血液miRNA檢測(cè)在結(jié)直腸癌診斷、預(yù)后及化療療效評(píng)估中的應(yīng)用進(jìn)展

馮君蘭，汪昱

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233)

結(jié)直腸癌(CRC)是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率居于惡性腫瘤的第2位，在我國(guó)其發(fā)病率和病死率均呈逐年上升的趨勢(shì)［1］。提高CRC的生存率，其根本和關(guān)鍵在于早期診斷、預(yù)后判斷及治療監(jiān)測(cè)［2］。目前，CRC的檢測(cè)方法主要依靠?jī)?nèi)鏡活檢形態(tài)學(xué)病理檢查和胃腸造影的影像學(xué)檢查;而腫瘤患者出現(xiàn)影像學(xué)改變時(shí)大多已處于中晚期，且影像學(xué)對(duì)腫瘤病灶檢出率較低;病理學(xué)檢查為創(chuàng)傷性檢查，必需經(jīng)腔內(nèi)取材后才能獲得，而且臨床常見(jiàn)有癥狀才來(lái)就診。生化檢查只需取患者少量體液或標(biāo)本，且具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便及經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，患者依從性好，易于實(shí)施，是大規(guī)模人群篩查的理想手段，但目前尚無(wú)理想的指標(biāo)可供參考。微小RNA(miRNA)是繼基因計(jì)劃后近幾年形成的生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，其不僅僅存在于腫瘤組織中，還穩(wěn)定存在于血液中，通過(guò)參與多種信號(hào)通路調(diào)控CRC的發(fā)生、發(fā)展［3］。現(xiàn)將血液中miRNA檢測(cè)在CRC早期診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)、化療療效評(píng)估中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 miRNA的生物合成及作用機(jī)制

miRNA常簇生于蛋白編碼基因的內(nèi)含子中，其在體內(nèi)的形成源于RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1 000 bp左右的初級(jí)產(chǎn)物(pri-miRNA)，后者進(jìn)一步在細(xì)胞核內(nèi)被RNaseⅢ內(nèi)切酶家族的Drosha酶剪切成70 bp左右的發(fā)夾式前體pre-miRNA，在Ran-GTP依賴的Exportin-5蛋白的作用下從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨|(zhì)中，后在Dicer酶的作用下，miRNA前體被剪切成21～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈miRNA，并結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RISC)中，形成非對(duì)稱RISC復(fù)合物，與靶mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)完全或不完全匹配結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA降解或阻遏其翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)細(xì)胞代謝、分化、增殖與凋亡等進(jìn)行調(diào)控［4］。因此，成熟miRNA的最終效應(yīng)是通過(guò)阻止靶點(diǎn)蛋白的生成而下調(diào)其靶基因表達(dá)，一旦miRNA的表達(dá)水平失調(diào)，可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生［5，6］。

2 血液miRNA檢測(cè)在CRC早期診斷中的應(yīng)用

最近研究顯示，miRNA受內(nèi)源性核糖核酸酶的保護(hù)，可以非常穩(wěn)定地存在于人類血液中，尤其是惡性腫瘤患者的血清中，其表達(dá)水平足以供臨床檢測(cè)應(yīng)用，從而為miRNA在腫瘤患者早期診斷中的應(yīng)用提供了可行性［7］。Toiyama 等［8］發(fā)現(xiàn)，血清 miR-21表達(dá)水平可明確鑒別腺瘤及CRC，其AUC曲線下面積分別為 0.813(95%CI=0.691 ～0.910)和 0.919(95%CI=0.867 ～0.958);并且血清中 miR-21 的高表達(dá)與腫瘤體積、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且患者的預(yù)后較差。Huang等［9］對(duì)120例CRC、37例晚期腺瘤患者及57例健康志愿者血清中12個(gè)miRNA(miR-134、miR-146a、miR-17-3p、miR-181d、miR-191、miR-221、miR-222、miR-223、miR-25、miR-29a、miR-320a、miR-92a)表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示血清miR-29a、miR-92a可作為血清生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于CRC患者的早期診斷。并且Wang等［10］也發(fā)現(xiàn)，血清miR-29a表達(dá)升高與較晚的腫瘤分期相關(guān)，鑒別轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移CRC患者的敏感度和特異度均達(dá)到75%，較血清癌胚抗原更為敏感(敏感度和特異度分別為60%、34%)。此外，Ng等［11］利用 CRC 患者和健康對(duì)照組篩選發(fā)現(xiàn)了5個(gè)差異表達(dá)的miRNA(miR-135b、miR-95、miR-17-3p、miR-92、miR-222)在血清和組織中均出現(xiàn)高表達(dá)，進(jìn)一步在25例CRC患者和20例健康對(duì)照者血清驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRC患者中miR-17-3p和miR-92表達(dá)顯著增加，而在10例CRC術(shù)后患者血清中的表達(dá)顯著降低;同時(shí)，miR-92的不同表達(dá)水平可用于鑒別CRC患者與胃癌患者、炎癥性腸病患者和正常受試者，miR-92的AUC曲線下面積為88.5%，在臨界值為240時(shí)，miR-92用于區(qū)分CRC和對(duì)照組的敏感性、特異性分別為89%、70%。目前，更多的血清miRNA相關(guān)的篩選研究已在CRC血清中鑒定出超過(guò)100種miRNA分子，其可作為CRC早期診斷的候選生物標(biāo)志物。這些研究表明，血液中異常表達(dá)的miRNA有望在今后的臨床檢測(cè)中作為一種非侵入性的生物標(biāo)志物應(yīng)用于CRC的早期篩查和早期診斷。然而，腫瘤特異性miRNA的重疊性和差異性表達(dá)表明單個(gè)miRNA診斷CRC的敏感性和特異性較低，若能針對(duì)年齡相匹配的正常人、有早期病變的患者及不同階段CRC患者建立一組外周循環(huán)血中miRNA的差異表達(dá)譜，即有望實(shí)現(xiàn)對(duì)早期病變和不同階段CRC患者的早期診斷與精確評(píng)估。

3 血液miRNA檢測(cè)在CRC預(yù)后判斷中的應(yīng)用

目前，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)了臨床上檢測(cè)CRC患者血液中miRNA表達(dá)譜的變化可用于對(duì)CRC患者的預(yù)后監(jiān)測(cè)。血清miR-21目前被認(rèn)為是適用于不同種族、不同地域CRC患者強(qiáng)有力的預(yù)后生物標(biāo)志物［12～14］;研究［15］表明，血清高表達(dá)的 miR-21 可應(yīng)用于Ⅱ期CRC患者的預(yù)后評(píng)估，即可在CRC早期階段識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)患者的疾病進(jìn)展。Toiyama等［16］首先利用12例CRC患者血清樣本分析4個(gè)miR-200家族的 miRNA(miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429)，發(fā)現(xiàn)miR-200c與CRC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān);后利用182例CRC患者及24例健康正常對(duì)照的血清進(jìn)行驗(yàn)證分析 miR-200c表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-200c在Ⅳ期CRC患者中的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅲ期CRC患者，并且高表達(dá)的miR-200c與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)(P均＜0.05);更為重要的是，血清miR-200c可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)應(yīng)用于CRC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=4.81;95%CI=1.98 ～ 11.7，P=0.0005)、腫瘤復(fù)發(fā)(HR=4.51;95%CI=1.56 ～13.01，P=0.005)及 CRC 患者預(yù)后(HR=2.67;95%CI=1.28 ～5.67，P=0.01)的監(jiān)測(cè)。Cheng等［17］利用102例CRC患者的血漿標(biāo)本檢測(cè)miR-141的表達(dá)水平，結(jié)合CRC患者的臨床病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-141的表達(dá)水平與CRC的TNM分期密切相關(guān)，可作為轉(zhuǎn)移性CRC的生物標(biāo)志物;若聯(lián)合臨床常用的腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原，可提高對(duì)Ⅳ期CRC患者預(yù)后判斷的敏感性和特異性;為了進(jìn)一步提高證實(shí)此研究結(jié)果，再次利用156例CRC患者的血漿樣本檢測(cè)miR-141的表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)2個(gè)隊(duì)列的分析，證實(shí)了miR-141可作為晚期CRC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。Pu等［18］發(fā)現(xiàn)，CRC患者血清miR-221的高表達(dá)預(yù)示著CRC患者的生存期較短，預(yù)后較差;并且血清miR-221水平與p53基因的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，Kaplan-Meier曲線分析證實(shí)了miR-221可作為CRC患者獨(dú)立預(yù)后因素應(yīng)用于臨床檢測(cè)。目前這些研究均表明，CRC患者血清中特征性miRNA的差異表達(dá)可作為CRC患者預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床。

4 血液miRNA檢測(cè)在CRC化療療效評(píng)估中的應(yīng)用

對(duì)于CRC患者來(lái)說(shuō)，只進(jìn)行手術(shù)切除是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，為了有效地治療和控制疾病，應(yīng)接受相應(yīng)輔助化療，以達(dá)到治療效果。因此，化療是治療CRC的主要方法之一，近年來(lái)有關(guān)miRNA與CRC化療關(guān)系的研究已逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，更多的研究集中在從CRC組織中研究差異miRNA在化療耐藥中的關(guān)鍵分子機(jī)制，較少的研究關(guān)注血清中miRNA是否應(yīng)用于判斷CRC患者的化療敏感性。Zhang等［19］利用 miRNA表達(dá)譜芯片篩選 253例CRC血清樣本與正常對(duì)照中的差異表達(dá)miRNA，并通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了5個(gè)特征性的血清 miRNA(miR-20a、miR-130、miR-145、miR-216、miR-372)可聯(lián)合應(yīng)用于預(yù)測(cè)CRC患者對(duì)化療的敏感性，在兩組CRC臨床血清樣本中ROC曲線下面積分別為 0.841、0.918。另外，Chen 等［20］首先利用表達(dá)譜芯片篩選出了5個(gè)CRC血清中差異表達(dá)的 miRNA(miR-221、miR-222、miR-122、miR-19a、miR-144)，進(jìn)一步在72例臨床CRC患者血清樣本中驗(yàn)證分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清miR-19a的表達(dá)水平可以鑒別對(duì)化療耐藥的CRC患者，其敏感性及特異性分別為66.7%、63.9%，AUC曲線下面積為0.679。從目前上述兩個(gè)CRC患者血清miRNA判斷化療敏感性研究得出，CRC患者血清中特征性miRNA可作為潛在的生物標(biāo)志物應(yīng)用于臨床CRC化療療效的判斷，尤其是化療敏感性的監(jiān)測(cè)，但進(jìn)一步的大規(guī)模臨床研究還有待于在以后的研究中開(kāi)展。

目前，關(guān)于miRNA作為CRC生物標(biāo)志物的相關(guān)研究已成為了研究的焦點(diǎn)，也取得了一定的研究成果，CRC患者血液中特征性miRNA有可能作為CRC篩查、早期診斷、預(yù)測(cè)監(jiān)測(cè)及化療療效判斷的生物標(biāo)志物。然而，由于目前大多數(shù)研究仍屬于臨床樣本量較小的回顧性研究。因此，今后仍需要開(kāi)展大規(guī)模、多中心的前瞻性臨床研究進(jìn)一步證實(shí)血清特征性miRNA能夠作為CRC患者早期診斷、預(yù)后判斷及化療療效監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物，從而為CRC患者的臨床診治提供新的策略和思路。

［1］Kamangar F，Dores GM，Anderson WF.Patterns of cancer incidence，mortality，and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world ［J］.J Clin Oncol，2006，24(14):2137-2150.

［2］陳瓊，劉志才，程蘭平，等.2003-2007年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21(3):179-182.

［3］Schetter AJ，Okayama H，Harris CC.The role of microRNAs in colorectal cancer［J］.Cancer J，2012，18(3):244-252.

［4］Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116(2):281-297.

［5］Lai EC.Micro RNAs are complementary to 3'UTR sequence motifs that mediate negative posttranscriptional regulation［J］.Nat Genet，2002，30(4):363-364.

［6］Zhang B，Pan X，Cobb GP，et al.microRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol，2007，302(1):1-12.

［7］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Circulating microRNAs as stable bloodbased markers for cancer detection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(30):10513-10518.

［8］Toiyama Y，Hur K，Tanaka K，et al.Serum miR-200c is a novel prognostic and metastasis-predictive biomarker in patients with colorectal cancer［J］.Ann Surg，2014，259(4):735-743.

［9］Huang Z，Huang D，Ni S，et al.Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer［J］.Int J Cancer，2010，127(1):118-126.

［10］Wang LG，Gu J.Serum microRNA-29a is a promising novel marker for early detection of colorectal liver metastasis［J］.Cancer Epidemiol，2012，36(1):61-67.

［11］Ng EK，Chong WW，Jin H，et al.Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer:a potential marker for colorectal cancer screening［J］.Gut，2009，58(10):1375-1381.

［12］Basati G，Emami Razavi A，Abdi S，et al.Elevated level of microRNA-21 in the serum of patients with colorectal cancer［J］.Med Oncol，2014，31(10):205.

［13］Ye TT，Yang YL，Liu XY，et al.Prognostic value of circulating microRNA-21 in digestive system cancers:a meta-analysis［J］.Int J Clin Exp Med，2014，7(4):873-878.

［14］Xiong Y，Zhang YY，Wu YY，et al.Correlation of over-expressions of miR-21 and Notch-1 in human colorectal cancer with clinical stages［J］.Life Sci，2014，106(1-2):19-24.

［15］Nielsen BS，J?rgensen S，F(xiàn)og JU，et al.High levels of microRNA-21 in the stroma of colorectal cancers predict short disease-free survival in stage II colon cancer patients［J］.Clin Exp Metastasis，2011，28(1):27-38.

［16］Toiyama Y，Takahashi M，Hur K，et al.Serum miR-21 as a diagnostic and prognostic biomarker in colorectal cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2013，105(12):849-859.

［17］Cheng H，Zhang L，Cogdell DE，et al.Circulating plasma MiR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis［J］.PLoS One，2011，6(3):17745.

［18］Pu XX，Huang GL，Guo HQ，et al.Circulating miR-221 directly amplified from plasma is a potential diagnostic and prognostic marker of colorectal cancer and is correlated with p53 expression［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(10):1674-1680.

［19］Zhang J，Zhang K，Bi M，et al.Circulating microRNA expressions in colorectal cancer as predictors of response to chemotherapy［J］.Anticancer Drugs，2014，25(3):346-352.

［20］Chen Q，Xia HW，Ge XJ，et al.Serum miR-19a predicts resistance to FOLFOX chemotherapy in advanced colorectal cancer cases［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2013，14(12):7421-7426.