海洋沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對(duì)芘和苯甲酸鈉脅迫的響應(yīng)＊

孫向楠 胡曉珂 王 慧

(1.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264003;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

隨著工業(yè)的發(fā)展和海上石油開(kāi)采運(yùn)輸?shù)然顒?dòng)的增多,大量多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)類物質(zhì)進(jìn)入海洋環(huán)境,這些多環(huán)芳烴極可能通過(guò)食物鏈富集作用危害人類健康(崔志松等,2006)。在海洋環(huán)境中,多環(huán)芳烴降解中很重要的一部分是由海洋特有的微生物來(lái)完成(Rehmann et al,1998)。高分子量的多環(huán)芳烴(含4個(gè)和4個(gè)以上芳香環(huán))通常是由一群微生物協(xié)同代謝完成(Juhasz et al,2000)。多環(huán)芳烴在微生物的一系列氧化酶和脫氫酶作用下,經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng),逐漸減少苯環(huán)數(shù)目,最終變?yōu)猷彵蕉姿帷⑧彵蕉?、龍膽酸等單苯環(huán)芳香族化合物,單苯環(huán)化合物再經(jīng)過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)。在多環(huán)芳烴中,芘是具有四個(gè)苯環(huán)連接的高分子量芳香烴代表,是致癌、致畸、致突變有害污染物。已報(bào)告能夠降解芘的菌屬包括,分支桿菌屬(Mycobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等(Rehmann et al,1998)。其中分支桿菌屬(Mycobacterium)一些菌株能夠在添加營(yíng)養(yǎng)鹽的礦物培養(yǎng)基中礦化芘(Heitkamp et al,1988)。

苯甲酸是多種芳香族化合物生物代謝的中間產(chǎn)物,是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物,常存在于化工、食品和醫(yī)藥工業(yè)廢水中并廣泛應(yīng)用于塑料、染料和醫(yī)藥工業(yè)等方面,對(duì)人類健康有害(Parales et al,2002;張曉云等,2012)。在自然界中,微生物能夠通過(guò)好氧和厭氧途徑降解苯甲酸類化合物。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多細(xì)菌能夠降解苯甲酸鈉,例如,鹽單胞菌屬(Halomonas)(Oie et al,2007)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)(Collier et al,1997;Kim et al,2003)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)(Geissler et al,1988)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(Parsek et al,1992)都有能夠降解苯甲酸細(xì)菌的報(bào)道。

芘是多環(huán)芳烴上游代謝途徑的代表化合物,因其分子親脂性、低水溶性、低生物可利用性、高穩(wěn)定性等,造成的環(huán)境污染較難消除。在一系列的脫氫酶、加氧酶的作用下,芘分子逐步加氫、氧化將苯環(huán)打開(kāi),形成一系列低分子量的苯環(huán)類化合物,進(jìn)而開(kāi)環(huán)進(jìn)入中心代謝途徑。苯甲酸鈉是只有一個(gè)苯環(huán)的化合物,相比于芘更容易被微生物降解進(jìn)入下游相關(guān)代謝途徑,隨后進(jìn)入三羧酸循環(huán)。通過(guò)比較芘和苯甲酸鈉對(duì)環(huán)境中菌群的影響,可以初步分析得出在多環(huán)芳烴降解上游代謝途徑和下游代謝途徑中微生物群落組成的差異。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下,向海洋沉積物樣品中添加芘和苯甲酸鈉,研究芘和苯甲酸鈉脅迫下沉積物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化特征,初步分析海洋沉積物中微生物群落對(duì)不同芳香族類化合物的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

海底表層沉積物樣品于2013年9月采集于龍口港(37°39′N,120°18′E),采集后的樣品 4°C 冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室,4°C保存。

1.2 樣品處理

實(shí)驗(yàn)組1(P1,P2): 稱取5g沉積物樣品加入編號(hào)為P1,P2的250mL三角瓶,添加0.1g芘及100mL滅菌海水;

實(shí)驗(yàn)組2(B1,B2): 稱取5g沉積物樣品加入編號(hào)為B1,B2的250mL三角瓶,添加0.2g的苯甲酸鈉及100mL滅菌海水;

生物對(duì)照組(Y1,Y2): 在編號(hào)為Y1,Y2的250mL三角瓶中加入5g沉積物樣品及100mL滅菌海水;

化學(xué)對(duì)照組1(Pa,Pb): 在編號(hào)為Pa,Pb的250mL三角瓶中加入0.1g芘及100mL滅菌海水;

化學(xué)對(duì)照組2(Ba,Bb): 在編號(hào)為Pa,Pb的250mL三角瓶中加入0.2g的苯甲酸鈉及100mL滅菌海水;

將實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、生物對(duì)照組、化學(xué)對(duì)照組1、化學(xué)對(duì)照組2放置于30°C水平搖床,180r/min,連續(xù)培養(yǎng) 15天。生物對(duì)照組用于與實(shí)驗(yàn)組 1、實(shí)驗(yàn)組2比較細(xì)菌群落的變化;化學(xué)對(duì)照組用于與實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2比較實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)芘、苯甲酸鈉的殘留。

1.3 基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),分別從P1,P2,B1,B2,Y1,Y2樣品瓶中取少量沉積物,6000g離心收集沉積物及菌體。應(yīng)用PowerSoil?DNA 提 取 試 劑 盒 (MoBio Laboratories,Solana Beach,USA)提取環(huán)境基因組DNA。Nanodrop(NanoDrop 2000/2000C,Thermo Scientific,USA)對(duì)所提取的 DNA樣品進(jìn)行定量分析,所有樣品濃度均大于10 ng/μL,OD260/OD280均大于 1.8。其中Y1,Y2樣品為無(wú)底物脅迫的樣品;P1,P2為添加芘脅迫的樣品;B1,B2為添加苯甲酸鈉脅迫的樣品。

1.4 Illumina Miseq測(cè)序分析

委托上海翰宇生物科技有限公司,在上海人類基因組研究中心基因組測(cè)序部使用Illumina Miseq儀器(美國(guó))進(jìn)行測(cè)序。以檢測(cè)合格DNA樣本為模板,以設(shè)計(jì)好含有標(biāo)簽接頭的引物V3-F: TACGGRAGGCA GCAG;V4-R: AGGGTATCTAATCCT進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增目的條帶。切膠回收純化后定量,上機(jī)測(cè)序。

1.5 測(cè)序結(jié)果分類鑒定

經(jīng)Miseq平臺(tái)測(cè)序后下機(jī),允許的最低讀取序列(read)平均測(cè)序質(zhì)量為Q20,即 1%的錯(cuò)誤率,去掉 N序列,保留最短長(zhǎng)度為 100bp,去除較長(zhǎng)的均聚物,設(shè)置最大聚合值為8。然后根據(jù)條碼技術(shù)的值對(duì)處理好的序列進(jìn)行樣本歸類,統(tǒng)計(jì)樣本數(shù)目及片段長(zhǎng)度分布。使用 PyNAST和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),然后再用UCHIME(Edgar et al,2011)方法檢測(cè)并去除嵌合序列;非嵌合體序列使用 GreenGene等核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)中aligned核糖體序列數(shù)據(jù)比對(duì),去除非目的物種序列污染。采用mothur(Schloss et al,2009)默認(rèn)的OTU分析方法獲得 OTU代表序列,通過(guò)計(jì)算序列間未修正的兩兩距離并使用 cluster和 97%的相似性對(duì)序列進(jìn)行聚類(Edgar,2010)。然后在每個(gè)OTU聚類里面選擇最長(zhǎng)的序列作為該OTU代表序列。以0.03為cutoff值劃分可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。計(jì)算 cutoff為 0.03時(shí) ACE和 Chao值,繪制稀釋曲線。

在 cutoff=0.03情況下分析結(jié)果,從門(mén)水平(變形菌門(mén)從綱水平)對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)平行各菌門(mén)所占百分比求平均值,將各實(shí)驗(yàn)組中微生物各菌門(mén)平均組成繪制柱狀圖,將少于序列總數(shù)1%的菌門(mén)歸為“少數(shù)菌群”。此外,分別從對(duì)照組、添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組、添加芘的實(shí)驗(yàn)組中選出屬水平數(shù)量上占前十位的優(yōu)勢(shì)菌 OUT的百分含量繪制 heatmap圖,分析群落結(jié)構(gòu)變化(Deng et al,2014)。

1.6 降解率的測(cè)定

1.6.1 芘降解率的測(cè)定 在 15天實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),采用 GC-MS分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)組 1(P1,P2)和化學(xué)對(duì)照組1(Pa,Pb)中芘的含量。

芘相對(duì)降解率=(Pn-P)/Pn×100%,(Pn: 化學(xué)對(duì)照組1中芘的殘留量;P: 實(shí)驗(yàn)組1中芘的殘留)(陳志丹等,2012)。

1.6.2 苯甲酸鈉降解率 配制 2.000mg/L、4.000mg/L、6.000mg/L、8.000mg/L、10.000mg/L 的苯甲酸鈉系列標(biāo)準(zhǔn)液,測(cè)定其吸光光度值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取 2mL實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M樣品,加水定容至20mL,恒溫?fù)u床充分震蕩 30min,6000r/min離心20min,取10mL上清定容至100 mL。將待測(cè)液于石英比色皿在 222nm下測(cè)定吸光度。根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算苯甲酸鈉的降解率測(cè)定(毛寧等,2010)。

苯甲酸鈉相對(duì)降解率=(Bn-B)/Bn×100%,(Bn: 化學(xué)對(duì)照組2中苯甲酸鈉的殘留量;B: 實(shí)驗(yàn)組2中苯甲酸鈉的殘留量)。

1.7 序列信息

所有的序列都已經(jīng)上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)原始數(shù)據(jù) SRA ID分別為 Y1: SRR1947065;Y2:SRR1948026;P1: SRR1948031;P2: SRR1948037;B1:SRR1948178;B2: SRR1948179。

2 結(jié)果

2.1 Illumina MiSeq測(cè)序的有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、稀釋曲線和多樣性分析

2.1.1 Illumina MiSeq測(cè)序的有效序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Miseq測(cè)序結(jié)果共得到有效序列127174條,平均每個(gè)樣品約25434條序列,有效序列信息見(jiàn)表1。

表1 Miseq測(cè)序所獲得的16S rRNA基因序列信息Tab.1 16S rRNA gene sequence information obtained by Miseq sequencing

2.1.2 Illumina MiSeq測(cè)序的稀釋曲線和多樣性分析對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣,以抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線(rarefaction curve)。分析基于cutoff=0.03水平,評(píng)估對(duì)照組Y1,Y2和實(shí)驗(yàn)組B1,B2,P1,P2樣本之間的物種多樣性(圖1)。其中樣品文庫(kù)的覆蓋率,實(shí)驗(yàn)組B1為0.993234,B2為0.993512和 P1為 0.99264,P2為 0.992895,曲線趨于平坦;當(dāng)cutoff=0.03,Y1、Y2、樣品文庫(kù)的覆蓋率分別達(dá)到了0.939893和0.941156(見(jiàn)表2)。本次測(cè)序結(jié)果基本能夠代表樣本的真實(shí)情況。

Chao指數(shù)和ACE指數(shù)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的值遠(yuǎn)大于添加苯甲酸鈉和芘的實(shí)驗(yàn)組的值,說(shuō)明對(duì)照組的菌群豐度(community richness)遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的(Y1,Y2)的Shannon指數(shù)＞添加芘的樣品的值＞添加苯甲酸鈉的樣品的值,同時(shí)對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的(Y1,Y2)的 Simpson指數(shù)＜添加芘的樣品的值＜添加苯甲酸鈉的樣品的值,說(shuō)明對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的菌群的多樣性大于實(shí)驗(yàn)組,添加芘的實(shí)驗(yàn)組的菌群的多樣性大于添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組。

圖1 樣品在cutoff=0.03情況下得到的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve obtained in the case of cutoff=0.03

表2 OTU劃分和Alpha評(píng)估結(jié)果Tab.2 OUT division and alpha assessment results

2.2 芘或苯甲酸鈉降解率的測(cè)定

經(jīng)過(guò)15天的搖床培養(yǎng),相較于化學(xué)對(duì)照組1(Pa,Pb)實(shí)驗(yàn)組1(P1,P2)中的芘的降解率為40.67%;化學(xué)對(duì)照組2(Ba,Bb)相比實(shí)驗(yàn)組2 (B1,B2)中苯甲酸鈉的降解率為89.92%。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,芘和苯甲酸鈉在沉積物菌群作用下發(fā)生了不同程度的降解。

2.3 苯甲酸鈉脅迫下微生物群落結(jié)構(gòu)的變化與響應(yīng)

通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù),分析在不同污染物的選擇壓力下沉積物樣品中細(xì)菌群落演替規(guī)律以及預(yù)測(cè)有降解功能的微生物群落。在添加芘和苯甲酸鈉連續(xù)培養(yǎng) 15天后菌群多樣性極大降低。相比于對(duì)照組微生物菌群,添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組和添加芘的實(shí)驗(yàn)組,在門(mén)的水平上呈現(xiàn)不同的變化特征。

在對(duì)照組樣品中,占主導(dǎo)地位的是變形菌門(mén)。變形菌門(mén)中的γ變形菌綱、δ變形菌綱,α變形菌綱分別占序列總數(shù)的31.007%,25.168%,9.857%(百分含量為兩個(gè)平行試驗(yàn)組的平均值,下同)。此外擬桿菌門(mén)占 10.024%。添加苯甲酸鈉或芘連續(xù)培養(yǎng) 15天后的微生物群落與對(duì)照組的微生物群落組成有顯著的差別。

在添加芘實(shí)驗(yàn)組中,菌群主要包括擬桿菌門(mén)(48.102%),α變形菌綱(22.214%),γ變形菌綱(14.019%),放線菌門(mén)(8.735%),熱脫硫桿菌門(mén)(4.785%)。其中擬桿菌門(mén),α變形菌綱相對(duì)于對(duì)照組有所增加。擬桿菌門(mén)序列數(shù)從對(duì)照樣品的10.024%增加到48.102%;α變形菌綱所占比例由對(duì)照組的9.857%增加至22.214%。放線菌門(mén)由原位的 1.014%增加至 8.735%,熱脫硫桿菌門(mén)所占比例由0.003%增加至4.785%。而變形菌門(mén)的γ變形菌綱,δ變形菌綱,ξ變形菌綱相比于原位微生物菌群所占百分比均顯著降低,分別從 31.007%,25.168%,8.581%降 低 至 14.019%,0.623%,和0.011%。

Illumina MiSeq測(cè)序結(jié)果表明,在添加苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組的微生物群落中,變形菌門(mén)占了菌群的絕大多數(shù)(91.122%)。其中 γ變形菌綱占了整個(gè)微生物菌群的86.362%,而對(duì)照組菌群中γ變形菌綱只占了整個(gè)群落的 31.007%,α變形菌綱相對(duì)于原位菌群的9.857%有所降低,占4.025%。δ變形菌綱則相比于對(duì)照組的 25.168%降低至為 0.533%,β變形菌綱為0.139%,ε變形菌綱占0.044%。除變形菌門(mén)以外,芽單孢菌門(mén)相比于對(duì)照組的菌群1.320%增加至3.906%,厚壁菌門(mén)的菌群相對(duì)于對(duì)照組菌群 0.493%增加至3.104%。擬桿菌門(mén)相比于對(duì)照組,菌群含量從10.024%降低至1.480%,變形菌門(mén)中的δ變形菌綱則由對(duì)照組的25.168%降低至0.533%。

通過(guò)比較可以得出,相比對(duì)照組,在添加芘的實(shí)驗(yàn)組,擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)的γ變形菌綱其富集最為顯著,在添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中變形菌門(mén)微生物群落極大地富集,其中γ變形菌綱尤為顯著,從對(duì)照組的31.007%增加至占菌群的86.362%。

從屬的水平上對(duì)菌群組成進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組中數(shù)量居前十位的屬大多在 1.000%—10.000%之間,各菌群分布均勻,說(shuō)明沒(méi)有芳香族化合物脅迫時(shí)沒(méi)有占主導(dǎo)地位的菌群。

添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組,主要菌屬包括假海源菌屬(Pseudidiomarina)(39.421%)、海桿菌屬(Marinobacter)(37.924%)、噬甲基菌屬(Methylophaga)(6.254%)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(2.921%)。而在對(duì)照組,假海源菌屬(Pseudidiomarina)只占菌群的0.001%,在添加芘的實(shí)驗(yàn)組,假海源菌屬(Pseudidiomarina)占 0.011%;對(duì)照組噬甲基菌屬(Methylophaga)只占菌群的 0.095%,在添加芘的實(shí)驗(yàn)組噬甲基菌屬(Methylophaga)數(shù)目占菌群總量的 0.349%,對(duì)照組芽孢桿菌屬(Bacillus)占菌群百分?jǐn)?shù)遠(yuǎn)小于 0.001%,添加芘的實(shí)驗(yàn)組芽孢桿菌屬(Bacillus)數(shù)目占菌群總量的 0.077%。比較得出,相比于原位菌群的數(shù)目,添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組假海源菌屬(Pseudidiomarina)、海桿菌屬(Marinobacter)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、芽孢桿菌屬(Bacillus)所占百分比數(shù)目明顯增加。

在添加芘的實(shí)驗(yàn)組,Balneola屬(28.892%)、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)(13.254%)、黃單胞桿菌科下的unclassified(7.344%)、葉桿菌科下的 unclassified(6.604%)及分支桿菌屬(Mycobacterium)(6.541%)占優(yōu)勢(shì)地位。而在對(duì)照組和添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中Balneola屬基本檢測(cè)不到;對(duì)照組中的碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)和添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中的碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)OTU數(shù)目基本檢測(cè)不到。在屬的水平,在添加芘實(shí)驗(yàn)組中,Balneola屬、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)以及在添加苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組中海桿菌屬(Marinobacter),假海源菌屬(Pseudidiomarina)極大地富集,成為優(yōu)勢(shì)菌群。

3 討論

Illumina Miseq技術(shù)可為解析微生物群落結(jié)構(gòu)、闡明海洋沉積物中微生物群落的整體概貌及其在不同污染物脅迫下的演替特征提供技術(shù)支持。本文在實(shí)驗(yàn)室建立馴化系統(tǒng),采用Illumina Miseq技術(shù)研究芳香族化合物芘和苯甲酸鈉對(duì)海洋沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,初步闡釋不同苯環(huán)數(shù)的芳香族化合物對(duì)海洋環(huán)境微生物群落的影響。監(jiān)測(cè)海洋沉積物中微生物群落在芘或苯甲酸鈉脅迫下的演替特征,有助于揭示芳香烴類污染環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)種群,發(fā)現(xiàn)在海洋沉積物中與芘、苯甲酸鈉降解相關(guān)的微生物。

通常,原位生態(tài)環(huán)境的破壞會(huì)伴隨物種豐度和多樣性的降低(Peng et al,2013)。Alpha評(píng)估指數(shù)和稀釋曲線顯示,在添加芘和苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中,海洋沉積物中細(xì)菌群落的豐度和多樣性都極大降低。添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組OTUs數(shù)目分別為309和269,添加苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組的OTUs數(shù)目為329和354,添加芘和苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組稀釋曲線已經(jīng)達(dá)到飽和。在對(duì)照組中(Y1,Y2),OTUs數(shù)目分別為3963和4053,并且隨著測(cè)序數(shù)目的增加尚有增加的趨勢(shì)。進(jìn)一步分析Chao指數(shù)、AC指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simplon指數(shù)可知,添加苯甲酸鈉和芘的實(shí)驗(yàn)組中菌群的豐度和多樣性都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組。原因可能是添加芳香族化合物導(dǎo)致一些原位微生物失去生存條件,此外添加芳香族化合物可能導(dǎo)致敏感種群的生長(zhǎng)受到抑制,同時(shí)使某些能夠利用或耐受芳香族化合物的菌群得到額外的碳源而富集。

在未添加苯甲酸鈉和芘的對(duì)照組中,海洋沉積物樣品中多樣性分布結(jié)果如圖2所示,樣品中微生物多樣性較高,主要有變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)等,其中變形菌門(mén)為主要的優(yōu)勢(shì)菌群,占總序列數(shù)的74.801%。在添加芘的實(shí)驗(yàn)組中主要包括擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、熱脫硫桿菌門(mén),其中擬桿菌門(mén)占到序列總數(shù)的48.102%,變形菌門(mén)降低至47.852%。添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中主要包括變形菌門(mén),占到了序列總數(shù)的 91.122%,其中 γ變形菌綱占到了總序列數(shù)的86.362%。研究結(jié)果表明,添加芘和苯甲酸鈉的海洋沉積物中微生物群落在門(mén)水平呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。變形菌門(mén)的γ變形菌綱在對(duì)照組、添加苯甲酸鈉、和添加芘的菌群中都占主導(dǎo)地位。在芘和苯甲酸鈉的影響下,一部分細(xì)菌失去優(yōu)勢(shì),同時(shí)一些細(xì)菌能夠耐受或者是能夠利用芘和苯基酸鈉從而實(shí)現(xiàn)污染物的降解和自身數(shù)量的富集。

圖2 樣品在cutoff=0.03情況下菌群在門(mén)的水平上(變形菌門(mén)在綱的水平)的分類情況Fig.2 Bacterial classification in phylum level in cutoff=0.03 (Proteobacteria in class level)

在屬水平,對(duì)照組中數(shù)量占細(xì)菌群落前十位的屬百分含量介于 1.000%—10.000%之間,大多數(shù)屬于未被明確分類的細(xì)菌,說(shuō)明在對(duì)照樣品中沒(méi)有占主導(dǎo)地位的菌屬,另一方面也能夠說(shuō)明人們對(duì)海洋環(huán)境中的細(xì)菌群落的認(rèn)識(shí)還不夠充分。添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中占前四位的菌屬為假海源菌屬(Pseudidiomarina)、海桿菌屬(Marinobacter)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、芽孢桿菌屬(Bacillus),分別占 39.421%、37.924%、6.254%、2.921%,而在添加芘的實(shí)驗(yàn)組中假海源菌屬(Pseudidiomarina)、海桿菌屬(Marinobacter)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、芽孢桿菌屬(Bacillus)所占的比例相比于對(duì)照組也相應(yīng)地有所增加,分別占 0.011%,0.349%,1.418%,0.077%。在添加芘實(shí)驗(yàn)組,占前兩位的菌屬分別為 Balneola屬和碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)細(xì)菌,分別占菌群含量的 28.88%,13.25%;而在對(duì)照組和添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中并未檢測(cè)到以上兩者。我們推測(cè)Balneola屬和碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)這兩個(gè)菌屬在耐受或者降解芘的過(guò)程中起重要作用,在添加芘后,菌群得到富集成為主導(dǎo)菌群。假海源菌屬(Pseudidiomarina)、海桿菌屬(Marinobacter)、噬甲基菌屬(Methylophaga)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌在添加苯甲酸鈉后菌群富集成為優(yōu)勢(shì)菌群;在添加芘的實(shí)驗(yàn)組,可能由于環(huán)境中芘的降解,在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的單苯環(huán)類化合物導(dǎo)致這四種菌屬相比于對(duì)照組菌群數(shù)量稍微有富集。

圖3 Heatmap圖顯示有無(wú)脅迫樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成與變化Fig.3 Heatmap showing the relative abundance of different bacterial genera柱狀圖中的不同顏色表征不同種群的測(cè)序豐度

假海源菌屬(Pseudidiomarina)、海桿菌屬(Marinobacter)細(xì)菌在添加苯甲酸鈉實(shí)驗(yàn)組中極大地富集成為優(yōu)勢(shì)菌群。研究表明海桿菌屬(Marinobacter)、假海源菌屬(Pseudidiomarina)能夠廣泛利用多種碳源作為底物,許多成員已經(jīng)被證明具有多環(huán)芳烴的降解能力。據(jù)報(bào)道,Marinobacter sp.NCE312能夠降解萘、2甲基-萘、1-甲基萘(Handley et al,2009)。Moghadam等(2014)分離到海桿菌屬(Marinobacter)和假海源菌屬(Pseudidiomarina)菌株能夠以芴和菲為唯一碳源和能量來(lái)源 Kostka等分離的海桿菌屬(Marinobacter)和假海源菌屬(Pseudidiomarina)細(xì)菌在降解石油的過(guò)程中發(fā)揮了一定作用(Kostka et al,2011;Gao et al,2013)。Li等(2012)發(fā)現(xiàn)海桿菌屬(Marinobacter)能夠在廣泛的鹽度范圍內(nèi)降解單苯環(huán)類化合物,成為主導(dǎo)菌群。Balneola屬、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)細(xì)菌在芘脅迫下成為添加芘的實(shí)驗(yàn)組主要的菌群,有研究表明Balneola屬細(xì)菌可以在較廣泛的鹽濃度范圍內(nèi)有效降解 BTEX(張倩,2012),Balneola屬細(xì)菌在添加芘的環(huán)境中富集還是首次報(bào)道。推測(cè)在海洋原位環(huán)境中Balneola屬、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)等細(xì)菌協(xié)同完成芘的降解和自身數(shù)量的富集。

4 結(jié)論

芘和苯甲酸鈉的脅迫對(duì)海洋沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)演替產(chǎn)生巨大影響。相對(duì)于對(duì)照組,添加芘的實(shí)驗(yàn)組中Balneola屬、碳酸噬胞菌屬(Aequorivita)極大地富集成為優(yōu)勢(shì)菌群;添加苯甲酸鈉的實(shí)驗(yàn)組中海桿菌屬(Marinobacter)和假海源菌屬(Pseudidiomarina)極大地富集成為優(yōu)勢(shì)菌群。這些菌已經(jīng)被證明能夠參與芳香族化合物的降解。本實(shí)驗(yàn)表明,海洋中不同的芳香族化合物脅迫下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯演替。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠?yàn)榉枷阕寤衔锬酥潦偷扔袡C(jī)污染物的修復(fù)提供理論指導(dǎo)。

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