有螺旋結(jié)構(gòu)的雙鏈環(huán)狀DNA，使單鏈DNA打結(jié)或解結(jié)。TopoⅠ的作用過程中無需ATP供能。Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNA TopoisomeraseⅡ，TopoⅡ)可單獨(dú)催化閉環(huán)狀DNA產(chǎn)生超螺旋，同時(shí)還可催化促旋酶的催化反應(yīng)，此過程需要ATP供能[8-10]。

圖1 模擬失重后TopoⅡβ分布位置改變Fig. 1 Distribution changes of DNA TopoisomeraseⅡβ

圖2 模擬失重后TopoⅡβ免疫熒光強(qiáng)度的變化(aP＜0.05, vs對(duì)照組)Fig. 2 Fluorescence intensity changes of DNA Topoisomerase Ⅱβ after simulated microgravity (aP＜0.05, vs control group)

圖3 Western blot檢測(cè)模擬失重后TopoⅡβ表達(dá)的變化(aP＜0.05, vs 對(duì)照組)Fig. 3 Western blot showing the expression changes of DNA Topoisomerase Ⅱβ after simulated microgravity (aP＜0.05, vs control group)

細(xì)胞在模擬失重后，與對(duì)照組相比，TopoⅡβ的熒光信號(hào)分布發(fā)生改變，說明模擬失重可以導(dǎo)致細(xì)胞TopoⅡβ在核內(nèi)的位置發(fā)生改變。1984年Nishizawa等[11]的研究證實(shí)了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是核基質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一部分，所以本研究結(jié)果提示細(xì)胞核基質(zhì)在模擬失重后可發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變。雖然TopoⅡβ分布位置的改變尚不能作為核基質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的充分條件，但由于核基質(zhì)的蛋白成分復(fù)雜，目前尚未發(fā)現(xiàn)良好的染色方法[12]。通過標(biāo)記其中的某一種關(guān)鍵蛋白，理論上可以從側(cè)面反映其結(jié)構(gòu)變化。模擬失重后，TopoⅡβ發(fā)生了局部的聚集與其他部分的密度降低，提示核基質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了部分聚集攣縮同時(shí)其他部分出現(xiàn)了以結(jié)構(gòu)松散為特征的紊亂[13]。核基質(zhì)的此種改變也符合失重條件下細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變的特征。但根據(jù)當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)尚不能排除引起TopoⅡβ發(fā)生此種改變還存在其他原因。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，這也是腫瘤細(xì)胞生長旺盛、增殖迅速的重要原因之一。相反，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶也正成為抗腫瘤藥物的重要靶點(diǎn)之一[14]。本次研究發(fā)現(xiàn)，模擬失重可以降低成骨細(xì)胞中TopoⅡβ的表達(dá)。由于Pogorelcnik等[15]的研究已證實(shí)TopoⅡβ的表達(dá)降低可以抑制細(xì)胞DNA的復(fù)制，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢、細(xì)胞功能降低的結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了模擬失重引起的DNA復(fù)制功能降低的部分原因是TopoⅡβ表達(dá)降低。

Wei等[16]的研究已證實(shí)，在失重條件下細(xì)胞的增殖受到抑制且伴有細(xì)胞周期的阻滯。而這種改變的重要原因之一就是失重影響了DNA的復(fù)制過程[17]?；诒敬螌?shí)驗(yàn)結(jié)果，我們提出3個(gè)失重影響DNA復(fù)制的可能機(jī)制：1)失重引起核基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生局部聚集與局部的疏松。核基質(zhì)的局部聚集使局部的空間過于擁擠，可以影響復(fù)制過程中DNA雙鏈結(jié)構(gòu)打開時(shí)的空間結(jié)構(gòu)，以及其他許多類似的過程。核基質(zhì)的局部疏松則使單位體積內(nèi)發(fā)生DNA復(fù)制的位置減少，即DNA的有效復(fù)制面積減少。故核基質(zhì)的聚集與疏松均使DNA復(fù)制的效率降低。2)作為核基質(zhì)蛋白，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的空間結(jié)構(gòu)會(huì)受到核基質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的影響。從微觀角度來看，核基質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變可以使定位在改變位置的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的擠壓或牽拉等，進(jìn)而影響其與DNA的結(jié)合或改變DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的功能，最終抑制DNA復(fù)制。同樣的改變還可能發(fā)生在DNA聚合酶、RNA聚合酶等多種核基質(zhì)蛋白上。3)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶表達(dá)量的降低也會(huì)降低DNA復(fù)制的效率。

失重的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)一直是空間生物學(xué)研究的難點(diǎn)，目前尚未形成公認(rèn)的觀點(diǎn)。雖然目前已對(duì)失重導(dǎo)致細(xì)胞改變做了較為深入的分子機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)了諸多重要的信號(hào)分子與通路[18-19]。但如此眾多的分子調(diào)控機(jī)制的上游是否存在共同的始動(dòng)因素，將重力改變的這種力學(xué)信號(hào)變化轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的生物信號(hào)，從而引發(fā)下游信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，目前由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)限制尚缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。但很多學(xué)者對(duì)于這一問題，基于對(duì)失重生物學(xué)效應(yīng)的深刻理解，提出了相對(duì)成熟的觀點(diǎn)。其中包括Ingber[20]提出的張力模型、細(xì)胞骨架感知失重的觀點(diǎn)、基因優(yōu)先改變的觀點(diǎn)以及細(xì)胞質(zhì)中物理性質(zhì)改變的觀點(diǎn)[21]，但還缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。我們課題組本次研究結(jié)果提示，包含有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的細(xì)胞核基質(zhì)在細(xì)胞感知失重的過程中可能起到重要作用。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是細(xì)胞生命活動(dòng)重要的調(diào)控者，它在失重中改變的發(fā)現(xiàn)為研究失重生物效應(yīng)提出了新方向。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶與核基質(zhì)之間的關(guān)系，及其在失重環(huán)境下的改變還有待進(jìn)一步研究，以便我們?cè)缛战议_失重生物效應(yīng)的神秘面紗，并發(fā)現(xiàn)簡單有效的防護(hù)方法。

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