雜交狼尾草不同外植體愈傷組織誘導

臧文靜，陳 瑩，李 青，茍孝琴，武炳超，楊盛婷，張 銳，張新全，黃琳凱

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 成都611130）

雜交狼尾草是美洲狼尾草（Pennisetum americanu m）和象草（Pennisetu m pur p ureu m）的三倍體種間雜交種［1］，具有明顯的雜種優(yōu)勢，適應性廣、產(chǎn)量高、較耐鹽［2］，作為優(yōu)良牧草，其已經(jīng)在長江中下游廣泛推廣種植。另外，由于生物量大、干物質(zhì)產(chǎn)量高、光合效率高的特點［3］，近年來雜交狼尾草作為能源植物成為生物質(zhì)能源研究的熱點之一。

研究并建立較為高效的組織培養(yǎng)體系是遺傳轉化體系建立、分子育種、基因功能研究的前提和基礎。近年來國內(nèi)相繼有專家學者對狼尾草屬植物的組培及快繁體系進行探索，在象草（Pennisetum pur pureu m）腋芽外植體消毒方法的篩選中研究表明用自來水沖洗60 min，0．1%升汞浸泡消毒25 min，2%次氯酸鈉浸泡消毒20 min，可以使污染率降到13．33%［4］。對紅色狼尾草（Pennisetu m setaceu m ‘Rubr u m’）的離體培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的研究中表明，頂芽和節(jié)段用0．1% 升汞滅菌8～12 min效果最好，出愈率可達75%和90%［5］。研究表明絨毛狼尾草（Pennisetu m setaceu m ）幼嫩花穗在添加了2，4－D 的MS和N6兩種基本培養(yǎng)基上都能誘導出愈傷組織，但MS培養(yǎng)基上的誘導率稍微高一些，在MS＋3 mg·L－12，4－D 中誘導率達100%［6］。但關于雜交狼尾草組織培養(yǎng)的研究報道相對較少。王憑青等［7］以雜交狼尾草的莖節(jié)（帶側芽）、莖段、心葉和嫩葉為外植體材料獲得再生苗。單獨使用2，4－D其它植物生長調(diào)節(jié)劑如ABA、NAA 或KT 時，形成的愈傷組織胚性不高，難于再生，而添加了KT、ABA 等激素，則可以有效提高愈傷組織的胚性［8］。劉芳等［9］發(fā)現(xiàn)雜交狼尾草比普通禾本科植物再生更為困難，且易染菌及分化率低等問題。因此，研究并創(chuàng)建較為高效的組織培養(yǎng)體系是需要解決的重要課題。本文以雜交狼尾草成熟種子及心葉為外植體，采用兩步法滅菌，以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，通過調(diào)節(jié)誘導培養(yǎng)基的激素種類及濃度，探索雜交狼尾草愈傷組織誘導及分化培養(yǎng)基的激素配方，從而篩選出最佳配比，為狼尾草組培及快繁體系提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料及處理

本文的試驗材料為邦得1號雜交狼尾草種子及心葉。雜交狼尾草種子由北海市綠邦生物創(chuàng)景發(fā)展有限公司提供，心葉取自四川農(nóng)業(yè)大學試驗園區(qū)（5－7月）中采集的雜交狼尾草健康莖段。

先用洗手液將剝?nèi)ネ馄さ碾s交狼尾草莖段表面灰塵洗凈，然后將其截成3～4 c m，用流水沖洗20～30 min后備用。邦得1號雜交狼尾草種子，在常溫條件下用洗手液稀釋液浸泡24 h，再用流水沖洗20～30 min后備用。

1．2 試驗方法

1．2．1 外植體消毒試驗 將初步處理后的雜交狼尾草的莖段以及邦得1號雜交狼尾草種子分別置于75%乙醇處理，用無菌水沖洗2～3次，接著再用滴加2～3滴吐溫的0．1% Hg Cl2處理，用無菌水沖洗2～3次。其中75%乙醇設置10、20、30 s 3個時間梯度，0．1% Hg Cl2設置6、8、10 min 3個時間梯度。

用無菌濾紙吸干外植體上的水分，在超凈工作臺內(nèi)用解剖刀將莖段剖開取出內(nèi)部幼嫩的心葉切成長約1 c m 的塊狀，將心葉和種子小心接種在培養(yǎng)基上，把接種完畢的錐形瓶置于（25±2）℃的黑暗條件下培養(yǎng)，接種2 d后開始觀察，此后每天觀察一次，記錄雜交狼尾草種子及心葉出愈數(shù)及污染數(shù)，計算其出愈率。記錄雜交狼尾草種子的發(fā)芽種子數(shù)、出愈種子數(shù)、以發(fā)芽及出愈的種子為存活數(shù)，計算種子的存活率及出愈率，每處理每錐形瓶中接種10個，重復9次。

1．2．2 培養(yǎng)基制備 以MS為基本培養(yǎng)基，依據(jù)試驗設計中的不同濃度梯度的激素水平，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的瓊脂、蔗糖的含量，將培養(yǎng)基的p H 值調(diào)至5．8～6．2，在121 ～126 ℃條件下，滅菌20 min，備用。

1．2．3 愈傷組織誘導 雜交狼尾草種子以及心葉的愈傷組織誘導培養(yǎng)基均為：MS＋2，4－D＋6－BA。兩種不同外植體的MS培養(yǎng)基中2，4－D 與6－BA 的質(zhì)量濃度各有6種處理組合［9］。種子愈傷組織誘導中2，4－D 設 置6 個 濃 度 水 平（3、4、5、6、7、8 mg·L－1），6－BA 設 置2 個 濃 度 水 平（0．3、0．4 mg·L－1），兩因素共12個處理。心葉愈傷組織誘導中2，4－D（3、5、7 mg·L－1）與6－BA（0．5、1．0、1．5 mg·L－1）均為3 個濃度水平，兩因素共9 個處理。每種培養(yǎng)基中添加8 g·L－1瓊脂和20 g·L－1蔗糖。在種子愈傷組織誘導培養(yǎng)處理中，每處理每錐形瓶接種10 個，3 個錐形瓶為一組，重復3 組。在心葉愈傷組織誘導培養(yǎng)處理中，每處理每錐形瓶接種5個，3個錐形瓶為一組，重復3組。

將接種完畢的錐形瓶置于（28±1）℃的黑暗條件下培養(yǎng)，接種2 d后開始觀察，每天觀察一次，觀察并記錄出愈情況，愈傷組織的數(shù)目、生長速度以及形態(tài)特征。統(tǒng)計結果，選取最佳處理組合。

1．2．4 分化培養(yǎng) 雜交狼尾草種子分化培養(yǎng)基為MS＋NAA＋6－BA。MS培養(yǎng)基中NAA 設0．5、0．7 mg·L－12個濃度水平，6－BA 設1、2、3 mg·L－13個濃度水平，兩因素共6個處理。每種培養(yǎng)基中添加0．7%瓊脂和3%蔗糖。每處理每錐形瓶接種5個，重復10次。

在種子誘導出的愈傷組織中選取表面純凈干燥、體積較大的個體，接種在分化培養(yǎng)基上，每種處理的培養(yǎng)基分別接種10瓶，每瓶5塊愈傷組織。將其置于28 ℃，光照16 h，光照強度為100 000 lx，以及溫度為25 ℃、黑暗8 h恒溫培養(yǎng)。每天記錄愈傷組織的顏色、形態(tài)特征的變化、出芽的情況以及出芽的數(shù)目，選取最佳處理組合。

生根培養(yǎng)基：1／2 MS添加0．7%瓊脂和3%蔗糖。在分化培養(yǎng)25 d后，將生長出幼芽的愈傷組織在無菌環(huán)境條件下轉接至生根培養(yǎng)基中。

1．3 數(shù)據(jù)分析

每日觀察記錄的數(shù)據(jù)經(jīng)整理后，分別按照以下公式計算：

采用SPSS 19．0軟件利用了比較均值單因素模塊針對種子出愈率、心葉出愈率分別進行了方差分析和多重比較；采用Excel 2010利用公式模塊針對種子出愈率、心葉出愈率分別進行了標準誤的計算。

2 結果與分析

2．1 不同外植體最佳消毒方式

成熟種子在基礎培養(yǎng)基上，2 d后開始出芽，6 d后大部分種子出芽。4 d后，部分出芽種子長出白色有透明度的松軟組織；同時，部分種子周圍有淡黃色油狀液體滲出，為帶菌種子。自開始記錄的第16天停止出愈和出芽，愈傷組織呈白色或淺黃色顆粒狀，帶菌種子四周菌斑變大。結果表明，種子消毒方式中，A8即酒精30 s、0．1% Hg Cl2處理8 min污染率最低，為7%，除與A7和A9處理間差異不顯著外，污染率顯著低于其他處理（P＜0．05）；心葉消毒方式中B9即酒精30 s、0．1% Hg Cl2處理10 min污染率最低，為6%，除B8處理外，污染率顯著低于其他處理。

表1 不同消毒方法對不同外植體污染率的影響Table 1 Effects of different treat ments on the contamination rate of different explant

心葉在基礎培養(yǎng)基上，14 d 開始長出愈傷組織，部分心葉周圍有乳白色或淡黃色油狀液體滲出，為帶菌材料。

2．2 愈傷組織誘導

經(jīng)過75%乙醇處理30 s，再用0．1% Hg Cl2處理8 min的成熟飽滿種子，經(jīng)過4 d的28 ℃黑暗培養(yǎng)，大多數(shù)種子能夠在出芽的部位逐漸長出淡白色且結構較為松散的愈傷組織，隨后愈傷組織變大且致密并有部分突起、表面變得干燥且呈現(xiàn)淡黃色顆粒狀。經(jīng)過16 d的培養(yǎng)，存活種子均能出愈，其中大部分愈傷組織淡黃色致密以及具有較高的分化潛能。種子的12種處理水平出愈率差別明顯（表2），最大的75%，最小的41%，處理Ⅵ與處理Ⅸ出愈率較高，且兩者差異不顯著（P＞0．05），除Ⅸ與Ⅴ差異不顯著外，Ⅵ和Ⅸ顯著高于其他處理。因此，采用MS＋5 mg·L－12，4－D＋0．4 mg·L－16－BA的培養(yǎng)基配方進行愈傷組織誘導，可得到足夠多的高質(zhì)量愈傷組織。同樣，采用心葉外植體進行愈傷組織誘導時，出愈率最高為60%（表3），最低為13%，處理Ⅰ出愈率顯著高于其他處理（P＜0．05）。心葉出愈率以及出愈質(zhì)量明顯低于用種子誘導的，故采用種子作為外植體誘導分化。

表2 不同濃度的2，4－D和6－BA對種子愈傷組織誘導的影響Table 2 Influence of different concentration combination of 2，4－D and 6－BA on seeds callus induction

表3 不同濃度的2，4－D和6－BA對心葉愈傷組織誘導的影響Table 3 Influence of different concentration combination of 2，4－D and 6－BA on buds callus induction

2．3 分化培養(yǎng)

愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進行光照培養(yǎng)。在接種到分化培養(yǎng)基的第10天開始，愈傷組織上開始出現(xiàn)綠色的點。16 d時部分綠色的點分化成嫩芽（圖1），每塊愈傷組織平均有3～5個芽，新芽能夠很好的直立向上生長。但仍有一部分愈傷組織沒有分化出芽，由周邊開始變黃褐化，小部分愈傷組織褐化嚴重。在添加不同質(zhì)量濃度的NAA 與6－BA 的處理時，各處理中愈傷組織分化出芽的數(shù)目均不相同。愈傷組織分化MS＋0．5 mg·L－1NAA＋3．0 mg·L－16－BA 的分化率最高，可達62．5%，伴隨極少量的褐化情況；培養(yǎng)基MS＋0．5 mg·L－1NAA＋1．0 mg·L－16－BA 以及培養(yǎng)基MS＋0．7 mg·L－1NAA＋1．0 mg·L－16－BA 的分化率較低，分別為32．5%和37．5%，同時愈傷組織的褐化情況嚴重。

將分化出芽的愈傷組織塊轉接到1／2 MS培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。大部分帶有幼芽的愈傷組織能生根，根系生長良好；小部分的愈傷組織根系生長緩慢；極少部分的愈傷組織不能生根。

圖1 種子和心葉胚性愈傷組織的誘導和分化Fig．1 Embryonic callus induction of Pennisetu m americanum×P．Pur pureums’seeds and lobus cardiacus and differentiation

3 討論

2，4－D 濃度是誘導外植體出愈的主要因素。當2，4－D 的濃度為7 mg·L－1時，心葉外植體的出愈率低，愈傷組織白色透明或半透明，為非胚性愈傷組織，并且大部分外植體出現(xiàn)褐化。種子外植體最佳出愈率的誘導培養(yǎng)基中2，4－D 的濃度為5 mg·L－1，其愈傷組織結構松散，易碎，呈顆粒狀，為胚性愈傷組織，種子外植體的最佳出愈率比心葉外植體最佳出愈率高于15百分點。一般2，4－D、NAA對細胞分裂、愈傷組織生長表現(xiàn)為促進作用，6－BA對細胞分裂、愈傷組織生長表現(xiàn)為抑制作用［10］，單獨使用6－BA 時誘導率較低甚至不能出愈［11］，本研究結合高濃度2，4－D 和低濃度6－BA 設計處理，取得較為理想的出愈效果。

植物組織培養(yǎng)中至關重要的一步是選擇合適的外植體。在愈傷組織誘導過程中，外植體本身所含的內(nèi)源激素種類、濃度水平差異和對外源激素的反應靈敏度不同是可能導致不同外植體對激素種類和濃度反應不同的因素［12］，也可能是不同外植體出愈能力不同的原因之一。同時，生理狀態(tài)不同、處于不同生長發(fā)育階段的植物材料也會直接影響愈傷組織的 形態(tài)發(fā) 生［13－14］。韓 超 和 方 正［15］提 出 中 度 成 熟 器官無論從成活率或分化率上均優(yōu)于幼嫩器官，因后者在表面消毒過程中極易死亡，與本研究中種子作為成熟器官出愈率、分化率均高于心葉，心葉褐化率較高的結果一致。

本研究對外植體種子和心葉進行愈傷組織的誘導，設置相應的植物激素配比，出愈過程和結果表明，雜交狼尾草的成熟種子與心葉相比，其種子更容易在短時間內(nèi)誘導出高質(zhì)量的胚性愈傷組織，芽的脫分化能力比心葉強，生長迅速，有報道稱［16］，種子的內(nèi)源激素和營養(yǎng)物比心葉高，由于心葉被手術刀劃傷，對其傷害較大，很大程度上影響出愈率。同時心葉污染率普遍高于種子，可能與心葉含較多內(nèi)生菌有關。綜上，在雜交狼尾草的組培快繁中，種子外植體的出愈誘導比心葉更佳。這與楊茹等［17］研究在相同培養(yǎng)條件下，黑麥草（Loliu m perenne）外植體芽尖的愈傷組織誘導效果比種子差的結果相符。

生長激素和細胞分裂素常用來誘導細胞脫分化并控制植物生長發(fā)育。2，4－D 被普遍用作牧草類植物組織培養(yǎng)時的生長素［18］，Bhaskaran等指出2，4－D 對植物 愈 傷 組 織 誘 導 起 決 定 作 用［19－20］，且2，4－D的濃度對愈傷組織的誘導有明顯的影響［21］，即過高或過低的2，4－D 不利于胚性愈傷組織的形成和分化［22］，在沙打旺（Astr agal us adsur gens）愈傷組織誘導的培養(yǎng)基中，高濃度（高于3 mg·L－1）的2，4－D 結合低濃度（低于0．1 mg·L－1）的6－BA 有利于誘導胚 性 愈 傷 組 織 的 發(fā) 生［23］，與 本 研 究 中5．0 mg·L－1的2，4－D 對雜交狼尾草種子的愈傷組織誘導率最高，而8．0 mg·L－1的2，4－D 誘導率較低結果一致。

4 結論

合適質(zhì)量濃度的2，4－D 與6－BA 組合能夠促進雜交狼尾草種子和心葉愈傷組織的誘導。其中，種子最佳的胚性誘導培養(yǎng)基為MS＋5．0 mg·L－12，4－D＋0．4 mg·L－16－BA，誘導率為75%，心葉最佳的胚性誘導培養(yǎng)基為MS＋3．0 mg·L－12，4－D＋0．5 mg·L－16－BA，誘導率為60%；種子愈傷組織誘導率高于心葉，為較好外植體。最優(yōu)分化培養(yǎng)基為MS＋0．5 mg·L－1NAA＋3．0 mg·L－16－BA，分化率為62．5%。

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