豬流行性腹瀉病毒分子結(jié)構(gòu)、診斷技術(shù)和疫苗的研究進展

張 月　王 敏　胡莉萍　李玉杰　孔祥華　曹振山　姜秀云（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心　山東 濟南 250022）

豬流行性腹瀉病毒分子結(jié)構(gòu)、診斷技術(shù)和疫苗的研究進展

張 月王 敏胡莉萍李玉杰孔祥華曹振山姜秀云*（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心山東 濟南 250022）

豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，可以引起豬嚴(yán)重的腹瀉與脫水，導(dǎo)致仔豬早期死亡的重要病原之一。該病毒首次在歐洲被發(fā)現(xiàn)，隨后傳播到許多亞洲國家。豬流行性腹瀉已成為世界流行性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)包括疫苗防疫和疫病診斷方面都造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。近幾年來，隨著該病毒分子機制了解的深入，加快了檢測手段以及疫苗研制的研究步伐，使得大量有效的新疫苗問世。本文詳細(xì)分析了豬流行性腹瀉病毒分子結(jié)構(gòu)和遺傳特性，深入探討了近期診斷技術(shù)和可行性疫苗等方面的研究進展，為該病的研究和預(yù)防提供參考。

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染?。?］。PED于1971年在英國的養(yǎng)殖場首次出現(xiàn)，隨后傳遍整個歐洲大陸，以冬季零星爆發(fā)為主要特征，起初命名為流行病毒腹瀉（EVD）。1978年，人們實驗證實了CV777病毒株是引起仔豬與育肥豬腸道致病感染的病原后，該病又被重新命名為豬流行性腹瀉（PED）［2］。PEDV具有與冠狀病毒科冠狀病毒屬其他成員同樣的形態(tài)結(jié)構(gòu)。該病毒粒子是多形態(tài)的，大致呈球形，其平均直徑（包括纖突）約130nm，范圍為95～1990nm，但是它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)仍然不清楚。病毒的抵抗力不強，對乙醚、氯仿等敏感，一般的消毒劑即可將其殺滅，在蔗糖中的浮力密度為1.18g/ml，病毒沒有血凝性。PEDV主要結(jié)構(gòu)蛋白包括：纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）和小包膜蛋白（E）。PEDV適應(yīng)株經(jīng)60℃或以上處理30min即可失去感染能力，但在50℃以及在4℃ pH 5.0～9.0及37℃ pH 6.5～7.5時相對穩(wěn)定［3］。與其他冠狀病毒相比，PEDV的人工細(xì)胞培養(yǎng)很難獲得成功。最初病毒的培養(yǎng)是經(jīng)口腔接種3至5日齡仔豬，然后收集腹瀉早期的仔豬小腸及其內(nèi)容物。后來，科學(xué)家成功將PEDV接種到Vero細(xì)胞并可以傳代培養(yǎng)，但前提條件是在無血清的培養(yǎng)液中加入10～100μg/ml胰蛋白酶，細(xì)胞會產(chǎn)生空泡或者多核等是病變結(jié)構(gòu)。

1　PEDV的分子結(jié)構(gòu)和遺傳特性

（1）PEDV是一種被膜病毒，它的基因組是單股正鏈具有感染性的RNA，全長約28Kb，兩端帶有帽子結(jié)構(gòu)（Cap）和Poly（A）尾巴?；蚪M包含5′非編碼區(qū)（UTR）、3′UTR和7個開放閱讀框（ORF）。這7個ORF編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（S、E、M、N）和3個非結(jié)構(gòu)蛋白（復(fù)制酶1a、復(fù)制酶1b 和ORF3），從5′～3′端依次為：復(fù)制多聚蛋白基因1a1b-S基因-ORF3基因-E基因-M基因-N基因［5，6］。（2）S蛋白是種Ⅰ型糖蛋白，由1383個氨基酸（aa）組成，分子量為150-220kDa。它包含一個信號肽區(qū)（1～18aa），四個中和位點區(qū)域（499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa），一個跨膜區(qū)（1334-1356aa）和一個較短的胞內(nèi)區(qū)。根據(jù)冠狀病毒S蛋白的同源性可以將其分為S1（1-789aa）和S2（790-1383）兩個結(jié)構(gòu)域。S蛋白位于病毒粒子的表面，當(dāng)位于細(xì)胞表面上的受體與病毒粒子結(jié)合后，S蛋白就會通過膜融合方式侵入到宿主細(xì)胞內(nèi)并在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。除了在介導(dǎo)免疫方面的作用外，S蛋白還具有促進病毒與細(xì)胞膜的融合、識別靶細(xì)胞等其它生物學(xué)作用。此外，根據(jù)與病毒在體外培養(yǎng)適應(yīng)增殖，體內(nèi)培養(yǎng)毒力減弱這一特性，S蛋白成為研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白?？茖W(xué)家們主要是通過S基因的結(jié)構(gòu)來探究PEDV各病毒株之間的遺傳關(guān)系，流行性病學(xué)以及基因突變和病毒功能等方面［7-9］。（3）M蛋白是病毒粒子被膜中含量最多的一種成份，由226個氨基酸組成，分子量為20～30kDa。M蛋白由3個結(jié)構(gòu)域組成：暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端區(qū)、位于中間位置的α螺旋區(qū)以及處于病毒囊膜中大的C末端區(qū)［10］。M蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，同時能夠刺激機體產(chǎn)生免疫保護，另外M蛋白介導(dǎo)機體產(chǎn)生a-IFN，所以可以作為PEDV基因工程疫苗的候選基因［11-14］。（4）N蛋白是基礎(chǔ)性的磷酸化的核衣殼蛋白，共由441個氨基酸組成，分子量為58kDa，在細(xì)胞質(zhì)中與病毒的基因組RNA結(jié)合并相互纏繞形成螺旋狀的核衣殼。高水平的抗N蛋白的抗體在早期感染PEDV的豬體內(nèi)就能產(chǎn)生，同時由于冠狀病毒的N蛋白保守性強［15］，所以N蛋白可以作為早期PEDV感染分子生物學(xué)診斷技術(shù)的目標(biāo)之一［16］。N蛋白的抗原表位能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，T細(xì)胞表位能誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫，從而誘發(fā)機體有效免疫應(yīng)答［17］。（5）科學(xué)家已對大部分冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白做了深入的研究，但對于該病毒屬的附屬蛋白了解甚少，且這些附屬蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)過程中病毒的復(fù)制是非必須的。復(fù)制酶多聚蛋白ORF1a（12354nt）和ORF1b（8037nt）是一個多功能的非結(jié)構(gòu)蛋白，位于5'UTR的下游，預(yù)測分子量為753kDa，與病毒基因子的復(fù)制相關(guān)［18］。ORF3蛋白是分子量為25.3kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的毒力密切相關(guān)［19］，通過比較致弱型和野生型毒株，發(fā)現(xiàn)致弱的毒株均有17個氨基酸的缺失，推測這些重要位點與病毒的病原性密切相關(guān)［20］。

2　診斷

（1）由于腹瀉類疾病引起癥狀具有相似性，所以PED不能靠臨床癥狀和組織病理學(xué)變化來診斷。目前用來診斷PEDV的技術(shù)包括免疫熒光、免疫組化、電鏡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗和RT-PCR等技術(shù)。（2）免疫電鏡法由于設(shè)備的限制，不適合用于大規(guī)模的臨床檢測?？捎靡阎母呙庋宕_定未知的病毒，也可用已知的PEDV診斷恢復(fù)期的豬血清。免疫熒光技術(shù)檢測病料中的PEDV是應(yīng)用較為廣泛的可靠的特異性診斷方法。取病豬小腸作冰凍切片或小腸粘膜抹片，丙酮固定后，加入熒光抗體染色，充分水洗后直接封蓋鏡檢，1～2h即可得出結(jié)果。（3）Ishikawa等在PEDV的S基因序列上設(shè)計了一對引物，成功地建立了診斷PEDV的糞便毒和細(xì)胞毒的RT-PCR法，用時8h，靈敏度達(dá)100 TCID50/ml［21］。韓國科學(xué)家建立的TGEV和PEDV的雙重RT-PCR檢測方法，靈敏度達(dá)10TCID50/ml。Kim等比較了原位雜交、免疫組化與RTPCR的3種實驗方法，結(jié)果顯示重復(fù)性最好的是RT-PCR法，但檢測福爾馬林固定的樣品時，原位雜交和免疫組化的效果會更好［22］。由于RT-PCR法需要特殊的儀器設(shè)備，盡管具有較好的特異性和敏感性，但目前仍只能用于實驗室檢測，而不能用于臨床診斷。（4）近期，以表達(dá)蛋白為基礎(chǔ)來檢測PEDV的ELISA法發(fā)明成功。在這項技術(shù)中，多克隆抗體是利用M基因進行原核表達(dá)從而用純化好的M蛋白免疫兔子獲得，然后利用間接免疫熒光技術(shù)通過PEDV-M的二抗檢測腸道病毒中感染PEDV的細(xì)胞的存在［23］。具有可從糞便中直接檢測PEDV抗原以及操作簡便的優(yōu)點。阻斷ELISA和間接免疫熒光技術(shù)可以分別檢測到感染7天或者10～13天PEDV的血清中抗體，且用于間接免疫熒光技術(shù)檢測的血清樣本要在出現(xiàn)腹瀉癥狀2～3周內(nèi)采集并檢測。

3　疫苗

（1）依據(jù)PEDV基因組序列、遞送方式和效力的差異，科學(xué)家們已經(jīng)研制出不同類別的PEDV疫苗。由于歐洲沒有因PEDV引起牲畜死亡而造成大規(guī)模的經(jīng)濟損失，所以研制疫苗的重心落在了亞洲地區(qū)。亞洲的許多國家因為PEDV的感染，新生仔豬死亡率逐年升高。CV777病毒株具有典型的PEDV基因組序列特征，我國科學(xué)家通過使PEDV CV777株適應(yīng)Vero傳代細(xì)胞，研制成功了PED細(xì)胞滅活苗，免疫7天后便開始產(chǎn)生抗體，到免疫15天時已可產(chǎn)生較高水平的抗體，該疫苗的實驗室保護率達(dá)90%以上，區(qū)域性以及較大規(guī)模的生產(chǎn)場試驗均能獲得95%以上的總體保護率，其安全性達(dá)100%［24］。日本科學(xué)家Kweon等將分離到的野毒株P(guān)-5V適應(yīng)于Vero細(xì)胞并連續(xù)傳代至93代，然后接種妊娠母豬，結(jié)果表明疫苗大幅度的提高了母豬免疫應(yīng)答水平，并且使新生仔豬能夠抵抗PEDV的感染。韓國科學(xué)家利用DR13株P(guān)EDV制備的弱毒疫苗是其用于預(yù)防PEDV感染的口服疫苗，從新生仔豬的小腸內(nèi)容物中分離得到的，在Vero細(xì)胞上進行連續(xù)傳代至100代。研究表明，細(xì)胞弱毒苗的免疫途徑口服免疫比注射免疫效果更好，可直接給仔豬口服疫苗進行主動免疫，從而達(dá)到有效預(yù)防PEDV感染的目的［25］。（2）近階段，轉(zhuǎn)基因植物疫苗和乳酸桿菌表達(dá)PEDV抗原研制的疫苗作為新興產(chǎn)物越來越多的被雜志報道。將PEDV S基因轉(zhuǎn)入到煙草中，然后提取轉(zhuǎn)基因煙草蛋白給小鼠注射，通過血清蝕斑減數(shù)和中和測定證明轉(zhuǎn)基因煙草蛋白具有免疫原性，小鼠直接服用這種轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生黏膜免疫和全身免疫。之后，人們還利用密碼子優(yōu)化技術(shù)和病毒表達(dá)系統(tǒng)將抗原基因轉(zhuǎn)入到胡蘿卜和萵苣中，飼喂小鼠轉(zhuǎn)基因胡蘿卜和轉(zhuǎn)基因萵苣，從而達(dá)到免疫保護的功效［26］。這些研究為開發(fā)PEDV口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了技術(shù)支持。轉(zhuǎn)基因植物疫苗具有植物細(xì)胞的全能性，口服后能有效的誘導(dǎo)機體的黏膜免疫，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。（3）乳酸桿菌是人體和動物體內(nèi)的益生菌，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生非特異性及特異性免疫應(yīng)答，被廣泛的應(yīng)用于食品工業(yè)、飼料加工業(yè)等行業(yè)。以乳酸桿菌為載體來構(gòu)建質(zhì)粒，能夠在機體黏膜中增殖，并可以持續(xù)不斷的表達(dá)病原微生物的保護性抗原基因，為多功能黏膜免疫的微生態(tài)制劑疫苗提供了廣闊的研究前景?？茖W(xué)家葛俊偉等利用PEDV的主要防治途徑是黏膜免疫這一特性，初次探究了PEDV 乳酸桿菌基因工程疫苗。他們將含有PEDV N基因和中和抗原位點的重組質(zhì)粒構(gòu)建到干酪乳桿菌中，使其有效的表達(dá)保護性抗原基因產(chǎn)生的外源蛋白，外源蛋白經(jīng)口服免疫，能夠刺激小鼠腸道產(chǎn)生局部的粘膜免疫應(yīng)答反應(yīng)，還可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示具有良好免疫原性的重組干酪乳桿菌為PEDV口服疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)［27，28］。

參考文獻(xiàn)

［1］ Pensaert M B，Debouck P.A new coronavirus-like particle associated with diarrhea in swine ［J］.Arch Virol，1978，58 （3） : 243-247.

［2］ M.B.Pensaert，P.Callebaut，P.de Bouck，Present knowledge.Int.Congr.Pig Vet，1982，Soc.52.

［3］ P.Callebaut，Int.Congr.Virol，1981，420.

［4］ DeBouck P，Pensaert M and Coussenment W.The pathogenesis of an enteric in pigs experimentally induced by coronavirus-like agent CV777［J］.Vet Microbiol，1981，6: 157-165.

［5］ Kocherhans R，Bridgen A，Ackermann M and Tobler K.Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus （PEDV） genome sequence［J］.Virus Genes ，2001，23（2）: 137-144.

［6］ Brian DA and Baric RS.Coronavirus genome structure and replication.Curr Top Microbiol Immunol，2005，287: 1-30.

［7］T.Sato，N.Takeyama，A.Kasumata，K.Tuchiya，T.Kodama，K.Kusanagi.Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus associated with growth adaptation in vitro and attenuation of viru-lence in vivo.Virus Genes，2011，43，72-78.

［8］ D.K.Lee，C.K.Park，S.H.Kim，C.Lee.Heterogeneity in spike protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea.Virus Res，2010，149，175-182.

［9］ W.spaan，D.Cavanagh，M.C.Horzinek，J.Coronaviruses: Structure and Genome Expression.Gen.Virol，1998，69 （Pt 12），2939-2952.

［10］ Utiger A，Tobler K and Bridgen A.Identification of Protein Specified by Porcine Epidemic Diarrhea Virus［J］.Adv Exp Med Biol，1995，380: 287-290.

［11］ Cornelis AM，Kuo L，Masters PS，Vennena H and Peter JM.Coronavirus particle assembly: primary structure requirements of the membrane protein［J］.J Virol，1998，72（8）: 6838-6850.

［12］ Fan J.H，Zuo YZ，Li JH and Pei LH.Heterogeneity in membrane protein genes of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in China［J］.Virus Genes，2010，45（1）: 113-117.

［13］ Narayanan K，Maeda A，Maeda J and Makino S.Characterization of the coronavirus M protein and nucleocapsid interaction in infected cells［J］.J Virol，2000，74（17）: 8127-8134.

［14］ Laude H，Gelfi J，Lavenant L and Charley B.Single amino acid changes in the viral glycoprotein M affect induction of alpha interferon by the coronavirus transmissible gastroenteritis virus［J］.J Virol ，1992，66（2）: 743-749.

［15］ 孫東波，馮力，時洪艷等.豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白抗原間接ELISA抗體檢測方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2006，28（5）: 572-580.

［16］ Hou XL，Yu LY and Liu J.Development and evaluation of enzymelinked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea（PEDV） antibodies［J］.Vet Microbiol，2007，123（1-3）: 86-92.

［17］ Line M，Tseng HK，Trejaut JA，Lee HL，Loo JH，Chu CC，Chen PJ，Su YW，Lim KH，Tsai ZU，Lin RY，Lin RS and Huang CH.Association of HLA class I with severe acute respiratory syndrome coronavirus infection［J］.BMC Med Genet，2003，4: 9.

［18］ Brian DA and Baric RS.Coronavirus genome structure and replication.Curr Top Microbiol Immunol，2005，287: 1-30.

［19］ Duarte M，Tobler K，Bridgen A，Rasschaert D，Ackermann M and Laude H.Sequence analysis of the porcine epidemic diarrhea virus genome between the nucleocapsid and spike protein genes reveals a polymorphic ORF［J］.Virology，1994，198（2）: 466-476.

［20］ Park SJ，Moon HJ，Yang JS，Lee CS，Song DS，Kang BK and Park BK.Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of porcine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］.Virus Genes，2007，35（2）: 321-332.

［21］ Ishikawa K，Sekiguchi H，Ogino T and Suzuki S.Direct and rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus by RT-PCR［J］.J Virol Methods，1997，69（1-2）: 191-195.

［22］ Kim O and Chae C.Comparison of reverse transcription polymerase chain reaction，immunohistochemistry，and in situ hybridization for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in pigs［J］.Can J Vet Res，2002，66（2）: 112-116.

［23］ X.Ren，S.Suo，Y.S.Jang.Development of a porcine epidemic diarrhea virus M protein-based ELISA for virus detection.Biotechnol.Lett.，2011，33，215-220.

［24］ 錢永清，聞人楚，唐永蘭.豬流行性腹瀉的免疫研究［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，1999，3: 4-6.

［25］ Song DS，Oh JS，Kang BK，Yang JS，Moon HJ，Yoo HS，Jang YS and Park BK.Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain［J］.Res Vet Sci，2007，82（1）: 134-140.

［26］ Bae JL，Lee JG，Kang TJ，Jang HS，Jang YS and Yang MS.Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen［J］.Vaccine，2003，21（25-26）: 4052-4058.

［27］ 葛俊偉，姜艷平，汪淼等.表面表達(dá)豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答［J］.生物工程學(xué)報，2009，25（6）: 813-818.

［28］ 姜艷平，葛俊偉，汪淼等.表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40: 708-712.

中圖分類號：S858.28

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-1733（2015）01-0077-03

收稿日期：（2014-12-02）

*通訊作者