環(huán)巴胺抑制Shh信號對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

邵力偉，姚春，伍龍，任德發(fā)(江漢大學(xué)附屬第二醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院，武漢430050)

環(huán)巴胺抑制Shh信號對乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

邵力偉，姚春，伍龍，任德發(fā)
(江漢大學(xué)附屬第二醫(yī)院、武漢市第五醫(yī)院，武漢430050)

摘要:目的探討環(huán)巴胺靶向抑制Shh信號對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡以及Survivin表達(dá)的影響。方法采用熒光定量PCR法檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織中Shh、PTCH1及GLi1的表達(dá)，MTT法檢測不同濃度環(huán)巴胺對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖抑制的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測環(huán)巴胺對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，Western blot檢測環(huán)巴胺處理前后MCF-7細(xì)胞GLi1和Survivin的表達(dá)。結(jié)果Shh、PTCH1及GLi1在乳腺癌組織中均呈高表達(dá);不同濃度環(huán)巴胺均可抑制MCF-7細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡;環(huán)巴胺處理后GLi1和Survivin的表達(dá)均降低。結(jié)論Shh信號在乳腺癌組織中呈激活狀態(tài)，靶向抑制Shh信號可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其可能通過抑制Survivin表達(dá)發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞:乳腺癌; Shh信號;環(huán)巴胺;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡; Survivin蛋白

研究顯示，Shh信號在多種惡性腫瘤中異常激活并與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)，針對Shh信號通路的靶向治療有望成為治療惡性腫瘤的新途徑［1～3］。凋亡抑制蛋白Survivin是抑制細(xì)胞凋亡的重要成分之一，抑制腫瘤細(xì)胞中Survivin的表達(dá)可起到抑制增殖、促進凋亡的作用［4］。本研究通過檢測乳腺癌細(xì)胞中Shh信號分子(Shh、PTCH1、GLi1)的表達(dá)情況，進一步利用Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺作用于人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，觀察其對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及Survivin表達(dá)的影響。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2008年1月～2012年12月我院收治的乳腺癌手術(shù)患者46例，年齡30～69 (42.8±3.1)歲。術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診。其中浸潤性導(dǎo)管癌39例、其他7例。TNM分期Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期31例，Ⅳ期5例。術(shù)中分別取腫瘤組織和癌旁正常乳腺組織迅速冷凍于液氮，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2細(xì)胞與試劑人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7(由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心實驗室自行傳代培養(yǎng))培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。SYBR Premix EX Taq試劑盒購自Invitrogen公司; RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol試劑為美國Gibco公司產(chǎn)品;環(huán)巴胺、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胰酶等為美國Sigma公司產(chǎn)品;一抗GLi1、Survivin、GAPDH兔抗人單克隆抗體均購自Cell signaling公司;二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3檢測方法

1.3.1Shh信號相關(guān)蛋白檢測采用實時熒光定量PCR方法。取乳腺癌組織和癌旁正常組織，按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，以其為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈，－20℃保存?zhèn)溆谩０凑誗YBR試劑盒說明書操作。Shh上游引物: 5'-CCCAATTACAACCCCGACATC-3';下游引物: 5'-TCACCCGCAGTTTCACTCCT-3'。PTCH1上游引物: 5'-TGAGACTGACCACGGCCTG-3';下游引物: 5'-ACCCTCAGTTGGAGCTGCTTC-3'。GLi1上游引物: 5'-GTGCAAGTCAAGCCAGAACA-3';下游引物: 5'-ATAGGGGCCTGACTGGAGAT-3'。內(nèi)參GAPDH上游引物: 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3';下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3.2細(xì)胞增殖檢測采用MTT法。將MCF-7以5×104/mL接種于96孔板中，每孔200 μL。在37℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。分別加入5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺，未處理細(xì)胞作為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4h。更換培養(yǎng)液為150 μL的DMSO，震蕩混勻，用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處的吸光度值。細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組吸光度－實驗組吸光度)/對照組吸光度×100%。重復(fù)實驗3次取平均值。

1.3.3細(xì)胞凋亡檢測將MCF-7消化重懸后，以2 ×105/孔接種于6孔板中，分別加入5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺，未處理細(xì)胞作為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。常規(guī)胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，加入Annexin V-FITC和PI避光室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次取平均值。

1.3.4Survivin蛋白檢測采用Western blot法。收集0、5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺處理48 h后的MCF-7細(xì)胞，提取蛋白，測定蛋白濃度。取20 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。常規(guī)封閉、洗膜后加入一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1Shh信號在腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)腫瘤組織中Shh、PTCH1和GLi1的表達(dá)均顯著高于癌旁組織(P均＜0.01)。見表1。

表1　Shh信號相關(guān)蛋白在乳腺癌中的表達(dá)(n=3，相對表達(dá)量，±s)

注:與腫瘤組織比較，*P＜0.01。

檢測部位Shh　PTCH1　GLI1腫瘤組織0.473±0.324　0.36±0.209　0.296±0.106癌旁組織　1.558±0.431*　0.99±0.202*　2.105±0.700*

2.2不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7增殖的影響MTT實驗結(jié)果顯示，5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺均可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖，其抑制作用具有時間和劑量依賴性。見表2。

表2　不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7增殖抑制率的影響(n=3，%，±s)

組別　MCF-7增殖抑制率24 h　48 h　72 h對照組0.14±0.59　1.58±0.83　3.71±3.34環(huán)巴胺組5 μmol/L　8.73±0.45　10.47±0.70　13.17±0.45 10 μmol/L　18.90±2.95　27.07±4.05　33.20±2.75 20 μmol/L　29.40±6.26　37.83±3.23　38.57±4.52 F 39.942　116.378　82.495 P 0.000　0.000　0.000

2.3不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，0、5、10、20 μmol/L環(huán)巴胺均可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，其凋亡率分別為(1.94± 0.64) %、(11.09±1.65) %、(26.87±0.97) %、(32.56±2.67) %，隨環(huán)巴胺濃度增加，凋亡率明顯增加(P＜0.01)。

2.4不同濃度環(huán)巴胺對Survivin蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，不同濃度環(huán)巴胺均可降低GLi1和Survivin的表達(dá)，其作用隨濃度增加而增強。見圖1。

3　討論

研究顯示，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在乳腺癌中呈激活狀態(tài)，靶向抑制這些信號通路可能成為一種新的治療乳腺癌的手段［5］。Shh信號通路在調(diào)控胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化中具有重要作用，其異常激活與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Shh信號通路的關(guān)鍵因子包括Shh、PTCH、GLi等，在Hh信號激活時，Hh與PTCH(PTCH1、PTCH2)結(jié)合，進一步將信號傳遞給轉(zhuǎn)錄因子GLi(GLi1、GLi2、GLi3)，后者進入核內(nèi)，促進基因表達(dá)，參與對細(xì)胞增殖與凋亡的調(diào)控過程。研究表明，在肝癌、胃癌、骨肉瘤、乳腺癌［6］等惡性腫瘤中均存在Shh信號的異常激活。本研究顯示，乳腺癌組織及癌旁正常組織中Shh信號分子Shh、PTCH1和GLi1均呈高表達(dá)，與文獻［7～9］報道相符。

本研究使用Shh信號通路的特異性抑制劑環(huán)巴胺體外作用于乳腺癌細(xì)胞，觀察不同濃度環(huán)巴胺對MCF-7細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果顯示，不同濃度環(huán)巴胺均可抑制Shh信號關(guān)鍵分子GLi1的表達(dá)，且可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。提示體外靶向抑制Shh信號通路可抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，有望對乳腺癌起到治療作用。

Shh信號激活后可通過作用于多種效應(yīng)分子來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡［10］。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，其在惡性腫瘤中常呈高表達(dá)而起到促進增殖和抑制凋亡的作用，采用各種手段抑制腫瘤細(xì)胞中Survivin的表達(dá)可起到抑制腫瘤生長的作用［11］。本研究顯示，應(yīng)用環(huán)巴胺抑制Shh信號后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Survivin的表達(dá)顯著降低，提示環(huán)巴胺靶向抑制Shh可能是通過抑制Survivin的表達(dá)而對乳腺癌細(xì)胞起到殺傷作用。

綜上所述，Shh信號在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。應(yīng)用Shh信號通路特異性抑制劑環(huán)巴胺靶向抑制Shh信號可有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其可能是通過抑制Survivin的表達(dá)發(fā)揮作用。

參考文獻:

［1］Singh BN，F(xiàn)u J，Srivastava RK，et al.Hedgehog signaling antagonist GDC-0449 (Vismodegib) inhibits pancreatic cancer stem cell characteristics: molecular mechanisms［J］.PLoS One，2011，6 (11) : 27306.

［2］Chaudary N，Pintilie M，Hedley D，et al.Hedgehog pathway signaling in cervical carcinoma and outcome after chemoradiation［J］.Cancer，2012，118(12) : 3105-3015.

［3］Fingas CD，Bronk SF，Werneburg NW，et al.Myofibroblast-derived PDGF-BB promotes Hedgehog survival signaling in cholangiocarcinoma cells［J］.Hepatology，2011，54(6) : 2076-2088.

［4］Liang X，Da M，Zhuang Z，et al.Effects of Survivin on cell proliferation and apoptosis in MG-63 cells in vitro［J］.Cell Biol Int，2009，33(1) : 119-124.

［5］Riggio M，Polo ML，Blaustein M，et al.PI3K/AKT pathway regulates phosphorylation of steroid receptors，hormone independence and tumor differentiation in breast cancer［J］.Carcinogenesis， 2012，33(3) : 509-518.

［6］Harris LG，Pannell LK，Singh S，et al.Increased vascularity and spontaneous metastasis of breast cancer by hedgehog signaling mediated upregulation of cyr61［J］.Oncogene，2012，31(28) : 3370-3380.

［7］Jeng KS，Sheen IS，Jeng WJ，et al.High expression of Sonic Hedgehog signaling pathway genes indicates a risk of recurrence ofbreast carcinoma［J］.Onco Targets Ther，2013，27(7) : 79-86.

［8］Chen YJ，Kuo CD，Chen SH，et al.Small-molecule synthetic compound norcantharidin reverses multi-drug resistance by regulatingSonic hedgehog signaling in human breast cancer cells［J］.PLoS One，2012，7(5) : 37006.

［9］Thomas ZI，Gibson W，Sexton JZ，et al.Targeting GLI1 expression in human inflammatory breast cancer cells enhances apoptosis and attenuates migration［J］.Br J Cancer，2011，104(10) : 1575-1586.

［10］Iwasaki H，Nakano K，Shinkai K，et al.Hedgehog Gli3 activator signal augments tumorigenicity of colorectal cancer via upregulation of adherence-related genes［J］.Cancer Sci，2013，104(3) : 328-336.

［11］Song K，Shankar E，Yang J，et al.Critical Role of a Survivin/TGF-β/mTORC1 Axis in IGF-I-Mediated Growth of Prostate Epithelial Cells［J］.PLoS One，2013，8(5) : 61896.

(收稿日期:2014-12-31)

文章編號:1002-266X(2015) 18-0058-03

文獻標(biāo)志碼:B

中圖分類號:R737.9

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.021