泡菜中亞硝酸鹽消長(zhǎng)規(guī)律及調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展

葛　焱，郭雙霜，陳安均（.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，江蘇南京0095；.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安6504）

泡菜中亞硝酸鹽消長(zhǎng)規(guī)律及調(diào)控技術(shù)研究進(jìn)展

葛焱1，郭雙霜2，陳安均2
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，江蘇南京210095；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川省農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川雅安625014）

泡菜是經(jīng)鹽水泡制新鮮蔬菜厭氧發(fā)酵而成，因其乳酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵形成的風(fēng)味物質(zhì)，賦予了泡菜獨(dú)特的風(fēng)味，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但是泡菜在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生亞硝酸鹽，亞硝酸鹽積累會(huì)對(duì)消費(fèi)者健康不利。本文綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究文獻(xiàn)，概述了泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽形成與降解機(jī)理及變化規(guī)律研究進(jìn)展，并對(duì)降低泡菜中亞硝酸鹽含量的研究與應(yīng)用進(jìn)行綜述。

泡菜，亞硝酸鹽，降解，調(diào)控

蔬菜除鮮食外，泡菜、酸菜等發(fā)酵制品深受廣大消費(fèi)者的歡迎。西南、中南各地為我國(guó)泡菜主產(chǎn)區(qū)，其中以四川泡菜最為盛名，產(chǎn)量、銷量均居全國(guó)第一?，F(xiàn)代研究表明，泡菜含有豐富的活性乳酸菌，可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收、增進(jìn)食欲，改善腸道功能[1-3]，降低血清膽固醇水平和血脂濃度[4]、抗突變性、抗癌、延緩衰老等功效[5-9]。乳酸發(fā)酵食品更加受到人們的親睞[10-11]。

我國(guó)是世界上最大的蔬菜生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。蔬菜易富集硝酸鹽，當(dāng)過(guò)量施用氮肥后，不能被蔬菜全部吸收利用，多余的部分就以硝酸鹽的形式儲(chǔ)存在蔬菜中，導(dǎo)致蔬菜富集硝酸鹽。泡菜發(fā)酵過(guò)程中能有效降低新鮮蔬菜中硝酸鹽的含量，但亞硝酸鹽含量卻相對(duì)升高[12]。過(guò)量亞硝酸鹽會(huì)使血液中的Fe2+氧化為Fe3+，血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥[13]。亞硝酸鹽與體內(nèi)的仲胺生成致癌性極強(qiáng)的亞硝基化合物，有致癌風(fēng)險(xiǎn)[14]。

關(guān)于泡菜中亞硝酸鹽的形成機(jī)理已基本明確，目前研究大多集中在泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的變化規(guī)律、亞硝酸鹽降解措施等方面，如降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選、發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化等。文章概述了泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽形成與降解機(jī)理及調(diào)控措施的研究進(jìn)展，為工業(yè)化生產(chǎn)安全和營(yíng)養(yǎng)的泡菜奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1　泡菜中亞硝酸鹽的消長(zhǎng)規(guī)律及其機(jī)理研究

1.1泡菜中亞硝酸鹽的形成機(jī)理

1.1.1亞硝酸鹽的形成與微生物中硝酸還原酶的關(guān)系在發(fā)酵初期，乳酸發(fā)酵緩慢，溶液pH較高，一些雜菌會(huì)迅速繁殖，大腸桿菌、黃桿菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌等都可以促進(jìn)硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。泡菜發(fā)酵初期，硝酸還原酶活力幾乎檢測(cè)不到，隨著發(fā)酵進(jìn)行，表面微生物硝酸還原酶活力先升高后降低；發(fā)酵后期，已檢測(cè)不到酶活。這一變化趨勢(shì)與亞硝酸鹽變化趨勢(shì)一致，而泡菜組織中硝酸還原酶在亞硝峰時(shí)幾乎檢測(cè)不到活力，結(jié)果表明，發(fā)酵前期細(xì)菌中的硝酸還原酶將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[15]。

1.1.2亞硝酸鹽的形成與蔬菜中硝酸還原酶的關(guān)系

硝酸還原酶活性水平與植物體內(nèi)多種代謝過(guò)程和生理指標(biāo)有關(guān)，是一種誘導(dǎo)酶[16]。何玲等[17]發(fā)現(xiàn)漿水芹菜發(fā)酵過(guò)程中，亞硝峰出現(xiàn)的時(shí)間與硝酸還原酶活性最大時(shí)一致，且硝酸還原酶活性與芹菜熱燙時(shí)間有關(guān)，熱燙時(shí)間越長(zhǎng)，硝酸還原酶活性越低，甚至失活。何淑玲等[18]研究表明泡菜亞硝峰出現(xiàn)的時(shí)間與蔬菜組織和發(fā)酵液細(xì)菌中硝酸還原酶活性最大時(shí)吻合。

但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)只在發(fā)酵初期能檢測(cè)到蔬菜中硝酸還原酶活性，隨后一直下降[19]。紀(jì)淑娟[20]發(fā)現(xiàn)大白菜發(fā)酵初始階段能檢測(cè)到硝酸還原酶活力，隨后酶活急劇下降，到第2d已檢測(cè)不到酶活，而此時(shí)亞硝酸鹽含量卻呈上升趨勢(shì)，由此認(rèn)為大白菜中硝酸還原酶與亞硝酸鹽的形成沒(méi)有直接關(guān)系。

綜上所述，泡菜發(fā)酵液中雜菌所含的硝酸還原酶活性與亞硝酸鹽含量呈正相關(guān)，微生物中硝酸還原酶是亞硝酸鹽大量積累的主要原因，但蔬菜組織中硝酸還原酶活力與亞硝酸鹽形成是否有關(guān)還無(wú)定論。2種不同來(lái)源的硝酸還原酶活性變化存在差異的原因未深入探討，因此還有待進(jìn)一步研究。

1.2泡菜中亞硝酸鹽的降解機(jī)理

隨著發(fā)酵的進(jìn)行，泡菜中乳酸菌等有益菌群逐漸占據(jù)生存優(yōu)勢(shì)，乳酸菌代謝產(chǎn)酸，pH迅速降低，酸性環(huán)境下硝酸還原菌等有害菌生長(zhǎng)受到抑制，pH＜4.5時(shí)，腸桿菌科、酵母菌等雜菌生長(zhǎng)均被抑制[21]。研究證明pH5是硝酸還原酶酶活的啟動(dòng)點(diǎn)，能夠促使硝酸還原酶還原最多的硝酸鹽產(chǎn)生亞硝酸鹽，此時(shí)亞硝酸鹽含量最高。當(dāng)pH降低為4.5時(shí)，硝酸還原酶活性急劇減小，硝酸還原作用受到抑制，亞硝酸鹽含量減少。

另外，泡菜在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)大量產(chǎn)酸，如酒石酸、乳酸、草酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和丙酸等，其中酒石酸、乳酸含量最高，可能是影響泡菜中亞硝酸鹽含量變化的主要有機(jī)酸[22]。亞硝酸鹽除了與酸反應(yīng)被分解外，乳酸菌分泌的亞硝酸鹽還原酶也是亞硝酸鹽減少的原因[23-24]，研究發(fā)現(xiàn)從特定食品中分離的乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽具有降解作用[25-28]，目前有關(guān)乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑及亞硝酸鹽還原酶的定位報(bào)道較少，亞硝酸鹽降解途徑為經(jīng)反硝化作用轉(zhuǎn)化為N2，該途徑亞硝酸鹽還原酶為cytochrome cd1或copper-containing Nir[29]，或經(jīng)過(guò)銨化作用轉(zhuǎn)化為NH4+，亞硝酸鹽還原酶為cytochrome c NrfA[30]。張馨月[31]利用電子捕獲-氣相色譜法和靛酚藍(lán)染色法確定亞硝酸鹽的降解途徑，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，NaNO2降解量逐漸增大，N2O的產(chǎn)量先增大后降低，可能是N2O轉(zhuǎn)化為N2所致，反應(yīng)體系中無(wú)NH4+，因此，亞硝酸鹽的降解途徑為反硝化途徑。采用細(xì)胞組分法確定酶的定位，細(xì)胞周質(zhì)間隙中亞硝酸鹽還原酶活力是細(xì)胞質(zhì)的2.5倍，結(jié)果表明對(duì)亞硝酸鹽起降解作用的亞硝酸鹽還原酶是胞內(nèi)酶，但對(duì)酶的精準(zhǔn)定位還需進(jìn)一步研究。

2　影響泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量變化的因素

泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的含量受多種因素的影響，如發(fā)酵溫度、pH、食鹽濃度、含糖量、泡菜原料等。

2.1發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

發(fā)酵溫度對(duì)亞硝酸鹽的生成量及生成期有明顯的影響。泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量隨時(shí)間的變化關(guān)系：溫度高，乳酸發(fā)酵快，亞硝酸鹽生成早、含量低；溫度低，乳酸發(fā)酵慢，亞硝酸鹽含量高[32-33]。但溫度過(guò)高影響泡菜品質(zhì)，使泡菜的脆度、香味下降，因此，發(fā)酵溫度為28℃較適宜[34]。

2.2酸度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

加酸發(fā)酵和不加酸發(fā)酵對(duì)亞硝峰的形成有極顯著的差異。加酸發(fā)酵的大白菜，無(wú)亞硝峰出現(xiàn)。鄭琳[35]研究表明，在甘藍(lán)發(fā)酵過(guò)程中，酸度越高，亞硝酸鹽含量越低。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH3.76～4.45時(shí)，酸對(duì)亞硝酸鹽降解較快，pH3時(shí)亞硝酸鹽降解率為98.6%[10]，pH5.0～8.0時(shí)，酸對(duì)亞硝酸鹽降解率保持在52.9%。

2.3食鹽濃度對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

亞硝酸鹽的含量高低及亞硝峰的出現(xiàn)時(shí)間與食鹽濃度相關(guān)。陳義倫等[36]研究發(fā)現(xiàn)與4%食鹽濃度相比，6%食鹽濃度可明顯降低泡菜保藏過(guò)程中亞硝酸鹽含量。羅璇[37]分析了5%、10%、15%鹽濃度腌制時(shí)亞硝酸鹽含量的變化，鹽濃度越低，亞硝峰出現(xiàn)時(shí)間早，且峰值高。雖然高濃度食鹽能夠不同程度地抑制硝酸還原菌的繁殖，降低亞硝酸鹽的含量，但違背了低鹽泡菜標(biāo)準(zhǔn)。將原料經(jīng)高濃度食鹽預(yù)處理，再在低鹽濃度條件下泡制，能保持泡菜的脆度，對(duì)開發(fā)接種乳酸菌低鹽泡菜有一定指導(dǎo)意義。

2.4含糖量亞硝酸鹽含量的影響

蔬菜中含糖量的高低對(duì)發(fā)酵作用和酸的生成有影響，腌制雪里蕻中分別添加0%、1%、2%葡萄糖，在2%葡萄糖添加量時(shí)亞硝峰出現(xiàn)時(shí)間最早，含量最低[38]，可能由于蔬菜的發(fā)酵作用與含糖量成正比，含糖量高，發(fā)酵產(chǎn)酸較多，發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量低。周旭峰等[39]研究表明發(fā)酵碳源葡萄糖粉添加量為2%時(shí)，發(fā)酵菜酸甜適中，口感較好。Miyao等[40]證明糖類物質(zhì)對(duì)微生物分泌的硝酸還原酶有激活作用，但究竟是糖類促進(jìn)蔬菜發(fā)酵作用，發(fā)酵產(chǎn)酸對(duì)硝酸還原菌有抑制作用，還是存在糖類對(duì)硝酸還原酶的促進(jìn)，還需進(jìn)一步研究。

2.5泡菜原料對(duì)亞硝酸鹽含量的影響

用不同種類的蔬菜制作的泡菜，亞硝酸鹽的含量變化情況不同。楊波[41]以蘿卜、白菜及其混合原料制作泡菜，發(fā)酵過(guò)程中白菜泡菜的亞硝酸鹽含量比蘿卜泡菜的亞硝酸鹽高30%～40%，且亞硝峰出現(xiàn)時(shí)間比蘿卜泡菜早。張雁[42]對(duì)4種品種芥菜發(fā)酵時(shí)亞硝酸鹽的變化作了研究，發(fā)酵過(guò)程中各品種間亞硝酸鹽的變化趨勢(shì)一致，但亞硝酸鹽含量存在差異。且亞硝酸鹽峰值與鹵水中硝酸還原酶活性呈正相關(guān)。

3　泡菜中亞硝酸鹽的調(diào)控措施

3.1添加亞硝酸鹽清除劑的研究

3.1.1發(fā)酵輔料對(duì)亞硝酸鹽的清除作用在泡菜制作過(guò)程中添加花椒[43]、蒜汁[35，44]、姜汁[35]等輔料共同發(fā)酵，不僅可以增加泡菜的風(fēng)味，而且添加之后能有效抑制亞硝峰的出現(xiàn)，孫慶芳等[45]認(rèn)為，大白菜發(fā)酵過(guò)程中，鹵汁中蒜汁濃度為2%時(shí)，亞硝酸鹽殘留量最少。這是由于大蒜本身所含的巰基化合物可與亞硝酸鹽結(jié)合生成硫代亞硝酸鹽酯類化合物，從而減少了亞硝酸鹽的含量。

馮麗丹[46]對(duì)6種水果、9種蔬菜清除亞硝酸鹽能力進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)均對(duì)亞硝酸鹽有清除作用。蘆薈凝膠[47]、花茶浸泡液[48]、石榴皮多酚提取液[49]對(duì)亞硝酸鹽都有較強(qiáng)的清除作用。因此，果蔬及果蔬浸提液可用于泡菜的生產(chǎn)加工中，不僅能提高泡菜的風(fēng)味，開發(fā)出更多的風(fēng)味泡菜，還可以減少亞硝酸鹽的危害性，提高泡菜的食用安全。

3.1.2抗氧化劑對(duì)亞硝酸鹽的清除作用添加抗壞血酸[50]、抗壞血酸鈉和異抗壞血酸鈉[51]可降低亞硝酸鹽水平。張志國(guó)等[52]研究了異抗壞血酸鈉對(duì)泡菜中亞硝酸鹽含量變化的影響，結(jié)果表明，添加0.5%異抗壞血酸鈉，亞硝峰出峰時(shí)間提前1～2d，白菜泡菜中亞硝酸鹽含量由17.561mg/kg降低至0.30mg/kg，甘藍(lán)泡菜由13.91mg/kg降低至0.33mg/kg，蘿卜泡菜由12.03mg/kg降低至0.35mg/kg。

3.2發(fā)酵條件對(duì)亞硝酸鹽的清除作用

硝酸還原菌是需氧菌，而乳酸菌是厭氧菌，保持發(fā)酵過(guò)程中厭氧環(huán)境可以抑制硝酸還原菌的生長(zhǎng)，因此可以采用將蔬菜排緊壓實(shí)，發(fā)酵液淹沒(méi)蔬菜，發(fā)酵壇口水封等方式保持厭氧環(huán)境。

另外，將發(fā)酵溫度、食鹽濃度、pH、蔬菜原料等工藝參數(shù)調(diào)節(jié)到適宜條件，可以降低亞硝酸鹽含量。在發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)添加一定量的有機(jī)酸和糖可降低發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽的含量，同時(shí)還可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高產(chǎn)品的品質(zhì)。McDonald等[53]在鹽水中添加乙酸或乙酸鈣進(jìn)行酸化處理，發(fā)現(xiàn)醋酸能抑制腸道菌生長(zhǎng)，乳酸菌正常生長(zhǎng)。

3.3貯藏條件對(duì)亞硝酸鹽的影響

泡菜保存在室溫條件下，微生物活動(dòng)活躍，亞硝酸鹽含量上升，低溫和真空包裝貯藏能抑制有害菌的活動(dòng)和硝酸還原酶活性，降低亞硝酸鹽含量。研究表明黃瓜、甘藍(lán)、白菜泡菜在4℃真空包裝冷藏時(shí)其亞硝酸鹽含量比27℃真空包裝保藏時(shí)低[36]。

3.4降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選和應(yīng)用

國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽做了較多研究，篩選合適菌種接種發(fā)酵蔬菜也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，如發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）[54]、腸膜明串珠菌[55]、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus casei subsp. casei）[56]等都可以抑制泡菜中亞硝酸鹽的含量，保證泡菜的安全性。益生菌Lactobacillus delbrueckii subsp lactis 133能有效抑制大腸桿菌中的硝酸鹽還原酶活性。

發(fā)酵菌種對(duì)亞硝酸鹽清除能力與菌種產(chǎn)酸特性和產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶性質(zhì)相關(guān)。劉冬梅[57]研究表明LCR179在泡菜發(fā)酵過(guò)程中快速產(chǎn)生L-乳酸，從而抑制亞硝酸鹽的產(chǎn)生。龔鋼明[58]從克隆和表達(dá)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶結(jié)構(gòu)基因的角度進(jìn)行探索，從篩選出的具有亞硝酸鹽還原能力的植物乳桿菌基因組中克隆出假定的亞硝酸鹽還原酶基因，并在大腸桿菌蛋白載體中，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物顯示有明顯的亞硝酸鹽還原酶活性，進(jìn)而表明該乳酸菌基因組中包含有亞硝酸鹽還原酶基因，該研究為深入探討乳酸菌亞硝酸鹽還原酶奠定了重要的基礎(chǔ)。

3.5亞硝酸鹽還原酶酶法處理

亞硝酸鹽還原酶是植物硝態(tài)氮同化過(guò)程中十分重要的酶，閆金星[54]通過(guò)對(duì)降解亞硝酸鹽乳酸菌紫外照射20s，使亞硝酸鹽降解率提高到88%，得到亞硝酸鹽還原酶酶活為56.84U/mL的酶液，酶活比誘變前提高了5.33倍。這與張瑩[59]研究的亞硝酸鹽還原酶酶活結(jié)果基本一致。現(xiàn)代研究在酶活穩(wěn)定性、酶載體及安全性方面仍較少，進(jìn)一步將微生物或亞硝酸鹽還原酶固化提純應(yīng)用到食品中還需后續(xù)的研究。

3.6發(fā)酵方式的優(yōu)化

與自然發(fā)酵相比，人工接種乳酸菌發(fā)酵和陳鹵發(fā)酵可降低亞硝酸鹽含量。劉廣福等[60]在研究蔬菜接種乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽變化規(guī)律時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種乳酸菌純菌種腌漬蔬菜可使發(fā)酵過(guò)程中亞硝峰的出現(xiàn)時(shí)間提前，并可明顯降低亞硝酸鹽的含量。接種植物乳桿菌發(fā)酵蘿卜，比自然發(fā)酵時(shí)間短，亞硝酸鹽含量低，無(wú)亞硝峰出現(xiàn)[61]。另外，調(diào)酸發(fā)酵和低溫發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽含量一直處于很低的水平[62]。

4　結(jié)語(yǔ)

目前，國(guó)內(nèi)醬腌菜發(fā)酵制品多采用自然發(fā)酵，優(yōu)良菌種和人工接種發(fā)酵技術(shù)的研究還比較落后，優(yōu)良菌種的選育和直投式發(fā)酵劑制備仍是降解亞硝酸鹽研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，亞硝酸鹽還原酶基因的克隆和表達(dá)研究較少。加強(qiáng)菌種的篩選、配比、發(fā)酵條件、保藏條件等多個(gè)環(huán)節(jié)的研究，采用固定化酶和固定化微生物技術(shù)，對(duì)降低產(chǎn)品亞硝酸鹽含量，提升工業(yè)化泡菜的品質(zhì)具有重要意義。

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Research progress of dynamic change and control technology of nitrite in pickle

GE Yan1，GUO Shuang-shuang2，CHEN An-jun2
（1.Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Sichuan Agricultural Product Processing and Storage Engineering Key Laboratory，College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China）

Pickles are made from fresh vegetables through anaerobic fermentation，which are very popular and enjoyed by most consumens due to their strong characteristic flavors in the lactic acid fermentation，alcoholic fermentation and acetic fermentation.But nitrite was commonly present in pickles，nitrite had been proven to have effects on health.Therefore，in this essay，the mechanisms for production and variation trends of nitrite during pickles fermentation have been summarized and concluded，moreover，the effecting factors and technology of reducing nitrite in pickles was also expounded.

pickle；nitrite；degradation；regulation

TS255.5

A

1002-0306（2015）04-0382-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.074

2014－05－08

葛焱（1987-），男，碩士研究生，研究方向：高等教育管理及農(nóng)產(chǎn)品綜合利用。