牡蠣蛋白活性肽的分離及生物活性研究進(jìn)展

陳艷輝，李超柱，黎丹戎

（1．欽州學(xué)院，廣西欽州535000；2．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021）

牡蠣蛋白活性肽的分離及生物活性研究進(jìn)展

陳艷輝1，李超柱1，黎丹戎2

（1．欽州學(xué)院，廣西欽州535000；2．廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西南寧530021）

牡蠣活性肽是海洋天然產(chǎn)物研究的重要組成部分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，牡蠣活性肽在抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖等方面具有特殊的生理活性。就牡蠣蛋白質(zhì)酶解法制備活性肽的分離純化技術(shù)、牡蠣活性肽的生物活性作用等研究進(jìn)展進(jìn)行概述，為牡蠣活性肽的深入研究提供參考。

牡蠣；活性肽；酶解產(chǎn)物；分離純化

浩瀚的海洋是人類保健和藥品的天然寶庫，迄今，人們已從各類海洋生物中分離獲得14 500余種具有各種結(jié)構(gòu)類型的海洋天然產(chǎn)物，近1/2具有各種生物活性；更重要的是超過0.1%的化合物結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，活性顯著，已成為先導(dǎo)化合物或新藥來源［1］。海洋天然活性肽是海洋藥物研究的重要組成部分，它們顯示出多種多樣的生理活性，如抗腫瘤活性、抗氧化性、抗高血壓性、抗凝血、抗菌性、免疫活性、降血糖等［2-6］。但天然存在的海洋活性肽等在生物體中含量低，而且分離純化困難，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)［7］。為解決這一瓶頸問題，人們想到利用特異的蛋白酶水解，使其釋放出具有活性的肽。由于酶法生產(chǎn)活性肽產(chǎn)品安全性極高，生產(chǎn)條件溫和，水解易控制，可定位生產(chǎn)特定的肽，成本低，故已成為最主要的生產(chǎn)方法。該法還有一個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)，就是可以將一些“惰性蛋白”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盎钚噪摹?。牡蠣的蛋白質(zhì)含量高，是采用酶解法制備生物活性肽的良好原料?，F(xiàn)就牡蠣蛋白質(zhì)酶解法制備活性肽及分離純化技術(shù)、牡蠣活性肽作用方面的研究最新進(jìn)展作一簡述。

1酶解牡蠣蛋白質(zhì)制備活性肽及分離純化

牡蠣蛋白質(zhì)酶解法制備活性肽及分離純化工藝一般流程為：牡蠣→剝殼取肉→清洗→勻漿→酶解→滅酶→離心取上清液→酶解粗提物→分離純化→活性肽。

1.1小于1 kDa肽的制備及分離純化

于婭等［8］用堿性蛋白酶Alcalase18 U/kg于60℃、pH8.5下對(duì)脫脂牡蠣干粉進(jìn)行恒溫水解4 h，對(duì)酶解粗提物選擇Sep hadex G-15凝膠柱，用醋酸-醋酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，收集到5個(gè)組分，其中2、3、4組分具有很強(qiáng)的ACE（血管緊張轉(zhuǎn)化酶）抑制活性的短肽，其相對(duì)分子質(zhì)量在202～602之間，即大致為2肽～5肽的牡蠣短肽。

馮曉梅等［9］采用胰蛋白酶5%濃度于45℃、pH8.0對(duì)牡蠣蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解4 h，使其釋放出具備特殊活性的活性肽，粗提物上Sephadex G-25凝膠色譜柱，經(jīng)NH4HCO3緩沖液洗脫，得到F1、F2、F3、F4 4個(gè)組分，取純度和含量較多的組分F3和F4繼續(xù)上DEAE2Sepharose FF離子交換色譜，用NaCl梯度洗脫，經(jīng)過進(jìn)一步分離純化獲得F31、F32、F41組分。TOF-MS測定結(jié)果顯示樣品純度較高，同時(shí)測得F31、F32、F41的相對(duì)分子質(zhì)量分別為885、810及409。

余杰等［10］采用復(fù)合酶2 614 U/g底物在溫度45℃，底物質(zhì)量濃度15.3 g/L條件下對(duì)牡蠣蛋白酶解3 h，取上清液，過Sephadex G-25柱，采用pH7.0，0.02 mol/L磷酸緩沖液進(jìn)行分級(jí)分離，獲得一種活性肽并命名為BPO，并根據(jù)BPO的洗脫體積和標(biāo)準(zhǔn)曲線求出其相對(duì)分子質(zhì)量為751。

歐成坤［11］等采用537酸性蛋白酶酶解牡蠣蛋白質(zhì)，通過高效液相色譜分析了水解度為16%的酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布，具有特殊功能活性的肽對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量為568和203，主要由2肽到5肽的多肽類物質(zhì)。

1.2小于2 kDa肽的制備及分離純化

汪秋寬等［12］采用木瓜蛋白酶于150 min、pH7.0、酶用量6%、溫度45℃條件下對(duì)牡蠣肉進(jìn)行酶解，將牡蠣酶解液離心，用相對(duì)分子質(zhì)量截留量為30 000的膜組件進(jìn)行超濾，超濾后用SephadexG-15凝膠柱分離，收集柱層析分離的洗脫液，洗脫液在280 nm下有兩個(gè)吸收峰，其清除自由羥基、超氧自由基的作用很顯著，估算其蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 191和826左右。而采用中性蛋白酶在酶用量3%、溫度65℃、時(shí)間110 min、pH6.0條件下對(duì)牡蠣肉進(jìn)行酶解，酶解液處理與上述方法操作相同，結(jié)果洗脫液在280 nm下的2個(gè)吸收峰的蛋白肽組分的自由羥基清除活性最強(qiáng)，估算其相對(duì)分子質(zhì)量分別為1 074和735左右。

周敏華［13］等采用胰酶（2.4×105U/g）水解近江牡蠣制備高F值寡肽，其方法是將牡蠣蛋白按底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)16.4%、胰酶添加量15 000 U/g、pH 9.32、溫度49℃酶解4 h，然后將酶解液用活性碳吸附，取上清液，用Biogel P2凝膠層析法，采用碳酸氫銨作為洗脫液洗脫，可得到F值大于20的寡肽混合物，其相對(duì)分子質(zhì)量約1 450～800。

1.3小于5 kDa肽的制備及分離純化

周先果［14］采用胰蛋白酶（1∶250）酶解牡蠣肉，其酶解條件為：加酶量2%，pH8.0，溫度45℃酶解6 h，將酶解液上清用1%殼聚糖醋酸溶液進(jìn)行絮凝法除雜質(zhì)后，常溫下再離心即得粗提物。將粗提物上SephadexG-25葡聚糖凝膠柱，用NH4HCO3緩沖液洗脫，結(jié)果層析圖譜出現(xiàn)4個(gè)洗脫峰，經(jīng)采用常規(guī)Tris-甘氨酸系統(tǒng)SDS-PAGE與小肽Tricine-SDS-PAGE電泳相結(jié)合的方法分析SephadexG-25層析柱各個(gè)層析峰的肽段分布情況可知，G-25Ⅳ峰：主要為小于2 512 Da的小肽等物質(zhì)。

陳艷輝等［15］采用動(dòng)物蛋白水解酶在60℃、酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0‰、水解時(shí)間為4 h的條件下水解牡蠣蛋白質(zhì)，酶解液經(jīng)滅酶和脫色后，經(jīng)柱層析、超濾膜分離（采用MWCO3000超濾膜）獲得分子量小于3 000 Da的具有較好抗癌活性的牡蠣活性肽。

張輝［16］采用胰蛋白酶（1∶250）酶解牡蠣肉，在加酶量為2%、pH8.0、45℃條件下酶解6 h后，4℃離心30 min，上清液即得牡蠣酶解液。酶解液經(jīng)過Sephadex G-50柱層析后得到兩個(gè)峰，收集第Ⅱ峰，由凝膠層析結(jié)果可粗略估算出牡蠣酶解活性肽G-50Ⅱ峰的相對(duì)分子質(zhì)量小于5 kDa。

2牡蠣活性肽的生物活性作用的研究

2.1抗腫瘤作用

2.1.1誘導(dǎo)分化腫瘤細(xì)胞

細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)是細(xì)胞行使細(xì)胞功能的基礎(chǔ)和表現(xiàn)，其改變在一定程度上可反映細(xì)胞相關(guān)功能活動(dòng)狀態(tài)的變化。因此，誘導(dǎo)分化處理前后腫瘤細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)特征的改變是判斷腫瘤細(xì)胞是否逆轉(zhuǎn)分化的一個(gè)重要指標(biāo)［17-19］。

梁盈等［20］為了研究牡蠣低分子活性肽BPO-L對(duì)人肺腺癌A 549細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響，分別采用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察了經(jīng)0.1 mg/mLBPO-L處理后的A 549細(xì)胞，結(jié)果表明，BPO-L能有效的改變肺癌細(xì)胞的惡性形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)特征，使之出現(xiàn)與正常細(xì)胞相似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，由此說明牡蠣活性肽BPO-L對(duì)人肺腺癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化作用。

李祺福等［21］以HMBA處理組為平行對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化及以免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測相關(guān)癌基因、抑癌基因表達(dá)變化，研究牡蠣低分子活性多肽組分BPO-L對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞分化的生物學(xué)效應(yīng)，探索其對(duì)肺癌細(xì)胞的作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BPO-L能有效抑制A549細(xì)胞增殖活動(dòng)，促使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。在此過程中，A549細(xì)胞myc，MTp53等癌基因蛋白表達(dá)減弱，p21WAF1/CIP1和Rb等抑癌基因蛋白表達(dá)活性的增強(qiáng)。證實(shí)BPO-L對(duì)肺癌細(xì)胞具有顯著的誘導(dǎo)分化作用。

黃大川［22］應(yīng)用從僧帽牡蠣中分離提取的牡蠣低分子活性肽BPO-L處理人肺腺癌A549細(xì)胞，觀察鑒定牡蠣低分子活性肽對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及其作用性質(zhì)，并進(jìn)一步探索牡蠣低分子活性肽對(duì)人肺腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。結(jié)果表明，BPO-L能有效抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、分裂活動(dòng)，細(xì)胞周期明顯阻滯G0/G1期。光鏡、透射電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)BPO-L處理后的A549細(xì)胞趨于扁平鋪展?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞體積增大，核質(zhì)比例減小，核形狀較為規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)減少，常染色質(zhì)增多，高爾基體較為典型發(fā)達(dá)，粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，多聚核糖體減少，分泌顆粒增多。

2.1.2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞增殖

腫瘤是一種細(xì)胞增殖與死亡障礙性疾病，凋亡調(diào)控機(jī)制失常在惡性腫瘤的演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用，故腫瘤治療的關(guān)鍵是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

余杰等［10］檢測牡蠣活性肽BPO誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。結(jié)果表明，BPO誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的效應(yīng)主要通過對(duì)細(xì)胞周期阻滯和激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)；BPO的作用機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡基因Caspase3 mRNA表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞周期（G0/G1期）阻滯有關(guān)。

周先果［14］觀察牡蠣活性肽BPO G50-Ⅱ在不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)人舌鱗癌細(xì)胞株（Tca8l13）體外增值的抑制作用；應(yīng)用倒置相差顯微鏡、H.E染色和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變；AO-EB熒光法觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，牡蠣活性肽BPO G50-Ⅱ?qū)θ松圜[癌細(xì)胞株（Tca8113）體外增殖具有抑制作用，并能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。廖共山［23等也探討牡蠣活性肽BPO G50-II對(duì)人舌鱗癌Tea8113細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果與周先果相同。

李鵬［24］等為研究牡蠣活性肽組分BPO-1對(duì)人胃腺癌BGC-823細(xì)胞周期與基因表達(dá)的調(diào)控，結(jié)果顯示，牡蠣天然活性肽BPO-1對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過凋亡的誘導(dǎo)而表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。李夏［25］對(duì)牡蠣胰蛋白酶抑制劑的制備及其抗腫瘤活性的研究也表明，牡蠣胰蛋白酶抑制劑對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞生長有明顯的抑制作用。

2.1.3增強(qiáng)機(jī)體免疫功能

免疫活性肽不僅能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，在動(dòng)物體內(nèi)起著重要免疫調(diào)節(jié)作用，而且還能刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)免疫器官的免疫應(yīng)答能力及巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體對(duì)外界病源物質(zhì)的抵抗能力，從而降低腫瘤的發(fā)生率［26］。李超柱等［27］以小鼠脾淋巴細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停ㄟ^淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞、分子水平研究牡蠣活性肽（利用動(dòng)物蛋白水解酶水解牡蠣肉所得的分子質(zhì)量小于3 kDa的肽）對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的免疫抑制活性及作用機(jī)制。結(jié)果表明，牡蠣活性肽可以抑制小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2和TNF-γ，由此推測牡蠣活性肽可能是通過抑制細(xì)胞因子的分泌來產(chǎn)生免疫抑制作用。提示牡蠣活性肽可提高人體的細(xì)胞免疫功能而防止腫瘤的發(fā)生。

2.2抗氧化作用

自由基參與許多生理和病理過程，是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物。人體內(nèi)自由基含量隨年齡增長而積累，過多的自由基會(huì)導(dǎo)致DNA的氧化破壞、蛋白質(zhì)交聯(lián)和肽鍵斷裂、酶和激素失活、發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂褐素（老年斑），沉積于心、腦、腎等器官使其功能減弱，機(jī)體免疫能力下降。自由基清除劑作為抗氧化物能不同程度地清除人體內(nèi)積累的自由基。

周先果［14］為了探討牡蠣酶解液的抗氧化活性，用普魯士藍(lán)反應(yīng)法測定牡蠣酶解液還原能力，在DPPH體系、Fenton體系和鄰苯三酚自氧化體系中分別檢測牡蠣酶解液清除二苯代苦味酞自由基、羥基自由基和超氧陰離子的能力，并考察牡蠣酶解液在Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸（PUEA）過氧化體系中的抗氧化作用。結(jié)果表明，牡蠣酶解液清除羥基自由基的效果較強(qiáng)，是硫脲的3.5倍；牡蠣酶解液也具有較強(qiáng)的清除二苯代苦味酞自由基的能力；在Fe2+誘發(fā)卵黃脂蛋白過不飽和脂肪酸（PUFA）過氧化體系中有明顯的抑制作用。

汪秋寬等［28］分別檢測了牡蠣木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解液體外自由羥基清除活性和體內(nèi)抗氧化活性。結(jié)果表明，當(dāng)分子量為1 191 Da和826 Da左右的木瓜蛋白酶酶解活性肽組分體外清除羥自由基活性分別達(dá)到53.6%和66.5%；當(dāng)分子量分別為1 074 Da和735 Da左右的中性蛋白酶酶解活性肽組分體外羥自由基清除活性分別57.6%和70.5%。對(duì)小鼠肝臟GSH-PX酶、SOD活力、GSH含量顯著提高，肝臟MDA含量顯著降低。歐成坤［11］等研究結(jié)果顯示，采用537酸性蛋白酶酶解牡蠣蛋白質(zhì)，在水解度為16%的酶解產(chǎn)物中的肽對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量為568和203肽，對(duì)二苯代苦味酞自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除的能力。

2.3降血壓作用

降血壓肽是通過抑制人體中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶ACE的活性而達(dá)到降血壓作用。ACE是腎Ⅰ血管緊張素系統(tǒng)中對(duì)調(diào)節(jié)血壓起重要作用的酶，它通過去除血管緊張素Ⅰ的碳末端His-Leu生成有血管收縮活性的血管緊張素Ⅱ，同時(shí)使舒緩激肽失活，引起血壓升高［29-30］。故評(píng)價(jià)牡蠣活性肽的降血壓作用主要看ACE抑制的效果。

張輝［16］用堿性蛋白酶所得牡蠣酶解液經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析的產(chǎn)物，測定對(duì)ACE的抑制作用。結(jié)果表明，Sephadex G-25Ⅲ組分對(duì)ACE抑制率達(dá)到60.44%。

于婭等［8］通過HPLC法定量馬尿酸測定堿性蛋白酶酶解牡蠣蛋白的各組分短肽的ACE抑制活性。結(jié)果表明，牡蠣水解液為2肽到5肽的牡蠣短肽具有很強(qiáng)的ACE抑制活性。歐成坤［11］等研究結(jié)果顯示，采用537酸性蛋白酶酶解牡蠣蛋白質(zhì)，在水解度為16%的酶解產(chǎn)物中的肽對(duì)應(yīng)相對(duì)分子質(zhì)量為568和203肽，對(duì)ACE的抑制率為71.71%。

2.4降血糖作用

血糖升高是糖尿病的一個(gè)重要特征，測定各種條件下血糖含量是了解動(dòng)物病情發(fā)展程度和藥物作用的重要手段。張輝［31］采用腹腔注射四氧嘧啶造糖尿病模型小鼠，牡蠣活性肽低、中、高劑量組按0.5、1、2 g/kg灌胃，研究了牡蠣活性肽BPO不同劑量對(duì)其的降血糖作用效果。結(jié)果顯示，牡蠣活性肽能顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的高血糖，其降血糖效果呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，一定范圍內(nèi)劑量增加則降糖效果增加。

3展望

從牡蠣中制取純度高、活性好、安全性強(qiáng)的生物活性肽藥物成分具有十分良好的發(fā)展前景。我國對(duì)牡蠣的應(yīng)用開發(fā)己開展了很多研究工作，并有商業(yè)產(chǎn)品面市，但與國外發(fā)達(dá)國家相比存在較大的差距。由于目前研究中的牡蠣蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物一般是各種肽段的混合物，活性效果也往往是多種肽段活性協(xié)作的結(jié)果。故今后對(duì)牡蠣蛋白質(zhì)酶解法制備活性肽及分離純化技術(shù)應(yīng)不斷改進(jìn)，同時(shí)要設(shè)法提高多肽類物質(zhì)的分析鑒定效率。相信隨著科技的快速發(fā)展，一些先進(jìn)的儀器和手段被應(yīng)用后，國內(nèi)在牡蠣活性肽的研究方面必將會(huì)取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展。

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The Progress on Biological Activity and Separation of the Bioactive Peptides of Oyster Protein

CHEN Yan-hui1，LI Chao-zhu1，LI Dan-rong2
（1.Qinzhou College，Qinzhou 535000，Guangxi，China；2.Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Oyster active peptides are an important part of research on the natural marine product.Modern medical studies showed that oyster bioactive peptides have special physiological activity，such as anti-tumor，anti-oxidation，lowering blood pressure，blood sugar and so on.The enzymatic preparation and purification technology of bioactive peptides from oyster proteins，the biological activity of oyster active peptides were summarized，which will provide a reference for further study of oyster bioactive peptides.

oyster；bioactive peptide；hydrolysates；isolationandpurifieation

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.033

2014-06-11

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2014GXNSFAA118066）；廣西教育廳科研立項(xiàng)項(xiàng)目（2013LX162）

陳艷輝（1958—），女（漢），教授，本科，研究方向：天然產(chǎn)物有機(jī)化學(xué)。