艾灸對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、GSK-3β和磷酸化tau蛋白的影響*

王靜蓉，張玉杰，姜美馳，梁 靜，許建陽△，黃漢昌，姜招峰

(1．遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001;2．武警總醫(yī)院，北京 100039; 3．北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

艾灸對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、GSK-3β和磷酸化tau蛋白的影響*

王靜蓉1，張玉杰1，姜美馳1，梁 靜2，許建陽2△，黃漢昌3，姜招峰3

(1．遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001;2．武警總醫(yī)院，北京 100039; 3．北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

目的:探討艾灸防治阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)的作用及其機(jī)制。方法:大鼠雙側(cè)腦室微量注射STZ造模，術(shù)后第10天艾灸組灸“關(guān)元”“長強(qiáng)”“命門”“百會”，同時西藥對照組灌胃鹽酸多奈哌齊，治療30 d后用Morris水迷宮測各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，再取材用ELISA法、免疫組織化學(xué)、Western blot等檢測海馬區(qū)GSK-3β活性及tau蛋白磷酸化位點(Ser396/ Thr231)的含量和表達(dá)水平。結(jié)果:艾灸組與西藥對照組較模型組平均游泳距離百分比上升;與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常，陽性染色深，而艾灸組與西藥對照組較模型組形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，陽性染色淺;除假手術(shù)組外，GSK-3β活性及磷酸化tau蛋白Ser396、thr231位點相對表達(dá)量均升高，且西藥對照組和艾灸組低于模型組。結(jié)論:艾灸可部分改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶，其可能通過抑制海馬GSK-3β活性，降低p-tau S396、T231的磷酸化水平起到防治AD的作用，且作用效果與西藥鹽酸多奈哌齊相同。

阿爾茨海默;艾灸;鏈脲佐菌素GSK-3β;Ser396;Thr231

阿爾茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一種臨床常見神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以認(rèn)知功能障礙為臨床特點，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降等，常起病隱匿，病情呈進(jìn)行性加重。其主要病理特征是Aβ沉積形成的老年斑(SP)和過度磷酸化Tau蛋白導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié) (NFT)［1］。關(guān)于AD早期的發(fā)病機(jī)制有許多假說，其中Tau蛋白學(xué)說是目前研究導(dǎo)致AD發(fā)病的主要機(jī)制之一，即正常結(jié)構(gòu)的Tau蛋白原本是穩(wěn)定細(xì)胞骨架的重要成分，由于各種原因誘使tau蛋白異常過度磷酸化后，導(dǎo)致正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，極易形成NFT，最終促成AD。而GSK-3β能調(diào)控磷酸化tau蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而影響AD的發(fā)生發(fā)展。

對已形成的病理產(chǎn)物不易消除是導(dǎo)致臨床中晚期AD治療花費大、收效差和致死率高的重要原因，故現(xiàn)代研究把目光轉(zhuǎn)向AD的早期防治。

艾灸“治未病”在防治老年癡呆、改善認(rèn)知方面有較好的臨床療效［2-3］。近年來，一些研究［4-5］從神經(jīng)突觸可塑性、熱休克蛋白等方面研究艾灸防治AD的機(jī)理。但其對AD大鼠海馬內(nèi)tau蛋白磷酸化水平等方面有何影響且作用機(jī)制如何尚未清晰。因此，本文用STZ側(cè)腦室注射造模、早期介入艾灸干預(yù)，以期從干預(yù)后大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬內(nèi)GSK-3β活性、p-tau S396、T231的表達(dá)情況，探討艾灸對防治AD的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取2月齡雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量(300±30)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組12只，手術(shù)組48只。術(shù)后觀察9 d，去除死亡大鼠12只，其余36只手術(shù)傷口愈合良好，飲食水及二便正常，再利用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、西藥對照組和艾灸組，每組各12只。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素STZ(sigma);GSK-3β ELISA試劑盒(北京普爾偉業(yè));抗體 :GSK3-β、p-tau S396、T231、β-Actin(Abcam);BCA蛋白定量試劑盒與HRP山羊抗兔IgG(H+L)二抗(鼎國昌盛);超敏型二步法檢測試劑盒(中杉金橋)及艾絨等大鼠腦立體定位儀(瑞沃德);微量注射器(hamilton);Morris水迷宮，Noldus EhonVision圖像采集分析系統(tǒng);酶標(biāo)儀(Bio-tek);電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad);ECL凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare);電泳成像分析系統(tǒng)Image Quant RTECL(BD Bioscience);倒置顯微鏡(olympus);切片機(jī)、包埋機(jī)(Leica)及樂灸牌艾條機(jī)等。

1.3 造模

所有大鼠經(jīng)10%水合氯醛(3.5～4.5 mL/kg)麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上，常規(guī)消毒，正中矢狀位切開分離骨膜，牙科鉆鉆開顱骨暴露前后囟。除假手術(shù)組外，其余3組用雙側(cè)側(cè)腦室各注射STZ約10 μL(3 mg/kg，注射前將STZ溶于檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液，濃度為0.1 mol/L，pH=4.2～4.4)。參考《大鼠腦立體定向圖譜》［6］確定打孔點坐標(biāo):前囟后1.5 mm，矢狀縫左右旁開1.5 mm，腦表面下3.5 mm。注射后留針5 min緩慢出針?？p合創(chuàng)口處滴青霉素。第3天重復(fù)注射(劑量同前)。假手術(shù)組以等量檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液替代STZ。術(shù)后禁食24 h后，恢復(fù)常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)5 d肌注慶大霉素3 U/d，以防感染。

1.4 干預(yù)

術(shù)后觀察9 d，從第10天開始干預(yù)。艾灸組治療時將大鼠從籠內(nèi)輕輕取出，注意動作柔和，避免驚嚇，用柔軟透氣性好且避光的布巾輕緩裹住大鼠頭部，待其消除恐懼感后，無須強(qiáng)行固定，將其仰面安靠在灸臺的海綿墊上，整個過程大鼠處于清醒狀態(tài)，只由1人獨立操作以減少干擾，有利于保持大鼠施灸狀態(tài)平穩(wěn)。具體施灸方法，圖1所示，以左手虎口，左手大拇指、食指、中指三指適度卡住大鼠頭、頸、肩，另一只手持特制細(xì)艾條取腹部“關(guān)元”穴，懸灸距皮膚3～4 cm，穴位皮膚溫度保持(37±2)℃之間，15 min/次，然后撤去艾條，將其輕輕翻轉(zhuǎn)成俯臥位，此時若大鼠受驚，稍加撫慰待其狀態(tài)恢復(fù)平靜再按次序施灸于“長強(qiáng)”、“命門”、“百會”，每次灸時分別為長強(qiáng)、命門各7 min，百會3 mim，具體操作以皮下溫?zé)嵝游锊粺┰餅槎龋? d灸，10次為1個療程，共30 d。艾灸條均為艾條機(jī)手工壓制，直徑1 cm，艾絨凈重(5.5 g±0.2)g/支;西藥對照組給予鹽酸多奈哌齊混懸液進(jìn)行灌胃，其中鹽酸多奈哌齊按1 mg/kg計算用藥量，每日1次，每次灌胃量不超過3 ml共30次;假手術(shù)組、模型組不處理。

圖1 小白鼠施灸方法

1.5 Morris水迷宮行為學(xué)檢測

治療30 d后的第2天開始定位航行實驗。平臺隨機(jī)固定于某一象限內(nèi)不動，在每個象限邊緣取1個起始點，每次訓(xùn)練選1個不同起始點，將大鼠頭沖上、面向池壁放入池內(nèi)，以大鼠找到平臺并在臺上停留3 s記為1次訓(xùn)練結(jié)束時的潛伏期，若大鼠在120 s內(nèi)找不到平臺，將其引導(dǎo)至平臺上，潛伏期記為120 s。之后大鼠停留在平臺30 s，用以記憶空間。每天訓(xùn)練分上、下午各2次，分別從上午8點和下午1點開始訓(xùn)練，每只大鼠每天共訓(xùn)練4次，實驗共歷時4 d。

1.6 腦組織樣品處理

測試結(jié)束后的第2天將大鼠斷頭取腦，冰上快速分離左右半腦，一半腦置于4%多聚甲醛固定48 h后常規(guī)石蠟包埋，另一半取海馬組織放入凍存管中，置于液氮罐中速凍，然后轉(zhuǎn)移到－80℃冰箱中備用。

1.7 指標(biāo)檢測

1.7.1 成像系統(tǒng)自動記錄定位航行 實驗中每組12只大鼠每天4次檢測訓(xùn)練的潛伏期及游泳距離百分比，取其平均值作為大鼠平均潛伏期和平均游泳距離百分比。

1.7.2 ELISA法檢測大鼠海馬GSK-3β活性

每組隨機(jī)取6只大鼠海馬組織冰上研磨，充分裂解、勻漿、離心取上清，按試劑盒操作測出樣品吸光度值，再計算出GSK-3β的活性量。

1.7.3 免疫組化 將蠟塊連續(xù)切片，片厚5μm，每隔20張取1張做HE染色，根據(jù)染色結(jié)果選取相同位置的海馬進(jìn)行免疫組化染色。其中滴加一抗?jié)舛确謩e為 p-tauT231 1∶100、p-tau S396 1∶800，陰性對照加PBS。在400倍鏡下觀察比較各組海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)變化以及抗體陽性染色情況。

1.7.4 免疫印跡 每組隨機(jī)選6個樣本分別檢測p-tauT231、S396的表達(dá)量，每個樣品重復(fù)測3次，取3次平均值作為結(jié)果;采用Quantity One電泳圖像分析軟件分析所采集的條帶灰度值，并以目標(biāo)條帶灰度值比上內(nèi)參β-actin條帶灰度值，表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析;組間兩兩比較，方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時采用Dunnett’s T3檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 定位航行實驗結(jié)果

表1顯示，模型組大鼠平均潛伏期較假手術(shù)組延長，平均游過平臺象限距離與總距離百分比下降(均P＜0.05)，說明模型制作是成功的，造模后大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力被明顯破壞;與模型組比較，西藥對照組平均潛伏期比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但平均游泳距離百分比有所上升(P＜0.05)，且艾灸組與西藥對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明艾灸和鹽酸多奈哌齊均能部分抑制學(xué)習(xí)記憶的損傷，起到相同的治療作用。

2.2 大鼠海馬GSK-3β活性

與假手術(shù)組比較，各組大鼠海馬組織 GSK-3β活性均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均 P＜0.05);與模型組比較，西藥對照組和艾灸組大鼠海馬組織GSK-3β活性均下降，且西藥對照組低于艾灸組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

圖2顯示，400倍光鏡下各組大鼠海馬區(qū)均可見棕褐色陽性表達(dá)，反應(yīng)部位主要位于細(xì)胞膜，細(xì)胞核呈陰性。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞排列松散，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞體縮小，部分胞核固縮，突起縮短，出現(xiàn)斷裂甚至消失，表達(dá)的陽性細(xì)胞著色深，說明造模后損傷大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞且導(dǎo)致tau蛋白位點S396、T231表達(dá)水平升高;與模型組比較，西藥對照組、艾灸組的椎體細(xì)胞排列較緊密，結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞膜、核膜清晰，體積較大，陽性細(xì)胞染色淡，說明2種治療均能一定程度保護(hù)CA1區(qū)椎體細(xì)胞受損，并降低p-tauT231、S396的表達(dá)。

圖2 A1-D1 4組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞p-tauT231陽性細(xì)胞表達(dá)(DAB顯色×400，箭頭示p-tauT231陽性細(xì)胞)A2-D2 4組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞p-tauS396陽性細(xì)胞表達(dá)(DAB顯色 ×400，箭頭示p-tauS396陽性細(xì)胞)

2.4 Western blot檢測結(jié)果

圖3顯示，模型組大鼠海馬p-tauT231、S396條帶較假手術(shù)組明顯增粗且顏色濃，提示模型組該蛋白位點的表達(dá)量升高;與模型組比較，西藥對照組、艾灸組條帶細(xì)且顏色淡，提示治療后2組大鼠海馬的蛋白位點表達(dá)量下降。這與p-tauT231、S396蛋白相對表達(dá)量比較(見表1)結(jié)果相符，說明艾灸與鹽酸多奈哌齊均能一定程度上抑制AD大鼠海馬內(nèi)p-tauT231、S396的磷酸化水平。

圖3 Western blotting檢測p-tau T231、S396抗體顯影條帶

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果、海馬區(qū)GSK-3β活性及p-tauT231、S396蛋白相對表達(dá)量比較(±s，均n潛伏期=n距離百分比=12，nGSK-3 β=6，nT231=nS396=3)

表1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果、海馬區(qū)GSK-3β活性及p-tauT231、S396蛋白相對表達(dá)量比較(±s，均n潛伏期=n距離百分比=12，nGSK-3 β=6，nT231=nS396=3)

注:與假手術(shù)組比較:#P＜0.05;與模型組比較:*P＜0.05，☆P＞0.05;與對照組比較:▲P＞0.05，△P＜0.05

組別 平均潛伏期(s)平均游泳距離百分比(%) ELISA Western blot GSK-3β(ng/ml)T231 S396 假 手 術(shù) 組 49.64±3.59 38.25±6.11 0.12±0.05 0.23±0.10 0.26±0.09 模 型 組 69.55±4.43 26.47±1.51 0.33±0.19 0.76±0.21 0.77±0.18 對 照 組 60.42±11.76#☆30.29±4.18#*0.21±0.10#*0.34±0.10#*0.40±0.09#*艾 灸 組 70.67± 5.84#▲31.18±4.87#▲0.25±0.14#△0.58±0.12#△0.63±0.07#△

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》有云:“人始生，先成精，精成而腦髓生。”腎精主人之生長壯老已，且精生髓化?！吨形鲄R通醫(yī)經(jīng)精義》云:“腎系貫脊，通于脊髓，腎精足，則入脊化髓上循入腦而為腦髓，是髓者精氣之所會也?！庇帧端貑枴す峭ㄕ摗吩?“督脈者，起于少腹之下……貫脊屬腎……上額交顛，入絡(luò)腦?！笨梢?，腎與腦髓通過督脈相聯(lián)系［7］。任督二脈均起自胞中，又相交于腦，陰陽環(huán)抱，為腎所主，故腦髓之病變可論及腎與任督二脈。

老年癡呆是以腎精虧虛、腦髓失養(yǎng)為病理基礎(chǔ)，陽氣虛為發(fā)病機(jī)制的退行性?。?］。故利用艾灸溫陽通補(bǔ)的特性，從腎及任督脈論治癡呆。關(guān)元乃任脈經(jīng)穴，足三陰經(jīng)與任脈之會，溫腎固精，培元固本;長強(qiáng)在督脈之端，通于任脈，可調(diào)和陰陽、調(diào)任督之氣;命門補(bǔ)腎益陽;百會位居巔頂，為諸陽之會，可升提陽氣，醒腦益智。故艾灸選穴關(guān)元、命門陰陽相濟(jì)，百會、長強(qiáng)高下相合，寓“陰中求陽，陽中求陰”之意，奏“補(bǔ)腎溫陽，益智通髓”之功。

“灸”為“久火”，顧名思義是一種以溫?zé)岽碳樘厣闹嗅t(yī)常用的治病保健療法。施灸時通過艾燃燒產(chǎn)生熱量，不僅能引起局部組織溫度升高同時還伴隨產(chǎn)生整體生物效應(yīng)，其主要以紅外輻射的方式傳遞到治療部位［9］從而發(fā)揮治療作用。它能顯著提高治療局部與機(jī)體整體的能量代謝［10］，可為能量缺乏的病態(tài)細(xì)胞提供活化能［11］。

本文關(guān)于灸法的定量標(biāo)準(zhǔn)做以下相關(guān)研究:

許培昌［12］等指出，灸距以3～4 cm為宜，若距離太近，隨灸時延長局部皮溫過高而灼傷。本實驗大鼠皮毛較厚散熱緩慢，經(jīng)反復(fù)測試后采用灸質(zhì)量(5.5±0.5)g、直徑1 cm的特制細(xì)艾條燃燒時，灸距保持在3～4 cm處，穴位表面的溫度保持在(37± 2)℃，大鼠能長時間保持安靜不煩燥，這構(gòu)成本次研究中艾灸持續(xù)穩(wěn)定作用于實驗對象的前提。

又以王悅同［13］等研究提出不同穴位應(yīng)采用不同灸時的理論為指導(dǎo)，在反復(fù)測試中發(fā)現(xiàn)隨灸穴位置深度不同，灸至相應(yīng)時間后熱度可透至皮下穴位處，且大鼠對艾灸的耐受度與穴位特性有關(guān):關(guān)元位于腹部，定位較深，可灸15 min，長強(qiáng)、命門次之7min，百會位于頭頂皮膚下，為諸陽之會，不可過灸，3min為宜。灸之要氣至而有效，灸量不足達(dá)不到氣至的療效，灸量過大又會導(dǎo)致邪火內(nèi)郁，或直接灼傷陰津［14］，故隔2 d灸1次為好［15］。

臨床上，AD初期患者腦葡萄糖代謝和細(xì)胞能量產(chǎn)生明顯受損，并出現(xiàn)胰島素/胰島素受體(insulin/insulin receptor，I/IR)信號系統(tǒng)功能紊亂［16］，繼而引起tau蛋白過度磷酸化［17］。實驗研究證明，STZ側(cè)腦室注射后引起大鼠腦內(nèi)持久的葡萄糖和能量代謝障礙，并干擾I/IR系統(tǒng)，可以導(dǎo)致tau蛋白的異常磷酸化［18］。根據(jù)大鼠雙側(cè)側(cè)腦室微量STZ注射后第10天出現(xiàn)病理改變至第60天內(nèi)逐漸加重的情況［19］，我們在術(shù)后第10天開始干預(yù)，治療30 d后即術(shù)后第40天連續(xù)4 d用定位航行實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，測試結(jié)束第2天即術(shù)后第45天取材檢測海馬GSK-3β活性和p-tauT231、S396表達(dá)情況，旨在觀察AD發(fā)病早期用艾灸干預(yù)的療效。

AD的主要病理特征是SP與NFT。過度磷酸化tau蛋白是NFT的主要成分，其形成主要是由蛋白激酶催化的tau蛋白磷酸化與磷酸酯酶催化的去磷酸化之間失衡所致［20］。GSK-3β是神經(jīng)系統(tǒng)中催化tau蛋白磷酸化的三大蛋白激酶之一［21］，在腦組織中含量豐富。當(dāng)GSK-3β被過度激活，可催化一些參與調(diào)節(jié)tau蛋白微管結(jié)合活性的過度磷酸化位點如Ser396、Thr231［22-24］等。異常過度磷酸化的tau蛋白一方面失去催化微管裝配、穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)的生物效能，抑制tau蛋白與微管的結(jié)合，使正常細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)被破壞，易于聚集成直絲或雙螺旋細(xì)絲(PHF)進(jìn)一步纏繞形成NFT［25］;另一方面獲得崩解微管的毒性作用，引起胞體與軸突樹突之間的APP運(yùn)輸障礙［26］，使得神經(jīng)元突起末端的神經(jīng)元發(fā)生退行性病變［27］，導(dǎo)致Aβ沉積形成SP，最終與NFT共同促成AD的發(fā)生。

4 結(jié)論

本次研究結(jié)果顯示，在AD發(fā)病早期以艾灸任督二脈“補(bǔ)腎溫陽，益智通髓”的方法干預(yù)治療，能在一定程度上保護(hù)AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶，可能是通過抑制GSK-3β活性，進(jìn)而降低tau蛋白在Thr231、Ser396位點磷酸化水平的途徑來達(dá)到防治AD的效果。

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Effects of Moxibustion on the Alzheimer Disease Rat Models’Learning and Memory，GSK-3 Beta and Tau Protein Phosphorylation

WANG Jing-rong1，ZHANG Yu-jie1，JIANG Mei-chi1，LIANG Jing2，XU Jian-yang2△，HUANG Han-chang3，JIANG Zhao-feng3
(1．Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China;2．General Hospital of armed police forces Beijing 100039，China; 3．College of Applied and Science of Beijing Union University，Beijing 100191，China)

Objective To study the effect and mechanism of moxibustion for prevention and treatment of Alzheimer’s Disease(AD)．Methods:After making the AD model rats with a pair of lateral ventricle injection of STZ，we observe the rats’learning and memory by using Morris water maze，the activity of GSK-3 beta in rats hippocampus by ELISA and Tau protein phosphorylation sites(Ser396/Thr231)of content and expression by immunohistochemistry and Western blot technology．Results:The average swimming distance percentage of moxibustion group are more than model group; hippocampus CA1 in model group district vertebral body immune of staining shows cell form exception，positive cell staining deep while in two a treatment group cell form structure more full and positive staining shallower;GSK-3 Beta activity and the phosphate of Tau protein Ser396，thr231 bit points relative expression volume compared:while the model rose to the highest，control group decline below the moxibustion group and the moxibustion below the model．Conclusion:Moxibustion may partly improve learning and memory in AD rats，possibly through inhibition of hippocampal GSK-3β activities，decreased the phosphorylation of phosphorylation levels of Tau protein site Ser396/Thr231 so as to control AD．

Alzheimer disease;Moxibustion;STZ;GSK-3β;Ser396;Thr231

R245．81

B

1006-3250(2015)10-1287-04

2015-03-07

武警總部專項課題(2011003)

王靜蓉(1989-)，女，云南芒市人，醫(yī)學(xué)碩士，從事針灸中藥對腦功能的臨床與研究。

許建陽(1962-)，男，醫(yī)學(xué)博士后，博士研究生導(dǎo)師，從事針灸中藥對腦功能的臨床與研究，E-mail:xujianyang @sina．com。