明礬對HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討

郝劍，吳雄志

(1天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院，天津300060;2國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心;3天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

研究［1～3］發(fā)現(xiàn)，TGF-β1信號通路可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。在肝癌細(xì)胞中，TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。如果腫瘤細(xì)胞內(nèi) TGF-β1信號通路發(fā)生突變，其抑制作用將受到限制。因此，重新修復(fù)激活TGF-β1信號通路的抑制作用，成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。明礬主含含水硫酸鋁鉀，具有收濕斂瘡、止血化腐作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，明礬可以控制燒傷創(chuàng)面綠膿桿菌感染，治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎，并且其治療肝炎的作用機(jī)制與TGF-β1有關(guān)［5～15］。2014年2～10月，我們觀察了明礬對肝癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥物 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721(天津市腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5%、37℃條件下培養(yǎng)傳代。明礬購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 肝癌細(xì)胞增殖檢測 選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞，以1×104/孔的濃度接種到24孔板，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組，SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后分別加入50、100、150 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，加藥后分別于 24、48、72、96、120、144、168 h終止反應(yīng)，消化、收集細(xì)胞，在倒置顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，并作出生長曲線。實(shí)驗(yàn)組和對照組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 肝癌細(xì)胞周期及凋亡檢測 采用流式細(xì)胞儀。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞，以5×104/孔的濃度接種到6孔板上，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組，SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，藥物處理96 h后，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按試劑盒(美國BD公司)說明書進(jìn)行PI染色，檢測細(xì)胞周期。用AnnexinV-FITC/PI熒光染色，檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4 肝癌細(xì)胞 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 檢測采用RT-PCR法。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞，以1×105/孔的濃度接種到6孔板上，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組，SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，藥物處理96 h后，提取細(xì)胞總RNA，取2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，并以1 μL cDNA作為模板，進(jìn)行 RT-PCR。所用引物:TGF-β1:5＇-GGCCCTGCCCCTACATTT-3＇，5＇-CCGGGTTATGCTGGTTGTACA-3＇;p21WAF1/CiP 1:5＇-TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3＇，5＇-GGCGTTTGGAGTGGTAGAAAT-3＇;bFGF:5＇-GATCCCGGGCGCTGCAGCTTG-3＇，5＇-GTTCACGGATGGGTGTCTCCGCG-3＇;Cyclin E:5＇-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3＇，5＇-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3＇;GAPDH:5＇-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3＇，5＇-CTGTTGCTGTA-GCCAAATTCGT-3＇。

1.5 肝癌細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白檢測 采用ELISA法。選擇對數(shù)生長期HepG2、SMMC-7721細(xì)胞，以1×105/孔的濃度接種到6孔板上，分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及對照組(HepG2細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)1組和對照1組，SMMC-7721細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)2組和對照2組)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁后加入100 μg/mL的明礬，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，藥物處理96 h后，裂解細(xì)胞提取蛋白，分別稀釋 10、100、1 000、10 000倍后按照ELISA試劑盒(達(dá)科為)說明書于490 nm酶標(biāo)儀檢測蛋白含量，確定稀釋100倍時(shí)OD值大小最適宜。分別取稀釋100倍的蛋白裂解液檢測實(shí)驗(yàn)組、對照組細(xì)胞內(nèi) TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較 100 μg/mL的明礬對 HepG2 細(xì)胞株在第 1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 7.3%、1.3%、23.2%、53.7%、68.6%、97.3%，100 μg/mL的明礬對SMMC-7721細(xì)胞株在第1、2、3、4、5、6 天的抑制率分別為 3.6%、4.5%、14.1%、28.3%、47.2%、81.9%。明礬對肝癌細(xì)胞株HepG2和SMMC-7721均有抑制作用，且抑制率具有時(shí)間和劑量依賴性(P均＜0.05)。

2.2 各組細(xì)胞周期、凋亡率比較 HepG2細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)1組及對照1組 G0/G1期細(xì)胞比例分別為73.15%、59.75%，兩組比較，P＜0.05;SMMC-7721細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)2組及對照2組G0/G1期細(xì)胞比例分別為76.66%、44.11%，兩組比較，P＜0.05。HepG2細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)1組及對照1組細(xì)胞凋亡率分別為22.53%、5.20%，兩組比較，P＜0.05;SMMC-7721細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)2組及對照2組細(xì)胞凋亡率分別為17.63%、4.80%，兩組比較，P ＜0.05。

2.3 各組細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA 表達(dá)量分別為9.01±0.71、9.14±0.61、7.41±0.05，對照1組分別為8.23±0.24、8.46±0.13、8.41±0.11，兩組比較，P 均 ＜0.05;實(shí)驗(yàn) 2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E mRNA表達(dá)量分別為9.68±0.12、9.34±0.64、8.30±0.18，對照 2組分別為 7.84±0.12、8.23±0.12、8.65±0.35，兩組比較，P 均 ＜0.05。

2.4 各組細(xì)胞TGF-β1、p21、Cyclin E蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達(dá)量分別為(141.90±7.69)、(145.8±14.70)、(27.51±1.38)pg/mL，對照1組分別為(36.49±4.20)、(43.01±1.50)、(48.27±7.70)pg/mL，兩組比較，P 均 ＜0.05;實(shí)驗(yàn)2 組 TGF-β1、p21、Cyclin E 蛋白表達(dá)分別為(178.50±17.77)、(201.40±18.65)、(24.18±3.44)pg/mL，對照2組分別為(43.15±1.77)、(41.01 ±0.64)、(45.60 ±3.91)pg/mL，兩組比較，P均＜0.05。

3 討論

肝癌是一種富含血管的實(shí)體性腫瘤，全世界每年約有75萬新發(fā)肝癌患者，并約有70萬患者死于肝癌。早期肝癌患者可進(jìn)行手術(shù)治療或肝移植治療，但其復(fù)發(fā)率仍然很高，晚期肝癌患者缺少有效的治療方法。肝癌的發(fā)生涉及多種細(xì)胞因子和信號通路，目前針對分子靶點(diǎn)的靶向治療成為研究熱點(diǎn)［1］。

明礬是一種常見的中藥，主含含水硫酸鋁鉀，具有收濕斂瘡、止血化腐作用，外用能解毒殺蟲、燥濕止癢，內(nèi)服可利膽、止血止瀉、祛除風(fēng)痰［14］。在我國，明礬主要產(chǎn)于甘肅、安徽、山西、湖北、浙江等地［15］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，明礬可以治療內(nèi)痔、脫肛、子宮脫垂，對控制燒傷創(chuàng)面綠膿桿菌感染有效，亦可治療慢性胃炎、胃及十二指腸潰瘍、傳染性肝炎［5～15］。

TGF-β1信號通路作用復(fù)雜，在腫瘤早期其可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制腫瘤的作用［2，3］。在肝癌細(xì)胞中，以 TGF-β1處理肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7，48 h后增殖細(xì)胞核抗原顯著下降，而Caspase-3、細(xì)胞色素C則明顯升高，并且IFNα2b可增強(qiáng)此效應(yīng)，說明TGF-β1/Smad信號通路可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。但是，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1受體 TGFβR 的突變［16］以及TGF-β1信號通路突變［17］常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對TGF-β1的抑制作用不敏感。研究［17］表示，37% ～70%的肝癌組織中存在TβRⅡ表達(dá)下降，酪氨酸激酶受體C可通過與TGFβRⅡ結(jié)合而抑制TGF-β1信號通路功能發(fā)揮，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移［18］，而 Smad2、4 發(fā)生基因突變［19～22］等亦可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞內(nèi)TGF-β1抑制信號通路的失活。因此，重新修復(fù)TGF-β1信號通路的抑制作用，是一種新的治療肝癌的方法。在明礬治療肝炎作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，其抑制肝細(xì)胞損傷和纖維化作用與TGF-β1相關(guān)。因此，我們推測明礬能夠激活修復(fù)TGF-β1信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究顯示，明礬能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且呈時(shí)間和劑量依賴性，并且明礬能夠把肝癌細(xì)胞阻滯在G1期，并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

Cyclin E是G1期細(xì)胞周期素，是細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換的主要限速因素之一［23］。p21是細(xì)胞周期抑制蛋白Cip/Kip家族中的一員，是目前所知最廣泛的細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子之一，p21與 CDK2結(jié)合，通過競爭性抑制作用阻止Cyclin E、CDK2結(jié)合，抑制Cyclin E-CDK2復(fù)合物的活性，進(jìn)而使Rb蛋白無法被磷酸化，從而不能釋放轉(zhuǎn)錄因子，而使細(xì)胞生長停滯于 G1期［24］。p21基因是TGF-β1信號通路的下游調(diào)節(jié)基因，在TGF-β1抑制腫瘤作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在TGF-β1經(jīng)典的Smad依賴性通路中，TGF-β1在 TβRⅢ輔助下，與TβRⅡ受體結(jié)合，TβRⅡ通過轉(zhuǎn)磷酸化作用磷酸化TβRⅠ，進(jìn)一步促進(jìn)Smad2、3，與Smad4結(jié)合后進(jìn)入胞核，促進(jìn)p21基因轉(zhuǎn)錄［3］。轉(zhuǎn)錄表達(dá)的p21蛋白通過抑制Cyclin E/A-CDK2復(fù)合體的形成，將細(xì)胞阻滯于G1期［18］。明礬作用于肝癌細(xì)胞株后，細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、p21表達(dá)增加，Cylin E 表達(dá)降低，說明明礬活化了肝癌細(xì)胞株的TGF-β1/Smad/p21通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞阻滯在G1期，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

總之，明礬能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，使肝癌細(xì)胞阻滯于G1期，并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與促進(jìn)TGF-β1、p21表達(dá)及下調(diào)Cyclin E表達(dá)有關(guān)。

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