黃芩苷對腦缺血后大鼠海馬COX-2表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用及其可能機(jī)制*

王海軍

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，黑龍江，齊齊哈爾 161041)

黃芩苷對腦缺血后大鼠海馬COX-2表達(dá)和神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用及其可能機(jī)制*

王海軍

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科，黑龍江，齊齊哈爾 161041)

目的:探究黃芩苷對大鼠全腦缺血/再灌注損傷后動(dòng)物行為學(xué)、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生數(shù)量以及COX-2(環(huán)氧化酶-2)蛋白表達(dá)量的影響，分析其可能的作用機(jī)制。方法:84只體質(zhì)量250～300 gWistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=28):假手術(shù)組(Sham)，全腦缺血/再灌注后黃芩苷胃灌注處理組(Baicalin)，全腦缺血/再灌注后生理鹽水胃灌注處理組(Saline-water)。參照Pulsinelli法建立全腦缺血/再灌注損傷大鼠模型，通過Bederson神經(jīng)癥狀分級評分、被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)、免疫組織化學(xué)檢測、蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測黃芩苷對模型大鼠神經(jīng)功能損傷、學(xué)習(xí)記憶能力、內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量以及COX-2蛋白表達(dá)變化的影響。結(jié)果:與假手術(shù)組(Sham)比較，Baicalin組與Saline-water組大鼠神經(jīng)功能障礙癥狀都更加明顯且差異顯著;大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)均明顯增多;海馬腦區(qū)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增加;腦組織環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白的表達(dá)顯著增加。與Saline-water組比較，Baicalin組大鼠經(jīng)黃芩苷胃灌注干預(yù)，神經(jīng)功能損傷顯著改善，潛伏期顯著延長，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少;Baicalin組海馬腦區(qū)Brdu陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于Saline-water組，Baicalin組COX-2蛋白的表達(dá)水平較Salinewater組明顯降低。結(jié)論:黃芩苷對大鼠全腦缺血/再灌注損傷具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過降低COX-2基因表達(dá)、抑制損傷伴隨炎癥反應(yīng)，從而改善內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞小生境(niche)，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖或存活率。

黃芩苷;神經(jīng)功能;被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn);內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞;環(huán)氧化酶-2

目前，不論是局部還是全局腦部停循環(huán)引發(fā)的腦缺血，都是我國成年人的主要致死致殘因素。行使學(xué)習(xí)與記憶的海馬腦區(qū)常常是腦缺血后最早也是最嚴(yán)重的受損區(qū)域［1-2］。腦缺血早期能觀察到海馬腦區(qū)神經(jīng)元死亡、突觸連接改變，以及多種基因和蛋白表達(dá)變化，這種腦缺血后腦組織分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)的改變，往往會(huì)反映為病人的認(rèn)知功能減退、失明、感覺異常，嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)肢體無力或癡呆［1］。目前臨床尚無有效的治療手段，故尋找可行性治療手段的基礎(chǔ)研究方向，主要為尋找神經(jīng)保護(hù)劑，對神經(jīng)元及其功能進(jìn)行保護(hù)和干細(xì)胞療法［2］。

關(guān)于尋找神經(jīng)保護(hù)劑類新型藥物的研究很多，其中抑制炎癥反應(yīng)的藥物研究是一個(gè)熱點(diǎn)。這是因?yàn)槟X缺血常常伴隨有明顯的炎癥反應(yīng)。臨床前研究也表明，炎癥干預(yù)可有效減緩腦缺血后期腦損傷的進(jìn)展［3-4］。環(huán)氧化酶-2為誘生型環(huán)氧化酶，是炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，也是腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后誘發(fā)COX-2表達(dá)與缺血后損傷有密切關(guān)系［5］。此外，COX-2對神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活動(dòng)也有一定程度影響［6］。目前的主要假說是，COX-2基因表達(dá)下調(diào)可以抑制炎癥反應(yīng)，從而改善內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞小生境(niche)，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖或提高其存活率。干細(xì)胞移植作為療法應(yīng)用于腦缺血的研究歷史還比較短暫，目前主要包括移植外體干細(xì)胞和激活內(nèi)體神經(jīng)干細(xì)胞［7］。由于激活內(nèi)體神經(jīng)干細(xì)胞有明顯的安全性和操作簡單、風(fēng)險(xiǎn)低的優(yōu)勢，故如何激活內(nèi)體干細(xì)胞以增加新生神經(jīng)元的數(shù)量成為近年的研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可以激發(fā)成年腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖［8］，如果結(jié)合藥理學(xué)的干預(yù)，增加內(nèi)體神經(jīng)干細(xì)胞再生，補(bǔ)償缺血后死亡腦神經(jīng)元細(xì)胞的功能，就有可能為臨床缺血后腦血管意外事件治療提供可行性指導(dǎo)。

黃芩為中國傳統(tǒng)中藥材，《神農(nóng)本草經(jīng)》最早描述其具有清熱燥、瀉火毒等功效。黃芩苷(Baicalin)是黃芩提取物的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有殺菌、抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用［9］。最近的研究還表明，黃芩苷有神經(jīng)保護(hù)、在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用，這點(diǎn)提示我們黃芩苷可能在腦缺血后損傷修復(fù)治療中扮演重要角色［10-12］。

因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)M臨床上腦組織缺血/再灌注損傷，在大鼠中建立全腦缺血/再灌注模型，觀察黃芩苷對腦缺血后大鼠腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)分組

雄性Wistar大鼠由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，84只體質(zhì)量250～300 g大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham)、全腦缺血/再灌注后黃芩苷胃灌注處理組(Baicalin)、全腦缺血/再灌注后生理鹽水胃灌注處理組(Saline-water)各28 d［13］。手術(shù)后，10只用于行為學(xué)分析，18只用于蛋白表達(dá)(術(shù)后第2天)和神經(jīng)干細(xì)胞增殖的檢測(術(shù)后第2、4、8天)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 各組大鼠處理方法 Baicalin組參照Pulsinelli法，建立全腦缺血 15 min后再灌流模型［14］，模型建立后對大鼠進(jìn)行黃芩苷灌胃藥理干預(yù)(模型建立后持續(xù)3 d，每日1次，劑量100 mg/kg)。Saline-water組模型建立同Baicalin組，模型建立后對大鼠進(jìn)行生理鹽水灌胃藥理干預(yù)(模型建立后持續(xù)3 d，每日 1次，劑量 100 ml/kg)。假手術(shù)組(Sham)不進(jìn)行雙側(cè)總動(dòng)脈夾閉操作，其余步驟相同Saline-water組。

1.2.2 樣本采集與實(shí)驗(yàn)檢測方案 每組按隨機(jī)數(shù)字表法選取18只大鼠，分別在建模后第2天、第4天、第8天處死，每次處死6只。取第2天處死大鼠腦組織，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)測定大鼠海馬COX-2的表達(dá)變化。免疫組化檢測海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)BrdU陽性細(xì)胞的表達(dá)(20 mg/ ml BrdU生理鹽水注射液腹腔注射)。

1.2.3 模型大鼠神經(jīng)功能指標(biāo)測定 在第1、3、5天采用Bederson神經(jīng)癥狀分級，對每組模型大鼠進(jìn)行評分。0分:對大鼠提尾無癥狀;1分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側(cè)前肢不能伸直;2分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側(cè)前肢屈曲，未見轉(zhuǎn)圈行為;3分:對大鼠提尾，體態(tài)為損傷對側(cè)前肢屈曲，伴自發(fā)轉(zhuǎn)圈行為［15］。

1.2.4 模型大鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)測定 手術(shù)后第1、2、3、4天每組按隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠，每日3次被動(dòng)回避訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。XBA-2大鼠避暗程序自動(dòng)控制儀由一個(gè)暗室和一個(gè)明室組成，有通道連接，暗室可對大鼠電擊。從面朝暗室放入大鼠開始計(jì)時(shí)，直到第1次電擊時(shí)間記錄為潛伏期，電擊后返回明室記錄為1次錯(cuò)誤次數(shù)。電腦記錄5 min內(nèi)的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。手術(shù)后第5天進(jìn)行被動(dòng)回避記憶實(shí)驗(yàn)，取消暗室的電擊，記錄大鼠潛伏期(第1次)和錯(cuò)誤次數(shù)(5 min內(nèi))［16］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用方差分析，2組之間同一時(shí)間點(diǎn)的比較采用t檢驗(yàn)。描述性數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Med Associates軟件分析，在被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練中超過100 s未進(jìn)入黑暗箱探索的動(dòng)物視為無效數(shù)據(jù)，未計(jì)入最后數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。所有數(shù)據(jù)采用IBM公司SPSS 19.0軟件處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對全腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響

表1圖1顯示，由不參與大鼠分組的實(shí)驗(yàn)員對各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評估，各組在第1、3、5天計(jì)算評分結(jié)果。從結(jié)果可以看出，與Sham組比較，第1、3、5天Baicalin組與Saline-water組大鼠神經(jīng)功能障礙癥狀都更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.000，P=0.000)。但隨著術(shù)后時(shí)間的增加，各組分值都逐漸下降，癥狀都有所改善。第1天Baicalin組大鼠神經(jīng)功能評分與Saline-water組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第3天、第5天Baicalin組大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于Saline-water組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.162，P=0.005;t=3.796，P=0.001)。

2.2 黃芩苷對全腦缺血/再灌注損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

各組被動(dòng)回避訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)記錄結(jié)果顯示(表2、圖2、表3、圖3)。表3顯示，手術(shù)后1～4 d每日被動(dòng)回避訓(xùn)練結(jié)果表明，全腦缺血/再灌注手術(shù)明顯引發(fā)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。第2天訓(xùn)練結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，Saline-water組和Baicalin組大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期均縮短(P=0.032，P=0.045)，錯(cuò)誤次數(shù)均明顯增多(P=0.027，P=0.125)。但隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組的平均潛伏期均縮短，且Sham組和Baicalin組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均潛伏期縮短程度顯著，Saline-water組不顯著(Sham組:F= 18.395，P=0.000;Saline-water組:F=2.656，P= 0.063;Baicalin組:F=9.841，P=0.000);各組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的錯(cuò)誤次數(shù)均減少顯著(Sham組:F= 38.19，P=0.000;Saline-water組:F=7.757，P= 0.000;Baicalin組:F=10.82，P=0.000)。表3顯示，第5天被動(dòng)回避記憶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于Saline-water組，Baicalin組潛伏期顯著延長(t= 2.284，P=0.028)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(t=4.427，P =0.000)。

表1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響(±s)

表1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數(shù)Score day 1 day 3 day 5 Sham 10 2.9±0.6 2.3±0.4 2.3±0.7 Saline-water 10 4.2±0.6＊＊ 4.0±0.3＊＊ 3.7±0.5＊＊Baicalin 10 4.0±0.3＊＊ 3.5±0.4＊＊ΔΔ 3.0±0.3＊＊ΔΔ

圖1 黃芩苷對缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能的影響(±s，n=10)

2.3 黃芩苷對全腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

表5圖4、5顯示免疫組化檢測模型大鼠海馬齒狀回(DG)區(qū)Brdu陽性細(xì)胞結(jié)果，假手術(shù)組(Sham)僅見少量Brdu陽性細(xì)胞，隨術(shù)后時(shí)間增長未見陽性細(xì)胞增加;表5、圖4、5顯示，術(shù)后第4天模型大鼠的組化結(jié)果顯示，Baicalin組及 Saline-water組的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較均顯著增加(P= 0.002，P=0.000)，且Baicalin組的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于Saline-water組(P=0.000)。術(shù)后第8天免疫組化結(jié)果表明，各組Brdu陽性細(xì)胞相比于第4天有所減少，但 Baicalin組及 Saline-water組的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)差異仍顯著(P=0.004)。

表2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s)

表2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s)

注:與 sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數(shù)day 1 day 2 day 3 day4 Sham 10 32±11.43 48±11.72 58±14.42 77±17.20 Saline-water 10 33± 9.50 37± 8.50*40±10.3* 44± 7.60＊＊Baicalin 10 32± 5.44 38± 7.20* 43±15.40*Δ55± 8.30＊＊ΔΔ

圖2 各組大鼠的逃避潛伏期(±s，n=10)

表3 各組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)(±s)

表3 各組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)(±s)

注:與 sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數(shù)day 1 day 2 day 3 day4 Sham 10 5.8±1.20 3.0±1.42 1.90±0.72 1.3±0.44 Saline-water 10 5.5±1.62 4.7±1.77* 3.9±0.50＊＊ 2.8±0.92＊＊Baicalin 10 5.0±1.35 4.2±1.42 3.5±1.25* 2.0±0.77*Δ

圖3 各組大鼠的錯(cuò)誤次數(shù)(±s，n=10)

表4 各組大鼠記憶測試的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)(±s)

表4 各組大鼠記憶測試的潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)(±s)

注:與sham組比較:*P＜0.05:＊＊P＜0.01;與 Saline-water組比較:ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

組 別 鼠數(shù)Item escape latency error time Sham 10 80±13.2 1.3±0.4 Saline-water 10 52±10.6＊＊ 2.9±0.3＊＊Baicalin 10 65±13.6＊＊Δ 2.2±0.4＊＊ΔΔ

2.4 黃芩苷對模型大鼠海馬區(qū)COX-2蛋白表達(dá)變化的影響

圖6、7顯示，手術(shù)后第 2天，Baicalin組及Saline-water組COX-2蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著增加(P=0.001，P=0.000)。黃芩苷灌胃后，Baicalin組 COX-2蛋白的表達(dá)水平較 Saline-water組明顯降低(P=0.016)。

表5 BrdU標(biāo)記術(shù)后大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細(xì)胞數(shù)

圖4 BrdU標(biāo)記術(shù)后大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細(xì)胞數(shù)

圖5 BrdU標(biāo)記術(shù)后第4天模型大鼠在海馬齒狀區(qū)的增殖細(xì)胞(×200)

圖6 免疫印跡檢測術(shù)后第2天模型大鼠海馬COX-2蛋白表達(dá)

3 討論

圖7 免疫印跡檢測術(shù)后第2天模型大鼠海馬COX-2蛋白表達(dá)

藥理學(xué)研究明確了黃芩中活性成分黃芩苷具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等作用［17］。石田寅夫等［18］用黃芩苷處理Wistar大鼠缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞后，能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移，說明黃芩苷具有促進(jìn)神經(jīng)分化的潛在能力。上述信息提示我們，黃芩苷對腦缺血所致腦組織損傷及病理變化可能有良好的干預(yù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了全腦缺血/再灌注大鼠模型，探討黃芩苷胃灌注模型大鼠是否對全腦缺血/再灌注造成的腦損傷具有保護(hù)作用，并具體探討黃芩苷是否對腦損傷后的大鼠動(dòng)物行為和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖有影響。

全腦缺血/再灌注手術(shù)通常都會(huì)造成不同等級的神經(jīng)功能損傷，主要損傷部位一般為海馬區(qū)，其主要表現(xiàn)是以記憶力下降為主的認(rèn)知和學(xué)習(xí)功能障礙［2］。因此，本研究首先對各組模型大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評估，結(jié)合被動(dòng)避害實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷對腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力是否有改善作用。動(dòng)物行為學(xué)評估結(jié)果表明，與Sham組比較，Baicalin組與Saline-water組大鼠神經(jīng)功能障礙癥狀都更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P= 0.000)，表明手術(shù)過程造成了顯著的腦損傷。第3天、第5天Baicalin組大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于Saline-water組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.162，P= 0.005，t=3.796，P=0.001)，提示黃芩苷胃灌注對腦損傷有干預(yù)作用。被動(dòng)避害訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Saline-water組和Baicalin組大鼠進(jìn)入暗室的潛伏期均縮短(P=0.032;P=0.045)，錯(cuò)誤次數(shù)均明顯增多(P=0.027;P=0.125)，表明腦缺血對大鼠的神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)能力造成顯著傷害。但隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，各組的平均潛伏期均縮短，且Sham組和Baicalin組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均潛伏期縮短程度顯著，Saline-water組不顯著(Sham組:F=18.395，P= 0.000;Saline-water組:F=2.656，P=0.063;Baicalin組:F=9.841，P=0.000);各組4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的錯(cuò)誤次數(shù)均減少顯著(Sham組:F=38.19，P=0.000; Saline-water組:F=7.757，P=0.000;Baicalin組:F =10.82，P=0.000)。以上結(jié)果提示，黃芩苷胃灌注對腦缺血再灌注腦損傷大鼠所致神經(jīng)功能障礙和學(xué)習(xí)記憶功能障礙有一定的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用可能來源于黃芩苷能夠更好地刺激腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，促進(jìn)新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，使得受損傷的神經(jīng)元功能獲得補(bǔ)償。

為探討黃芩苷是否能夠促進(jìn)腦缺血損傷大腦內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，本研究采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)腹腔注射，標(biāo)記手術(shù)后第2、4、6天后大鼠海馬DG區(qū)新生的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量。假手術(shù)組(Sham)僅見少量 Brdu陽性細(xì)胞;術(shù)后第4天模型大鼠的組化結(jié)果顯示，Baicalin組及Saline-water組的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較均顯著增加(P =0.002)，且Baicalin組Brdu陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于Saline-water組(P=0.000)。術(shù)后第8天免疫組化結(jié)果表明，各組Brdu陽性細(xì)胞相比于第4天有所減少，但Baicalin組及Saline-water組的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)差異仍顯著(P=0.004)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷灌胃促進(jìn)了腦缺血損傷后海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的新生。國外研究發(fā)現(xiàn)，COX-2蛋白的表達(dá)可能與抑制神經(jīng)干細(xì)胞的新生、降低再生細(xì)胞的存活率機(jī)制有關(guān)［8，19-20］。為探討本實(shí)驗(yàn)中海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞新生受促進(jìn)的可能機(jī)制，本研究采用免疫印跡法檢測了術(shù)后第2天腦組織COX-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，Baicalin組及Saline-water組COX-2蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著增加(P=0.001;P= 0.000)，黃芩苷灌胃后，Baicalin組COX-2蛋白的表達(dá)水平較Saline-water組明顯降低(P=0.016)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)假設(shè)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，黃芩苷可能是通過抑制全腦缺血/再灌注損傷后COX-2蛋白的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而改善海馬腦區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞再生的環(huán)境。這種環(huán)境改善可能進(jìn)一步激發(fā)了神經(jīng)干細(xì)胞的再生，使得新生神經(jīng)元數(shù)量增加，補(bǔ)償了損傷神經(jīng)元的功能，從而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，本研究在建立全腦缺血/再灌注大鼠模型后，通過胃灌注黃芩苷對模型大鼠進(jìn)行干預(yù)發(fā)現(xiàn)，黃芩苷對全腦缺血/再灌注大鼠具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，具體表現(xiàn)為可以改善模型大鼠的神經(jīng)功能損傷和認(rèn)知功能障礙，提高學(xué)習(xí)記憶能力，增加內(nèi)源性海馬區(qū)新生神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量。由于在腦損傷模型建立后，很快出現(xiàn)COX-2表達(dá)升高，且Salinewater組明顯高于Baicalin組。提示我們黃芩苷可能是通過降低腦損傷后COX-2的表達(dá)來抑制炎癥發(fā)生。新生干細(xì)胞數(shù)量增加可能源于炎癥反應(yīng)受抑制，神經(jīng)干細(xì)胞小生境得到改善，從而表現(xiàn)為模型大鼠的神經(jīng)功能障礙和認(rèn)知能力損傷得到改善。但本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)尚有不足之處，未涉及黃芩苷給藥劑量和時(shí)效研究;未能系統(tǒng)探討黃芩苷對新生干細(xì)胞的遷移、分化及長期存活狀況的影響;不確定黃芩苷是僅僅促進(jìn)了內(nèi)源干細(xì)胞的新生，還是同時(shí)也增加了新生干細(xì)胞存活率，還是兩者兼有。本實(shí)驗(yàn)結(jié)論仍需進(jìn)一步探究。

［1］Nikonenko AG，Radenovic L，Andjus PR，et al.Structural Features of Ischemic Damage in the Hippocampus［J］.The AnatomicalRecord:Advancesin IntegrativeAnatomyand Evolutionary Biology，2009，292:1914-1921.

［2］Nakatomi H，Kuriu T，Okabe S，et al.Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain injury by recruitment of endogenous neural progenitors［J］.Cell，2002，110:429-441.

［3］Iadecola C，Alexander M.Cerebral ischemia and inflammation［J］.Curr Opin Neurol，2001，14:89-94.

［4］Lakhan SE，Kirchgessner A，Hofer M.Inflammatory mechanisms in ischemic stroke:therapeutic approaches［J］.J Transl Med，2009，7:97.

［5］Cheng O，Ostrowski RP，Wu B，et al.Cyclooxygenase-2 mediates hyperbaric oxygen preconditioning in the rat model of transient global cerebral ischemia［J］.Stroke，2011，42:484-490.

［6］BastosGN， Moriya T， InuiF， etal.Involvementof cyclooxygenase-2 in lipopolysaccharide-induced impairment of the newborn cell survival in the adult mouse dentate gyrus［J］.Neuroscience，2008，155:454-462.

［7］Hallbergson AF，Gnatenco C，Peterson DA.Neurogenesis and brain injury:managing a renewable resource for repair［J］.J Clin Invest，2003，112:1128-1133.

［8］Zhang R，Zhang Z，Zhang C，et al.Stroke transiently increases subventricular zone cell division from asymmetric to symmetric and increases neuronal differentiation in the adult rat［J］.J Neurosci，2004，24:5810-5815.

［9］曹慧娟，鄢云彪，戴建業(yè)，等.黃芩苷對人肺腺癌A549細(xì)胞的體內(nèi)外研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(13): 216-220.

［10］CHEN Bu-yuan，胡建達(dá)，CHEN Xin-ji，等.黃芩苷對HL-60白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用［J］.中國病理生理雜志，2008，24(8):1518-1520.

［11］崔猛，馮世慶，范寧建，等.黃芩苷下調(diào)p-STAT3誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化［J］.天津醫(yī)藥，2013，8:786-788.

［12］莊朋偉，張艷軍，龐坦，等.黃芩苷作用于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(1):43-47.

［13］方瑗，童萼塘，孫圣剛，等.大鼠腦缺血再灌流后HSP70的表達(dá)和bFGF對其影響［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2000，13 (4):198-200.

［14］Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat［J］.Stroke，1979，10:267-272.

［15］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17:472-476.

［16］王樹，薛貴平，張丹參，等.大黃酚對腦缺血再灌注小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙及耐缺氧的影響［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008，37 (4):402-404.

［17］宋揚(yáng)文，陳忻.中藥黃芩藥理作用的研究進(jìn)展［J］.中國中醫(yī)藥科技，2010，17(4):375-376.

［18］石田寅夫，徐強(qiáng)，姜希娟，等.黃芩苷干預(yù)缺氧星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)前體細(xì)胞遷移的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2007，24 (5):422-426.

［19］Goncalves MB，Williams E-J，Yip P，et al.The COX-2 inhibitors，meloxicam and nimesulide，suppress neurogenesis in the adult mouse brain［J］.British Journal of Pharmacology，2010，159:1118-1125.

［20］Sharma V，Dixit D，Ghosh S，et al.COX-2 regulates the proliferation of glioma stem like cells［J］.Neurochem Int，2011，59:567-571.

Effect of Baicalin on COX-2 Expression and Proliferation of Meural Stem Cells in Hippocampus of Rats after Cerebral Ischemia and Its Possible Mechanism

WANG Hai-Jun
(No.1 afficiated Hospital，Qiqiha'er Medical College，Qiqiha'er 161041，China)

To investigate the effects of baicalin on animal behavior，proliferation of endogenous neural stem cells and COX-2 gene expression in hippocampus of rats after global cerebral ischemia/reperfusion injury and the probable mechanism involved.Methods:Eighty-four Wistar rats weighting 250-300 g were randomized into three experimental groups (n=28):Sham operation group(Sham);Intragastric administration of Baicalin after global cerebral ischemia/reperfusion surgery group(Baicalin);Intragastric administration of Saline-water after global cerebral ischemia/reperfusion surgery group(Saline-water).Model of global cerebral ischemia/reperfusion was established according to Pulsinelli method.Bederson neurological grading score system，passive avoidance test，immunohistochemistry analysis，western blot analysis were used to detect the effects of baicalin on rat neurological function，learning and memory capacity，endogenous neural stem cell proliferation as well as the protein expression of COX-2 after surgery.Results:Compared with the Sham group，the improvement of neurological dysfunction of rats in Baicalin group and Saline-water group were more pronounced，and the difference was significant;escape latency were shorter，number of errors were significantly increased;the number of Brdu positive cells in the hippocampus were significantly increased;expression of COX-2 protein was significantly increased in rat brain tissue.Compared with Saline-water group，intragastric administration Brdu in Baicalin group significantly improved the neurological damage;escape latency was significantly increased and also significantly reduced the number of errors;The number Brdu positive cells in Baicalin group was significantly higher than that in Saline-water group;expression of COX-2 protein in Baicalin group was significantly lower.Conclusions:Baicalin has a significant protective effect on global cerebral ischemia/reperfusion injury in rats，which may be related with reducing the COX-2 gene expression.The inhibition of inflammation，thereby，improved the endogenous neural stem cell niche，promoted the proliferation or survival rate of endogenous neural stem cells

Baicalin;Neurological dysfunction;Passive avoidance test;Endogenous neural stem cells;COX-2

R285.5

B

1006-3250(2015)06-0660-05

2015-04-26

黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(12531825)

王海軍(1975-)男，黑龍江安達(dá)人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)病學(xué)的臨床與研究。