蛋白質(zhì)組學(xué)中的固定化酶反應(yīng)器制備的研究進(jìn)展

張凌怡, 王兵兵, 上官露露, 張潤(rùn)生, 陳建虎, 張維冰*

(1. 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 華東理工大學(xué), 上海 200237; 2. 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院, 上海市公安局, 上海 200083)

蛋白質(zhì)組學(xué)中的固定化酶反應(yīng)器制備的研究進(jìn)展

張凌怡1, 王兵兵1, 上官露露1, 張潤(rùn)生2, 陳建虎1, 張維冰1*

(1. 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 華東理工大學(xué), 上海 200237; 2. 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院, 上海市公安局, 上海 200083)

固定化酶反應(yīng)器作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中“bottom-up”策略重要的組件,具有酶解快速、酶解效率高、酶穩(wěn)定性和活性高、簡(jiǎn)單易操作、能夠與多種檢測(cè)方式聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn),對(duì)于發(fā)展高效快速的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法具有重要意義。本文就固定化酶反應(yīng)器的制備方法及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用做簡(jiǎn)單的概述,著重介紹酶的固定方法、固定化酶的載體、用于固定的酶的種類。近幾年固定化酶反應(yīng)器的研究集中于提高固酶量、保持酶活性、增加酶解效率、減小非特異性吸附等方面。研究結(jié)果表明,采用納米材料、整體材料等新型載體,提高載體親水性，采用多酶同時(shí)酶解等方法能夠有效改善固定化酶反應(yīng)器的性能,提高蛋白質(zhì)的鑒定效率。

固定化酶反應(yīng)器;酶;載體材料；蛋白質(zhì)組學(xué);制備

蛋白質(zhì)組學(xué)研究中采用的蛋白質(zhì)鑒定策略[1]主要包括“top-down”策略、“middle-down”策略和“bottom-up”策略。在“middle-down”策略、“bottom-up”策略中,蛋白質(zhì)酶解成肽段再進(jìn)行分析,能夠獲得更小的分析物相對(duì)分子質(zhì)量,帶電量較低,有利于提高質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度[2],與蛋白質(zhì)直接分析相比具有更大的優(yōu)勢(shì),因此蛋白質(zhì)的酶解受到越來越多研究團(tuán)隊(duì)的關(guān)注。傳統(tǒng)的酶切方式是在溶液中酶解,此酶切方式存在步驟繁瑣、酶解時(shí)間長(zhǎng)且蛋白酶在溶液中易發(fā)生自降解導(dǎo)致酶解效率低的缺點(diǎn)。固定化酶反應(yīng)器能夠克服以上缺點(diǎn)，有效提高酶解效率。

1 固定化酶反應(yīng)器簡(jiǎn)介

固定化酶反應(yīng)器的概念最早在20世紀(jì)70年代提出,是將酶固定在一定的載體上,然后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。由于酶固定后,具有酶與底物的比例高、酶解后無需分離酶和產(chǎn)物、能夠顯著減少酶之間的接觸、防止其自降解等優(yōu)點(diǎn),使得其與傳統(tǒng)的自由溶液酶解相比,具有酶解快速、酶解效率高、顯著提高酶穩(wěn)定性、簡(jiǎn)單易操作、選擇合適的載體能夠與多種檢測(cè)方式聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)[3-5]。決定酶固定成功與否及其酶解性能的因素主要包括酶的種類的選擇、酶的固定方法、載體的選擇。

1.1 酶的種類

蛋白質(zhì)酶解是蛋白質(zhì)組學(xué)中最常見的裂解方法,目前較為常見的酶有胰蛋白酶、內(nèi)肽酶(金屬內(nèi)切蛋白酶Lys-N，胞內(nèi)蛋白酶Lys-C，蛋白內(nèi)切酶Glu-C)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等。胰蛋白酶由于專一性強(qiáng),酶切后得到的肽段的相對(duì)分子質(zhì)量剛好在電噴霧(ESI)質(zhì)譜檢測(cè)范圍之內(nèi)(500～3 000 Da),而且只水解精氨酸、賴氨酸的羧基參與形成的肽鍵,因此是蛋白質(zhì)鑒定中應(yīng)用最多的蛋白質(zhì)水解酶。除了胰蛋白酶之外,糜蛋白酶也是較為常用的水解酶,糜蛋白酶的水解酶切位點(diǎn)有苯基丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸殘基。胃蛋白酶[6]作為唯一在酸性條件下使用的水解酶,它傾向于剪切氨基端或羧基端為芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)或亮氨酸的肽鍵。此外,Glu-C、Lys-N、Lys C等特異性酶也常應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究,尤其是磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)。實(shí)驗(yàn)表明,只固定一種酶(通常是胰蛋白酶)時(shí)酶解效率較低,尤其對(duì)于缺少賴氨酸和精氨酸殘基的蛋白質(zhì)(如疏水性膜蛋白)。Bian等[7]將Glu-C與胰蛋白酶串聯(lián)使用對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行自由溶液酶解,顯著地提高了其中磷酸化蛋白氨基酸序列覆蓋度。糜蛋白酶切位點(diǎn)與胰蛋白酶互補(bǔ),且其適宜的pH與胰蛋白酶接近,常被應(yīng)用于多酶共同酶解以提高酶解效率。Shangguan等[8]將糜蛋白酶和胰蛋白酶同時(shí)固定到摻雜介孔氧化硅材料SBA-15的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱上,獲得的雙酶反應(yīng)器比單酶反應(yīng)器具有更高的酶解效率。馬俊峰[9]對(duì)比了牛血清白蛋白(BSA)經(jīng)固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶兩種酶反應(yīng)器酶解與僅用一種酶的反應(yīng)器(胰蛋白酶:25%;胰凝乳蛋白酶:17%)酶解的效果,BSA得到了更高的序列覆蓋率(33%)。Temporini等[10]將胰蛋白酶和糜蛋白酶通過與環(huán)氧基團(tuán)一步反應(yīng)同時(shí)固定到硅膠整體柱上,獲得了更高的酶解效率?？偠灾?不同的蛋白酶對(duì)不同的氨基酸位點(diǎn)有不同的酶切位點(diǎn),因此選擇合適的酶在固定化過程中非常重要。

1.2 固定酶的方法

固定酶的方法是影響固定化酶反應(yīng)器性能的主要因素之一,最常用的4種方法為吸附法、共價(jià)鍵合法、包埋法和交聯(lián)法。

1.2.1吸附法

吸附法是最早使用的未經(jīng)過化學(xué)修飾固定酶的方法,這種方法具有如下優(yōu)勢(shì):改變條件能夠使吸附的酶解吸附,使得載體能夠重復(fù)利用;操作條件溫和;保持了酶的活性。當(dāng)然,這種方法也有不少缺點(diǎn),如固定化的酶特別容易流失,這是由于酶與載體之間的作用力相對(duì)較弱,因此極易受到離子強(qiáng)度、pH值的影響。吸附法常通過氫鍵作用[11]、范德華力、親水作用、靜電作用[12,13]將酶固定到載體上。除此之外,利用Cu2+[8,14]螯合也是重要的固定酶的方法之一。

1.2.2共價(jià)鍵合法

為了使酶的流失減小到最低,目前使用最多的是共價(jià)鍵合法。與吸附法相比,利用共價(jià)鍵合法固定的酶具有更高的穩(wěn)定性,能夠在極性溶劑中使用,不會(huì)因?yàn)榈孜锖望}的存在而發(fā)生流失。但是化學(xué)反應(yīng)可能會(huì)使酶發(fā)生變性,導(dǎo)致其活性減弱甚至?xí)セ钚?化學(xué)反應(yīng)也會(huì)使酶失去一些重要的活性位點(diǎn)。共價(jià)鍵合法主要通過與相應(yīng)的常見的基團(tuán)[15]反應(yīng)將酶固定到載體上,例如環(huán)氧基[10]、醛基和琥珀酰亞胺[16]、羧基[17-19]等。

1.2.3包埋法

酶的包埋通常是指利用物理或者化學(xué)的方法將酶包埋在某種載體中的過程。包埋法與吸附法相比,能夠減少酶的流失,與共價(jià)鍵合法相比,酶的活性較高。但是如果制備過程不成功,會(huì)嚴(yán)重地阻礙底物與酶的接觸,降低酶解效率。較為常見的包埋法是將酶包埋在聚丙烯酰胺凝膠中[20-22]。

1.2.4交聯(lián)法

與共價(jià)鍵合法不同,交聯(lián)法是使用雙功能或多功能的試劑使載體與酶分子之間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)的固定方法。由于反應(yīng)的條件通常比較劇烈,因此對(duì)酶的活性影響較大,在使用的過程中應(yīng)盡可能地使用較低濃度的交聯(lián)劑并且縮短交聯(lián)的時(shí)間,在溫和條件下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)有利于保持酶的活性,最為常用的交聯(lián)試劑為戊二醛[23-25]。

1.3 固定化酶的載體

載體性質(zhì)對(duì)于保持固定化酶的活性有極為重要的作用,目前最為常見的載體基質(zhì)材料包括納米材料、整體材料、聚合物材料以及膜材料。

1.3.1納米材料

納米材料由于具有較大的比表面積、能夠顯著地提高固酶量、具有良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用作固定化酶載體。近年來,氧化石墨烯一直是研究的熱點(diǎn)。氧化石墨烯具有表面積大,表面含有多種基團(tuán)例如環(huán)氧基、羥基、羧基等,易于被修飾,能夠在水溶液中分散,親水性好,能顯著減少分析過程中蛋白質(zhì)和肽段的非特異性吸附等特點(diǎn)而被用作固定化酶的載體。2012年,Jiang等[11]用磁性Fe3O4修飾氧化石墨烯,先將磁性Fe3O4修飾上氨基,加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)活化氧化石墨烯上的羧基基團(tuán),制備出GO-CO-NH-Fe3O4納米復(fù)合材料,最后將胰蛋白酶通過π-π堆積和氫鍵作用固定到氧化石墨烯層上,制備成固定化酶反應(yīng)器。這種復(fù)合材料由于修飾了Fe3O4納米顆粒,酶解后酶解液與固酶基質(zhì)在磁場(chǎng)作用下能夠被輕易分離。Yin等[12]利用層層靜電自組裝在毛細(xì)管內(nèi)壁吸附上石墨烯,將酶通過靜電作用吸附到石墨烯層上制備多層固定化酶反應(yīng)器。微流控芯片由于具有集成化程度高、便于攜帶、樣品和試劑用量小等特點(diǎn)而應(yīng)用廣泛。Chen等[18]在聚甲基丙烯酸酯微流控芯片的內(nèi)壁通道上包上一層氧化石墨烯-二氧化硅復(fù)合物,并用EDC和NHS活化石墨烯上的羧基,將胰蛋白酶共價(jià)鍵合到氧化石墨烯表面。Shieh等[26]將糜蛋白酶通過共價(jià)鍵合固定到Fe3O4-殼聚糖納米顆粒上,固定的酶能在磁場(chǎng)下選擇性分離以降低運(yùn)行成本,較高的比表面積能夠提供較多的共價(jià)位點(diǎn),殼聚糖的存在使得這種載體無毒性,具有生物相容性、可生物降解性和抗菌特性,并且能在生物催化系統(tǒng)中連續(xù)地使用。

Malvi等[27]用吸附法將胰蛋白酶吸附到疊氮化物修飾的SBA-15(直徑5～8 μm)介孔材料上,然后用炔基修飾的介孔硅納米材料覆蓋,采用疊氮化炔點(diǎn)擊化學(xué)法(CuAAC),用Cu(I)作催化劑,將胰蛋白酶包埋在兩種材料之間。由于介孔硅納米顆粒是一種多孔結(jié)構(gòu),并且孔的大小適當(dāng),孔徑大小能夠允許反應(yīng)物(蛋白質(zhì))和生成物(肽段)自由出入,但是酶不會(huì)發(fā)生流失。Hartmann課題組[28]將脂肪酶通過戊二醛交聯(lián)以及共價(jià)鍵合兩種方法固定到有序介孔硅材料上。這種材料是一種籠狀的結(jié)構(gòu),在這種材料中,修飾硅材料的有機(jī)功能基團(tuán)是均勻分布的,這些基團(tuán)不會(huì)堵塞材料上的孔,并且易于制備。通過改變有機(jī)基團(tuán)就可以改變材料的親水性和反應(yīng)活性等。

1.3.2整體材料

整體材料[29-31]作為固定化酶的重要載體之一,由于其結(jié)構(gòu)可改變、消除了柱填充的麻煩、網(wǎng)狀小孔結(jié)構(gòu)能夠減小反壓、易于修飾等特點(diǎn),一直受到廣泛的關(guān)注。整體柱大致可以分為3類:無機(jī)整體柱[32]、有機(jī)整體柱[20-22,33]、有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱[14,19,34,35]。

無機(jī)整體柱具有表面積大、不會(huì)在有機(jī)溶劑中發(fā)生溶脹、高溫下穩(wěn)定、孔徑可調(diào)、適用于大分子和小分子物質(zhì)分析等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用,但是其制備步驟繁瑣,且pH適用范圍為2～8。由于聚多巴胺能夠沉積在多種載體上,作為前體進(jìn)一步地為引入下一步的功能基團(tuán)做準(zhǔn)備,多巴胺中的鄰苯二酚基團(tuán)還能與多種親核物質(zhì)例如巰基、氨基、咪唑基等反應(yīng)[36,37]。2012年,Messersmith等[32]在堿性條件下將多巴胺聚合修飾在二氧化硅-二氧化鈦復(fù)合整體基質(zhì)上,并且將胰蛋白酶固定到聚多巴胺修飾層上,由于在二氧化硅基質(zhì)中加入了二氧化鈦,從而顯著提高了硅膠柱在極端pH環(huán)境的穩(wěn)定性。

相比較于無機(jī)整體柱,有機(jī)整體柱具有使用pH范圍較寬、制備過程較為簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被用于蛋白質(zhì)、肽段、核酸等的分離以及酶的固定。Foo課題組[20]將胰蛋白酶(共價(jià)鍵合)、糖苷酶(包埋)分別固定到右旋糖酐(經(jīng)羧基和氨基修飾)修飾的毛細(xì)管柱和聚丙烯酰胺整體柱上,經(jīng)過右旋糖酐修飾后的毛細(xì)管柱具有表面積大的特點(diǎn),因此能夠固定更多的胰蛋白酶。聚丙烯酰胺整體柱則具有通透性好、固定后酶的活性高、傳質(zhì)快等特點(diǎn)。將兩種固定化酶反應(yīng)器進(jìn)行串聯(lián),對(duì)紅細(xì)胞生成素進(jìn)行酶解,得到的肽段通過液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析,獲得了良好的結(jié)果。Dovichi課題組[21]制備了基于聚丙烯酰胺整體柱的固定化酶反應(yīng)器,首先利用硅烷化試劑在毛細(xì)管中引入雙鍵,然后聚合制備丙烯酰胺整體柱,將聚合材料(包括丙烯酰胺、N-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺(NAS)、聚乙二醇(PEG)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(APS))與胰蛋白酶混合后通入毛細(xì)管進(jìn)行聚合反應(yīng),反應(yīng)器長(zhǎng)度只有7 cm。蛋白酶解生成后的肽段直接通過毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)。鄒漢法課題組[22]將酶-聚乙二醇-酶抑制劑包埋在聚丙烯酰胺凝膠內(nèi),并將其應(yīng)用于電泳中,制備了一種能夠在一次運(yùn)行中分別完成蛋白質(zhì)電泳分離和酶解的固定化酶反應(yīng)器。該固定化酶反應(yīng)器首先在堿性條件下抑制酶的活性,對(duì)蛋白質(zhì)復(fù)雜樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后在低pH下釋放酶的活性,對(duì)電泳分離后的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。2013年,Krenkova等[33]將肽-N-糖苷酶F固定到修飾后的聚甲基丙烯酸酯-Co-乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱上,整體柱經(jīng)過谷胱甘肽、琥珀酰亞胺基-6-[(碘乙?；?氨基]己酸修飾后,將肽-N-糖苷酶F固定到整體柱上,用于糖蛋白上多糖的釋放,然后用8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS)標(biāo)記多糖進(jìn)行毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法分離檢測(cè)。

有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱中同時(shí)存在有機(jī)和無機(jī)組分,無機(jī)部分可提供機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定的聚合骨架,而結(jié)合于無機(jī)相上且均勻分布的有機(jī)基團(tuán)可以改善材料的性能。有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱具有無機(jī)整體柱、有機(jī)整體柱兩者的優(yōu)勢(shì):pH適用范圍廣,制備步驟簡(jiǎn)單,不受有機(jī)溶劑影響。

張維冰課題組[8]利用戊二醛交聯(lián)和Cu2+螯合將胰蛋白酶和糜蛋白酶固定到摻雜SBA-15的有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱上,兩種酶分別固定到整體基質(zhì)和SBA-15納米顆粒上。與傳統(tǒng)的單酶反應(yīng)器相比,雙酶反應(yīng)器具有更高的酶解效率,通過對(duì)比將單酶反應(yīng)器與雙酶反應(yīng)器酶解鼠肝膜蛋白的效率,該課題組發(fā)現(xiàn)雙酶反應(yīng)器顯著增加了肽段個(gè)數(shù)。

張玉奎課題組[14,19,34,35]做了一系列的工作。首先,以四氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷為單體,十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)為模板劑,水為引發(fā)劑,在毛細(xì)管內(nèi)聚合制備有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱,然后通過戊二醛將酶交聯(lián)到整體柱上。先通過反相液相色譜進(jìn)行蛋白質(zhì)分離,利用中空纖維膜接口切換進(jìn)入固定化酶反應(yīng)器的溶劑以利于酶解,酶解的肽段經(jīng)反相液相色譜分離,強(qiáng)陽離子交換柱除鹽后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)分析。該課題組又以四甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷為單體,水解縮聚形成硅膠骨架,并在骨架形成過程中加入甲基丙烯酸,形成有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱,同時(shí)以聚乙烯亞胺修飾,加入EDC和NHS活化羧基,共價(jià)鍵合上胰蛋白酶。這種甲基丙烯酸-二氧化硅雜化整體柱的親水性較強(qiáng),對(duì)蛋白質(zhì)和酶解肽段幾乎沒有吸附,通透性好。該課題組通過一步法制備了一種有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱,聚合單體為γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷,首先將γ-縮水甘油醚丙基三甲氧基硅烷(GLYMO)與金屬螯合試劑亞氨基二乙酸(IDA)反應(yīng),生成的產(chǎn)物為溶液A,然后通過四乙氧基硅烷(TEOS)的水解得到溶液B,將兩溶液按一定比例混合后通入毛細(xì)管反應(yīng)形成有機(jī)-無機(jī)整體基質(zhì),最后再通入Cu2+螯合固定胰蛋白酶,并用鼠肝提取物進(jìn)行了評(píng)價(jià)。相對(duì)于自由溶液酶解(483個(gè)),制備的酶反應(yīng)器酶解產(chǎn)物中檢測(cè)出了更多的蛋白質(zhì)(541個(gè)),而酶解時(shí)間從24 h縮短到15 s。

1.3.3聚合物材料

聚合物材料因制備簡(jiǎn)單、易于修飾且具有良好的生物相容性而被廣泛用作固定酶的載體。錢小紅課題組[23]利用轉(zhuǎn)移自由基聚合(SI-ATRP)技術(shù)將胰蛋白酶共價(jià)鍵合到修飾后的Fe3O4納米磁性顆粒上。首先在Fe3O4納米磁性顆粒上修飾上一層二氧化硅,然后用硅烷化試劑引入三乙氧基硅烷基團(tuán),利用表面原子引起的自由基轉(zhuǎn)移聚合技術(shù),在修飾后的納米磁性顆粒表面形成毛發(fā)鏈狀親水性聚合物,用于固定胰蛋白酶。2014年,該課題組[24]又使用相同的方法,在修飾后的納米磁性顆粒表面形成毛發(fā)鏈狀親水性聚合物和疏水性聚合物,形成一種雙基質(zhì)的載體。相比較于其他方法,這種方法能夠很好地控制聚合的密度和結(jié)構(gòu),得到的毛發(fā)狀聚合物為胰蛋白酶的固定提供了足夠大的表面積和更多的共價(jià)結(jié)合位點(diǎn),固酶量顯著提高。同時(shí)聚合物鏈之間是非交聯(lián)的,因此蛋白質(zhì)能夠深度進(jìn)入聚合物鏈內(nèi)部,增加了蛋白質(zhì)與酶接觸的幾率,從而減少了酶解時(shí)間;另外,固定化蛋白酶的磁性納米顆粒能夠很容易地用磁鐵移除,相比較于自由溶液酶解,其具有更高的酶解效率。采用雙基質(zhì)載體固定胰蛋白酶后,利用酵母和鼠肝膜蛋白對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),經(jīng)親水和疏水酶反應(yīng)器酶解后只有60%的重復(fù)率,顯示出較強(qiáng)的互補(bǔ)性。Ma等[25]將左旋天冬酰胺酶固定到聚(2-乙烯基-4,4-二甲基吖內(nèi)酯)(PVDMA)修飾的Fe3O4納米顆粒上,固酶量達(dá)到318.0 μg/mg。PVDMA具有很好的生物相容性,經(jīng)PVDMA修飾的這種磁性納米材料具有操作性強(qiáng)、多功能性、顯著提高酶活性等特點(diǎn)。為減少蛋白質(zhì)和肽段在固定化酶反應(yīng)器中的非特異性吸附,2012年,張玉奎課題組[38]用N-乙烯基-吡咯烷酮修飾聚丙烯酸酯微球來提高載體親水性,減少非特異性吸附,然后將胰蛋白酶共價(jià)鍵合到修飾后的聚丙烯酸酯微球上,最后將微球填充到毛細(xì)管柱內(nèi)制備成胰蛋白酶反應(yīng)器。

1.3.4膜材料

膜材料由于其廣泛的應(yīng)用價(jià)值而備受關(guān)注,在血液透析、消毒、污水處理等方面都起著至關(guān)重要的作用。隨著電子束激發(fā)技術(shù)的發(fā)現(xiàn),Schulze等[39-41]利用該技術(shù)將膜表面直接嫁接上有機(jī)功能分子,通過這種方法改變膜的親水性。Starke等[42]采用一步法利用電子束激發(fā)將胰蛋白酶通過共價(jià)鍵合固定到膜材料上,并對(duì)膜的多孔性、膜的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行了考察,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法測(cè)定固定酶的濃度,固定到孔徑為0.2 μm聚醚砜膜和聚偏二氟乙烯膜上的胰蛋白酶分別達(dá)到了3.48 μg/cm2和2.46 μg/cm2。實(shí)驗(yàn)表明通過電子束激發(fā)這種技術(shù)固定上的酶具有良好的活性。Feng等[43]將過氧化氫酶通過Cu2+螯合固定到聚乙烯醇/尼龍6(PVA/PA6)膜上制備成膜反應(yīng)器,基于多孔膜材料的酶反應(yīng)器具有同時(shí)進(jìn)行酶解反應(yīng)與產(chǎn)物分離的能力,加快了酶解反應(yīng)的速度,提高了轉(zhuǎn)化率，在這種材料上的固酶量達(dá)到了(64.0±4.6) mg/g。

2 總結(jié)與展望

固定化酶反應(yīng)器作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中“bottom-up”策略重要的組件,在蛋白質(zhì)鑒定過程中扮演著重要的角色。與自由溶液酶解相比,固定化酶反應(yīng)器具有眾多的優(yōu)點(diǎn),最為重要的是固定化酶反應(yīng)器能夠與多種儀器聯(lián)用,例如HPLC、CE、MS等在線聯(lián)用,從而建立起分析平臺(tái),對(duì)于發(fā)展蛋白質(zhì)的快速鑒定具有重要的意義。近年來,多種新穎的載體已用于固定化酶,制備新型的固定化酶反應(yīng)器仍然是當(dāng)前的熱點(diǎn)。此外,固定化酶反應(yīng)器與多種儀器聯(lián)用以及其兼容性考察也是重要的研究方向。

[1] Switzar L, Giera M, Niessen W M A. J Proteome Res, 2013, 12(3): 1067

[2] Compton P D, Zamdborg L, Thomas P M, et al. Anal Chem, 2011, 83(17): 6868

[3] Hartmann M, Kostrov X. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6277

[4] Magner E. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6213

[5] Sheldon R A, van Pelt S. Chem Soc Rev, 2013, 42(15): 6233

[6] Lakouraj M M, Maashsani A, Norouzian R S, et al. J Carbohydr Chem, 2015, 34(2): 103

[7] Bian Y Y, Ye M L, Song C X, et al. J Proteome Res, 2012, 11(5): 2828

[8] Shangguan L L, Zhang L Y, Xiong Z C, et al. J Chromatogr A, 2015, 1388: 158

[9] Ma J F. [PhD Dissertation]. Dalian: Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences (馬俊峰. [博士學(xué)位論文]. 大連: 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所), 2009

[10] Temporini C, Calleri E, Cabrera K, et al. J Sep Sci, 2009, 32(8): 1120

[11] Jiang B, Yang K G, Zhao Q, et al. J Chromatogr A, 2012, 1254: 8

[12] Yin Z R, Zhao W W, Tian M M, et al. Analyst, 2014, 1397(7): 1973

[13] Min W N, Wang W P, Chen J R, et al. Anal Bioanal Chem, 2012, 404(8): 2397

[14] Ma J F, Hou C Y, Liang Y, et al. Proteomics, 2011, 11(5): 991

[15] Zhou Z, Hartmann M. Top Catal, 2012, 55(16): 1081

[16] Li Y H, Wojcik R, Dovichi N J, et al. J Chromatogr A, 2011, 1218: 2007

[17] Sun L L, Li Y H, Yang P, et al. J Chromatogr A, 2012, 1220: 68

[18] Bao H M, Zhang L Y, Chen G. J Chromatogr A, 2013, 1310: 74

[19] Yuan H M, Zhang L H, Zhang Y K. J Chromatogr A, 2014, 1371: 48

[20] Foo H C, Smith W N, Stanley M R S. Talanta, 2015, 135: 18

[21] Sun L L, Zhu G J, Dovichi N J, et al. Anal Chem, 2013, 85(8): 4187

[22] Liu F J, Ye M L, Wang C L, et al. Anal Chem, 2013, 85(15): 7024

[23] Qin W J, Song Z F, Fan C, et al. Anal Chem, 2012, 84(7): 3138

[24] Fan C, Shi Z M, Pan Y T, et al. Anal Chem, 2014, 86(3): 1452

[25] Mu X Y, Qiao J, Qi L, et al. Appl Mater Interfaces, 2014, 6(23): 21346

[26] Ju H Y, Kuo C H, Too J R, et al. J Mol Catal B: Enzym, 2012, 78: 9

[27] Malvi B, Gupta S S. Chem Commun, 2012, 48(63): 7853

[28] Zhou Z, Piepenbreier F, Marthala V R R, et al. Catal Today, 2015, 243: 173

[29] Arrua R D, Talebi M, Causon T J, et al. Anal Chim Acta, 2012, 738: 1

[30] Connolly D, Currivan S, Paull B. Proteomics, 2012, 12(19): 1

[31] Walsh Z, Paull B, Macka M. Anal Chim Acta, 2012, 750: 28

[32] Rivera J G, Messersmith P B. J Sep Sci, 2012, 35(12): 1514

[33] Krenkova J, Szekrenyes A, Keresztessy Z, et al. J Chromatogr A, 2013, 1322: 54

[34] Ou J J, Lin H, Zhang Z B, et al. Electrophoresis, 2013, 34(1): 126

[35] Yuan H M, Zhou Y, Xia S M, et al. Anal Chem, 2012, 84(11): 5124

[36] Zeng R J, Luo Z F, Zhou D, et al. Electrophoresis, 2010, 31(19): 3334

[37] Jia M, Qin L, He X W, et al. J Mater Chem, 2012, 22: 707

[38] Jiang H, Yuan H M, Liang Y, et al. J Chromatogr A, 2012, 1246: 111

[39] Schulze A, Marquardt B, Kaczmarek S, et al. Macromol Rapid Commun, 2010, 31(5): 467

[40] Schulze A, Marquardt B, Went M, et al. Water Sci Technol, 2012, 65(3): 574

[41] Schulze A, Maitz M F, Zimmermann R, et al. RSC Adv, 2013, 3(44): 22518

[42] Starke S, Went M, Prager A, et al. React Funct Polym, 2013, 73(5): 698

[43] Feng Q, Zhao Y, Wei A F, et al. Environ Sci Technol, 2014, 48(17): 10390

Development of preparation of immobilized enzyme reactors in proteomics

ZHANG Lingyi1, WANG Bingbing1, SHANGGUAN Lulu1, ZHANG Runsheng2, CHEN Jianhu1, ZHANG Weibing1*

(1.ShanghaiKeyLaboratoryofFunctionalMaterialsChemistry,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China; 2.ShanghaiKeyLaboratoryofCrimeSceneEvidence,ShanghaiResearchInstituteofCriminalScienceandTechnology,ShanghaiPublicSecurityBureau,Shanghai200083,China)

As an important part in “bottom-up” strategy of proteomics, immobilized enzyme reactors have great significance in the development of fast and more efficient protein analytical method, owing to its advantages of high speed and enzymatic efficiency, good stability and activity, easy operation, and the possibility of hyphenating with multiple detection instruments. In this paper, the preparation methods of immobilized enzyme reactors and their applications in proteomic investigation are introduced, focusing on the nature of enzymes, the immobilization methods and the carrier materials used for immobilizing enzyme. In recent years, the investigations are focused on increasing the immobilization amounts of enzyme, keeping enzymatic activity, improving enzymatic efficiency and decreasing nonspecific adsorption. The investigation results showed that by using novel carriers such as nanomaterial and monolith, increasing of hydrophilicity of carrier and tandem hydrolysis with multiple enzymes can greatly improve the performance of immobilized enzyme reactors and increase protein identification efficiencies.

immobilized enzyme reactors; enzyme; carrier material; proteomics; preparation

10.3724/SP.J.1123.2015.06028

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2012YQ120044);上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院開放課題.

2015-06-17

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1121-05

特殊選擇性分離介質(zhì)的制備專欄·專論與綜述

*通訊聯(lián)系人.E-mail:weibingzhang@ecust.edu.cn.