一株拮抗菌C-5的分離及鑒定

韋 露 陳 償 龍?jiān)朴? 蔡奕明

(1.中國(guó)科學(xué)院 南海海洋研究所 廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301; 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 3.暨南大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 510632)

海地瓜(Acaudina molpadioidea)是屬于海參綱(Holothuriodea), 芋參目(Molpadida), 尻參科(Caudinidae), 海地瓜屬(Acaudina)[1]。其資源豐富, 廣泛分布于中國(guó)沿海海域。海參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)是沿海漁民增收致富和捕撈漁民轉(zhuǎn)產(chǎn)轉(zhuǎn)業(yè)的新途徑, 受市場(chǎng)需求和利潤(rùn)的驅(qū)使, 養(yǎng)殖速度不斷加快, 規(guī)模不斷壯大, 密度過高,容易造成病害暴發(fā)?；【?Vibrio)是危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的主要病原菌[2], 目前, 生產(chǎn)中防治細(xì)菌性疾病常用的方法是使用抗生素, 而大量抗生素的施用會(huì)導(dǎo)致藥物殘留和耐藥菌株的出現(xiàn), 人們食用含抗生素殘留的海鮮產(chǎn)品, 也會(huì)威脅健康, 這些負(fù)面效應(yīng)日益引起人們的關(guān)注, 因此, 積極尋找抗生素的替代品顯得尤為重要[3]。其中, 開發(fā)綠色環(huán)保的益生菌已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)[4-5]。

益生菌是一種活的微生物, 能夠維持宿主腸道平衡、增強(qiáng)新陳代謝、促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、改善微生物生態(tài)調(diào)控, 從而提高宿主動(dòng)物的健康水平、增強(qiáng)機(jī)體免疫力, 也被稱為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑[6]。Kozasa[7]首次將微生態(tài)制劑應(yīng)用于水產(chǎn)上, 用從土壤中分離的芽孢桿菌(Bacillus toyoi)處理日本鰻鱺(Anguilla japonica),降低了愛德華氏菌引起的死亡, 從此益生菌的研究迅猛發(fā)展。目前, 潘雷等[8]已經(jīng)報(bào)道, 餌料中添加益生菌可以改善大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚的腸道菌群以及顯著提高了部分免疫指標(biāo); 張漢華等[9]研究指出, 益生菌可以對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)起到生態(tài)調(diào)控的效果; 鄒文政等[10]發(fā)現(xiàn), 從養(yǎng)殖水體中可以篩選出對(duì)大黃魚(Pseudosciaena crocea)病原弧菌有明顯拮抗作用的海洋細(xì)菌。

微生態(tài)制劑因其無毒、無殘留、抗藥性小、生態(tài)健康等特點(diǎn)成為近年來海水養(yǎng)殖的改良劑[11]。雖然市場(chǎng)上已有多種有益菌產(chǎn)品, 但是多數(shù)是國(guó)外進(jìn)口或者陸源性菌株, 目前, 尚未有報(bào)道來源于地瓜參腸道的益生菌株生產(chǎn)微生態(tài)制劑。本研究目的是從健康的野生地瓜參腸道內(nèi)分離篩選對(duì)病原弧菌具有拮抗作用的益生菌, 進(jìn)一步在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)用微生態(tài)制劑、控制疾病、改良水質(zhì)、提高養(yǎng)殖動(dòng)物存活率和免疫力等提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

從地瓜參腸道共分離到81株細(xì)菌作為體外拮抗供試菌株。

1.1.2 病原性指示弧菌

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)13150 (Vp13150)購(gòu)自廣東省疾病預(yù)防與控制中心(CDC), 為魚類致病菌。

1.1.3 其他指示菌

枯草桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、紫色桿菌(Chromobacterium.Violaceum) CV026、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)(E167)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)199(A.saL)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae) 006, 解淀粉芽孢桿菌(L1) (Bacillus amyloliquefaciens)L1(解淀粉芽孢桿菌L1為事先經(jīng)過拮抗實(shí)驗(yàn)沒有拮抗性的細(xì)菌),均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。上述所有菌株均用普通LB培養(yǎng)基, 30 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的篩選與抗菌譜測(cè)定

從地瓜參腸道分離到81株待測(cè)菌株, 參照文獻(xiàn)[12]的瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定, 以抑菌圈大小初步判定抑菌活性, 并將初篩得到的拮抗菌測(cè)定其對(duì) 7株病原指示菌的抑菌譜。

1.2.2 拮抗菌的鑒定

采用Biolog細(xì)菌鑒定系統(tǒng), 進(jìn)行菌株95種碳源利用的理化分析。以C-5總DNA為模板, 以通用引物(27F和1492R)對(duì)其16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[13],經(jīng)測(cè)序后所得序列提交至NCBI進(jìn)行Blast同源性比對(duì), 確定其在系統(tǒng)進(jìn)化中的位置, 進(jìn)行分子鑒定。

1.2.3 拮抗菌C-5胞外產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑菌作用

參照Sugita[14]的方法, 制備拮抗菌的胞外產(chǎn)物。以副溶血弧菌 Vp13150為病原指示菌, 以無拮抗性菌株 L1胞外產(chǎn)物作對(duì)照組, 加入等量 C-5無菌上清,同時(shí)做3個(gè)平行, 每隔2 h取樣測(cè)定OD600, 繪制曲線。

1.2.4 鹵蟲安全性實(shí)驗(yàn)

根據(jù) Goulden[15]的方法, 將過夜孵化 30只鹵蟲放入無菌海水, 運(yùn)用12孔板, 加入 5個(gè)濃度梯度的細(xì)菌(C-5 和 Vp13150)至終濃度為 104、105、106、107、108cfu/mL, 不加細(xì)菌孔為對(duì)照組。所有處理需做 3個(gè)平行, 連續(xù)觀察 3 d, 計(jì)算鹵蟲死亡率, 并采用寇氏法計(jì)算半致死濃度。

采用寇氏法(Karber氏法), lg LC50=XK-C∑[Pi+P(i+1)] , 式中:XK為最大劑量的對(duì)數(shù);C為相鄰劑量比值的對(duì)數(shù);Pi、P(i+1)為各劑量組的死亡率。此時(shí)試驗(yàn)組對(duì)應(yīng)的濃度LC50, 即為半致死劑量濃度。

1.2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用常規(guī)的瓊脂擴(kuò)散(K-B)法, 對(duì)篩選得到的拮抗菌 C-5菌株進(jìn)行 20種常用抗生素的敏感性測(cè)定,以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標(biāo)[16]。

1.2.6 優(yōu)化拮抗菌的生長(zhǎng)條件

研究3個(gè)培養(yǎng)條件(pH、溫度、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)拮抗菌C-5生長(zhǎng)的影響。

溫度: 10、20、25、30、37、45 ℃

pH值: 4.0、5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0、 11.0

NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù): 0%、1%、2%、3%、4%、5%

以上實(shí)驗(yàn)除了考察因素外, 發(fā)酵條件都是在接種量1%、30 ℃、200 r/min下培養(yǎng)24 h后, 取樣測(cè)定各條件的OD600值, 以不接菌的LB培養(yǎng)基作空白對(duì)照。以培養(yǎng)溫度、初始pH、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo), OD600值為縱坐標(biāo)繪制各自曲線[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.1, SPSS17.0中的單因素方差分析(ONE-WAY ANVOA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 均值采用Duncan法進(jìn)行多重比較, 數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選與抗菌譜

先分離得到的 81株細(xì)菌, 再用打孔法篩選到 1株抑菌譜較廣且對(duì)副溶血弧菌具有較強(qiáng)抑制作用的拮抗菌 C-5, 其抗菌譜結(jié)果見表1。結(jié)果顯示, 除副溶血弧菌外, C-5對(duì)其余溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌等病原菌有拮抗作用, 此外還能有效抑制臨床的霍亂弧菌和紫色桿菌。從余下拮抗性較弱的80株中, 挑出一株L1作為后續(xù)試驗(yàn)的陰性對(duì)照菌。

表1 C-5和L1對(duì)7種指示菌的抗菌活性Tab.1 Antimicrobial activities of the bacterium C-5 and L1 towards 7 indicator bacteriums

2.2 拮抗菌C-5的鑒定

拮抗菌C-5的生理生化檢測(cè)結(jié)果見表2, 菌株C-5菌落形態(tài)呈灰白色, 革蘭氏陰性, 發(fā)酵葡萄糖、果糖、麥芽糖等多種糖類, 可利用檸檬酸鹽, 不液化明膠等。

表2 C-5菌株的生化特征Tab.2 Biochemical analysis of isolated C-5

16S rDNA測(cè)序結(jié)果比對(duì)可知(圖1), 其與霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)TMPSB-T10 (EU 047556.1)同源性99%。屬于霍氏腸桿菌(Enterobacter hormaechei)中的成員, 此菌株在 NCBI上的登錄號(hào)為 KJ660958, 依據(jù)鑒定結(jié)果并結(jié)合菌株號(hào), 最后鑒定該拮抗菌C-5為腸桿菌屬Enterobactersp.

圖1 基于16S rDNA構(gòu)建C-5的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of C-5 base on 16S rDNA

2.3 拮抗菌 C-5的胞外產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌的抑菌作用

從圖2可知, 實(shí)驗(yàn)組副溶血弧菌的生物量從0～4 h為遲緩期, 細(xì)菌幾乎沒有生長(zhǎng); 5～12 h為對(duì)數(shù)期, 細(xì)菌量急劇增長(zhǎng); 12～14 h為穩(wěn)定期, 維持在一定水平; 16 h后為衰退期, 生物量逐漸下降; 對(duì)照組0～10 h一直穩(wěn)定在較低水平, 至12 h后開始緩慢上升。

圖2 拮抗菌C-5胞外產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌Vp13150的抑菌作用曲線Fig.2 Inhibitory curve of extracellular products of antagonistic bacterium C-5 against V. parahaemolyticus13150

2.4 鹵蟲毒性實(shí)驗(yàn)

半致死濃度(LC50)測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明鹵蟲感染副溶血弧菌72 h后的LC50為105cfu/mL, 感染拮抗菌C-5的LC50為108cfu/mL。具體結(jié)果見表3。

表3 不同濃度C-5和Vp13150條件下鹵蟲的死亡率Tab.3 Mortalities of Artemia nauplii with different doses of C-5 and Vp13150

2.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

供試的一株潛在益生菌C-5對(duì)20種抗生素類藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4, 可見菌株C-5對(duì)15種抗生素均敏感, 僅對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、頭孢哌酮、氨芐西林5種抗生素產(chǎn)生耐藥。

表4 菌株C-5藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of antibiotic sensitive test of strain C-5

2.6 初步優(yōu)化拮抗菌C-5的發(fā)酵條件

pH對(duì)拮抗菌 C-5生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖3), 菌株C-5的最適生長(zhǎng)初始pH為7。初始pH范圍為4～11時(shí), C-5的OD600值隨著pH的升高而增加, 當(dāng)pH為7時(shí), C-5的OD600值達(dá)到最大值1.503; pH大于7時(shí), OD600值逐漸降低; 當(dāng)pH過酸(pH=4、5)或者過堿(pH=10、11), 菌株C-5幾乎不能生長(zhǎng)。

圖3 pH對(duì)菌株C-5生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of pH on the growth of strain C-5

溫度對(duì)拮抗菌C-5生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖4),菌株C-5在20～40 ℃溫度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng), 其中C-5的最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃。在20～30 ℃范圍內(nèi), 隨著培養(yǎng)溫度的升高, C-5的OD600值逐漸增大, 在30 ℃時(shí)達(dá)到最大值 1.579; 當(dāng)溫度大于 30 ℃時(shí), C-5的OD600值逐漸降低。當(dāng)培養(yǎng)溫度過低(10 ℃)或過高(45 ℃)時(shí), C-5的OD600值最低, 幾乎不生長(zhǎng)。

圖4 溫度對(duì)菌株C-5生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of temperature on the growth of strain C-5

鹽度對(duì)拮抗菌C-5生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5),菌株C-5在0～5%鹽度范圍內(nèi)均能生長(zhǎng), 其中C-5的最適生長(zhǎng)鹽度為2% NaCl。在0～5%范圍內(nèi), 隨著鹽度的升高, C-5的OD600值逐漸增大, 在2%時(shí)達(dá)到最大值1.462; 當(dāng)大于2%時(shí), C-5的OD600值逐漸降低。

圖5 鹽度對(duì)菌株C-5生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of NaCl on the growth of strain C-5

3 討論

海參腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生物群落, 其構(gòu)成不但與海參種類和大小有關(guān), 還受到外界環(huán)境因素, 如水體、飼料中微生物等的影響。一般認(rèn)為, 海參腸道的優(yōu)勢(shì)菌群為革蘭氏陰性菌, 如弧菌、假單胞菌屬等[18]。腸道細(xì)菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中, 逐漸定植并繁殖, 形成固有菌群, 通過分泌抗菌物質(zhì)抑制其他細(xì)菌的繁殖和生長(zhǎng)[19]。作者從地瓜參腸道內(nèi)分離弧菌拮抗菌, 擴(kuò)大細(xì)菌的來源, 其作為土著微生物對(duì)于定植和繁殖并有效抑制病原菌有極大的優(yōu)勢(shì)。

目前, 微生態(tài)制劑的市場(chǎng)需求非常大, 可是其種類和功能卻參差不齊, 在一定程度上影響了其市場(chǎng)前景。以海水養(yǎng)殖動(dòng)物腸道和養(yǎng)殖環(huán)境作為來源的土著微生態(tài)制劑的開發(fā)和應(yīng)用發(fā)展較為緩慢, 因此, 分離培養(yǎng)并研制土著微生物益生菌制劑意義重大[20]。近年來, 許多研究工作者都把重心放在分離乳酸菌上[21], 而本實(shí)驗(yàn)首次從地瓜參腸道分離出一株益生腸桿菌, 并從生理生化、分子生物學(xué)方面進(jìn)行了鑒定, 確定為霍氏腸桿菌, 編號(hào)為 C-5, 為今后地瓜參池塘養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境調(diào)控, 控制病害頻發(fā), 提供了優(yōu)良的土著菌株, 具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選到的益生菌 C-5做了基礎(chǔ)的相關(guān)研究, 發(fā)現(xiàn)其抑菌譜廣, 對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、殺鮭氣單胞菌等有很強(qiáng)的拮抗作用, 表明其體外抑菌效果明顯。拮抗菌 C-5發(fā)揮抑菌作用主要是其產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物, 本實(shí)驗(yàn)表明, 在最初的 10 h能抑制部分病原副溶血弧菌, 10 h后病原菌的數(shù)量才開始上升, 這種現(xiàn)象可能是由于抑菌物質(zhì)的活力隨著時(shí)間和環(huán)境的改變而下降, 最終使得病原菌重新繁殖[22]。一般認(rèn)為, 確保益生菌的安全性是其應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的前提, 而評(píng)價(jià)安全性一個(gè)最直接的方法是確定半致死濃度(LC50)[23]。本研究采用鹵蟲(Artemia)體外浸浴方法, 證實(shí)拮抗菌 C-5對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的活餌料鹵蟲是無毒的, 菌株 C-5對(duì)鹵蟲的 72 h LC50為 108cfu/mL。細(xì)菌的LC50≤103cfu/mL被認(rèn)為是高致病性,而 LC50≥107cfu/mL被認(rèn)為是無致病性的[24]。一般來說, 細(xì)菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的濃度與其生長(zhǎng)條件密切相關(guān), 如pH值、培養(yǎng)溫度等[25]。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了C-5的生長(zhǎng)條件, 其最適溫度為30℃, 最適初始pH為7,最適生長(zhǎng)鹽度為 2%NaCl, 說明其發(fā)酵條件溫和, 適合擴(kuò)大培養(yǎng)。另外, 其抑菌成分主要分泌到胞外, 分離簡(jiǎn)單, 這些也為發(fā)酵工程奠定基礎(chǔ)。

近年來, 養(yǎng)殖業(yè)病害頻發(fā), 如何更加有效地利用拮抗菌的抗菌作用來抑制病原菌、減少化學(xué)藥物(抗生素類)的使用、降低水產(chǎn)品體內(nèi)藥物殘留、保護(hù)生態(tài)環(huán)境、發(fā)展綠色經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)、形成一個(gè)健康穩(wěn)定的良性循環(huán), 這是生物防治技術(shù)未來的發(fā)展方向。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)地瓜參病原菌的拮抗微生物進(jìn)行了較為基礎(chǔ)的研究, 如何將篩選到的益生菌 C-5真正應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖, 其定植模式、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、抑菌機(jī)理等還有待進(jìn)一步研究。

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