慢性煙曲霉暴露對支氣管哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥及氣道重構(gòu)的影響

汪澤，高艷艷，劉永全，高福生(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊6053;濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

慢性煙曲霉暴露對支氣管哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥及氣道重構(gòu)的影響

汪澤1，高艷艷2，劉永全2，高福生2
(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053;2濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

摘要:目的探討慢性煙曲霉暴露對支氣管哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重構(gòu)的影響。方法將56只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為A組(慢性哮喘組)、B組(慢性哮喘+煙曲霉孢子滴入組)、C組(慢性哮喘+生理鹽水滴入組)、D組［卵白蛋白(OVA)致敏+生理鹽水激發(fā)+生理鹽水滴入組］、E組(OVA致敏+生理鹽水激發(fā)+煙曲霉孢子滴入組)，B組再分成B1、B2、B3組(分別吸入煙曲霉1、3、5周)，每組各8只。測定大鼠氣道阻力(R(aw))及乙酰膽堿注射后R(aw)變化率; ELISA法測定血清中總IgE和肺泡灌洗液(BALF)中IL-13、IL-5、IFN-γ、TGF-β水平;制作肺組織切片，并行HE染色、過碘酸雪膚(PAS)染色、Masson三色染色和病理圖像形態(tài)學(xué)測定，觀察各組氣道上皮細(xì)胞損傷脫落、杯狀細(xì)胞增生及上皮下纖維化程度。結(jié)果B3組R(aw)和BALF中IL-5、IL-13、TGF-β水平及血清總IgE水平、炎細(xì)胞浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞浸、脫落上皮長度/氣道上皮內(nèi)徑、杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原纖維沉積均高于A、C、D、E組(P＜0.05或P＜0，01)。結(jié)論慢性煙曲霉暴露可加重支氣管哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重構(gòu)程度。

關(guān)鍵詞:支氣管哮喘;煙曲霉;氣道高反應(yīng)性;氣道炎癥;氣道重構(gòu);大鼠

煙曲霉是大氣環(huán)境中常見的腐物寄生真菌，其孢子極易被吸入下呼吸道，在合適的條件下發(fā)芽生長，在呼吸道定植或引發(fā)侵襲性感染［1］。哮喘患者氣道微環(huán)境發(fā)生改變，有利于煙曲霉孢子在呼吸道黏膜的黏附［2，3］。研究顯示，環(huán)境中真菌孢子濃度升高與哮喘患者肺功能下降及住院率和病死率的升高密切相關(guān)［4，5］。Lordan等發(fā)現(xiàn)，過敏原與Th2型細(xì)胞因子具有協(xié)同作用，促進(jìn)氣道炎癥和氣道重構(gòu)［6］。Beisswenger等發(fā)現(xiàn)，感染銅綠假單胞菌后，經(jīng)卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)的小鼠肺內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量和活力均高于未致敏小鼠，提示氣道過敏性炎癥抑制了宿主固有的抗感染免疫功能［7］。氣道過敏性炎癥和氣道上皮損傷可能使哮喘大鼠對慢性煙曲霉暴露的反應(yīng)發(fā)生變化，導(dǎo)致真菌在氣道中定植，加重氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重構(gòu)。2014年，我們通過制作大鼠慢性哮喘模型，觀察煙曲霉暴露1～5周時大鼠氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重構(gòu)的變化?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料清潔級雄性Wistar大鼠56只，體質(zhì)量180～250 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。OVA干粉(美國Santa Cruz公司)，氫氧化鋁(淄博昌豐化工)，乙酰膽堿(Ach，淄博昌豐化工)，ELISA試劑盒(美國ADL公司) ;霧化器403E(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備公司)，霧化箱(自制)，呼吸速率描記儀(飛利浦公司)，壓力換能器Smup型生物信號處理系統(tǒng)。

1.2動物分組及模型制備將56只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成A、B(按煙曲霉暴露時間分為B1、B2、B3組)、C、D、E組，每組8只。A、B、C組大鼠均采用OVA致敏+ OVA反復(fù)激發(fā)的方法制備大鼠慢性哮喘模型［7，8］。第3～8周時大鼠出現(xiàn)煩躁、應(yīng)激、呼吸急促等表現(xiàn)為模型制作成功。D、E組采用OVA致敏+生理鹽水反復(fù)激發(fā)。第9周開始，A組正常飼養(yǎng)不做處理。B、E組給予100 L煙曲霉孢子懸液滴鼻，2次/周。按照文獻(xiàn)［7］方法制備煙曲霉孢子懸液。大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取頭高腳底垂直位，取100 L煙曲霉孢子懸液(含1×104cfu/mL孢子)，緩慢滴入大鼠雙側(cè)鼻孔，維持垂直體位10 min; B1、B2、B3組分別給予煙曲霉孢子懸液滴鼻1、3、5周，E組給予煙曲霉孢子懸液滴鼻5周，均為2次/周; C、D組大鼠以同樣方式給予100 L生理鹽水滴鼻5周，2次/周。

1.3觀察指標(biāo)及方法在末次滴鼻24 h后，麻醉各組大鼠，行氣道阻力(Raw)檢測;檢測后心臟穿刺取血，測定血清總IgE;行肺泡灌洗，測定灌洗液中IL-13、IL-5、IFN-γ、TGF-β水平;最后取右肺上葉組織行肺組織病理檢查。

1.3.1Raw測定大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，置于36℃恒溫電熱毯上，剪開頸部皮膚，分離頸外靜脈、氣管及食管，分別在氣管和食管上剪一小口，插入導(dǎo)管，將導(dǎo)管與呼吸速率描記儀相接，將呼吸換能器連入微分放大器將信號微分，得到氣流速。食管導(dǎo)管遠(yuǎn)端置于食管胸腔下段，近端連接壓力換能器，測定食管胸腔段內(nèi)壓代替胸腔內(nèi)壓。測定基礎(chǔ)Raw(跨肺壓與氣流速度之比)后，頸外靜脈注入Ach 300 g/kg，計算Raw變化率。

1.3.2血清IgE與支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞因子測定Raw后，將大鼠固定，剖開胸腔，心臟穿刺取血1 mL，離心取上清，用ELISA法測定血清總IgE。經(jīng)氣管插管處分6次注入PBS液，每次5 mL，回收BALF，離心取上清，ELISA法測定IL-13、IL-5、IFN-γ、TGF-β。

1.3.3肺組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)扎右主支氣管，取右肺上葉用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色、過碘酸雪膚(PAS)染色、Masson三色染色，每種染色切片從每組中隨機(jī)取不同大鼠的5張肺組織切片，測量和分析所有直徑250～2 000 m且管腔最短徑/最長徑≥0.6的支氣管。顯微鏡下觀察，采集圖像，應(yīng)用AxioVision3.1圖像分析軟件進(jìn)行肺組織病理圖像的形態(tài)學(xué)測量。HE染色切片:用每100 m上皮基底膜平均炎癥細(xì)胞數(shù)目表示炎癥浸潤，油鏡下計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞，以每mm上皮基底膜平均嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)表浸潤程度，測量無完整纖毛細(xì)胞或杯狀細(xì)胞覆蓋的上皮長度及支氣管上皮內(nèi)徑的周長，兩者百分比示上皮細(xì)胞脫落情況; PAS染色切片:測量染成玫瑰紅色的面積、氣道上皮表面與基底膜間區(qū)域的總面積，兩者百分比作為杯狀細(xì)胞增生程度; Masson三色染色切片:測量氣道上皮基底膜下20 m區(qū)域內(nèi)染成藍(lán)色的總面積及非細(xì)胞部分的面積，用染成藍(lán)色部分的面積占該區(qū)域總面積的百分比表示上皮下膠原纖維沉積的程度。

1.3.4煙曲霉定植情況對右肺上葉組織標(biāo)本行GMS染色，觀察有無煙曲霉孢子或菌絲。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以珋x±s表示，組間均數(shù)比較采用SNK檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組Raw及其變化率比較A、B、C、D組與E、F組比較，基礎(chǔ)Raw、靜注Ach后Raw及Raw變化率明顯升高(P＜0.05或＜0.01)，A、C組基礎(chǔ)Raw、靜注Ach后Raw與Raw變化率無明顯差異。煙曲霉暴露1周后，B1組與A組比較無明顯差異，但隨著時間延長，B組各Raw值呈進(jìn)行性升高，B3組明顯高于B2組(P均＜0.01)。見表1。

表1　各組Raw及其變化率比較(n=8，±s)

注:與A組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與B3組比較，△P＜0.01。

組別基礎(chǔ)Raw(cmH2O/mLos)靜注Ach后Raw(cmH2O/mLos) Raw變化率(%) A組0.55±0.16　0.60±0.18　30.44±4.55 B1組　0.58±0.18　0.65±0.20　35.89±3.78 B2組　0.92±0.21＊＊　1.46±0.26*　62.98±5.32＊＊B3組　1.12±0.20＊＊　1.98±0.52＊＊　83.88±6.14＊＊C組　0.52±0.16△　0.63±0.19△　32.36±4.27△D組　0.35±0.07*　0.45±0.15*　16.64±3.50＊＊E組　0.36±0.09＊△　0.43±0.12＊△　16.24±3.88＊＊△

表2　各組血清總IgE、BALF上清細(xì)胞因子(n=8，ng/mL，±s)

注:與A組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，與B3組比較，△P＜0.01。

組別　血清總IgE BALF IL-5　IL-13　TGF-β　IFN-γ A組　53.66±11.01　33.79±5.26　52.66±8.15　61.93±15.11　36.93±6.45 B1組　88.22±18.77＊＊　47.11±8.23*　95.55±15.73*　88.92±18.23*　36.45±6.44 B2組　119.33±23.89＊＊　60.02±11.24＊＊　160.02±11.24＊＊　125.57±28.03＊＊　37.76±7.02 B3組　134.89±26.98＊＊　75.17±16.89＊＊　197.24±34.35＊＊　147.55±28.22＊＊　35.55±7.06 C組　28.33±5.18＊△　18.25±4.88＊＊△　35.33±7.77＊△　36.66±7.51＊△　35.98±6.96 D組　18.44±4.02＊＊　13.27±4.26＊＊　21.88±5.69＊＊　25.88±6.99＊＊　19.45±4.65＊＊E組　17.36±4.02＊＊△　11.79±3.44＊＊△　24.15±5.73＊＊△　28.12±6.45＊＊△　22.28±5.22＊△

2.2各組血清總IgE、BALF上清細(xì)胞因子水平比較隨煙曲霉暴露時間的增加，B組大鼠血清總IgE 及BALF上清中IL-5、IL-13、TGF-β水平呈進(jìn)行性增高，B3組顯著高于B1和B2組(P＜0.05或P＜0.01)，B組均高于A、C、D、E組。D、E組經(jīng)鼻滴入生理鹽水后IFN-γ水平降低，其余各組IFN-γ無明顯變化。A組血清總IgE及BALF上清中IL-5、IL-13、TGF-β水平均高于C、D、E組。D、E組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3大鼠肺組織病理學(xué)改變肺組織病理形態(tài)學(xué)測量顯示，E組無明顯氣道改變，A組氣道壁炎癥浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞增生程度、上皮下膠原纖維沉積程度均較E組加重(P ＜0.01)，B組以上指標(biāo)隨煙曲霉暴露時間的增加均呈進(jìn)行性加重(P均＜0.01)。C組生理鹽水滴鼻5周后，氣道炎癥浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞脫落程度較A組減輕(P均＜0.05)，杯狀細(xì)胞增生程度無明顯改變。D組與E組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.4煙曲霉在大鼠氣道內(nèi)定植情況煙曲霉暴露

表3　各組氣道炎癥浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤上皮細(xì)胞脫落情況、杯狀細(xì)胞增生及上皮下膠原沉積程度(n=8，±s)

注:與A組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與B3組比較，△P＜0.01。

組別　炎癥浸潤　嗜酸性粒細(xì)胞浸潤　脫落上皮長度/上皮內(nèi)徑(%)杯狀細(xì)胞增生程度(%)　上皮下膠原沉積程度(%) A組　43.78±6.88　1.65±0.54　6.11±1.72　12.85±3.47　18.46±5.24 B1組　66.33±9.12*　2.88±0.77*　12.16±3.84*　17.11±5.34*　25.05±6.67*B2組　90.12±12.45＊＊　4.35±1.15＊＊　27.18±6.15＊＊　23.53±6.88＊＊　44.12±12.44＊＊B3組　115.10±18.22＊＊　7.52±2.23＊＊　29.02±7.25＊＊　38.11±9.52＊＊　57.33±15.42＊＊C組　26.21±6.62＊＊△　0.66±0.22＊＊△　3.17±0.88＊△　9.99±3.07△　15.67±4.13△D組　11.35±4.48＊＊　0.00±0.00　0.00±0.00　3.95±0.81＊＊　3.08±0.68＊＊E組　12.00±4.15＊＊△　0.00±0.00　0.00±0.00　6.33±1.23＊＊△　5.36±0.99＊＊△

5周后，B、E組大鼠氣道和肺實質(zhì)內(nèi)均無煙曲霉菌絲生長; B組大鼠肺部單核細(xì)胞中均可見數(shù)量不等的完整或部分降解的煙曲霉孢子滯留，E組則無此現(xiàn)象。

3　討論

煙曲霉可在1%～2%慢性哮喘患者的氣道內(nèi)定植、生長，引發(fā)變態(tài)反應(yīng)性支氣管肺曲菌?。?］。與健康人相比，哮喘患者氣道內(nèi)可發(fā)生多種病理變化，包括氣道上皮細(xì)胞損傷、氣道高反應(yīng)性、氣道的高分泌狀態(tài)以及氣道重構(gòu)等。研究表明，上皮細(xì)胞損傷程度與氣道反應(yīng)性和上皮通透性正相關(guān)［10］，并且損傷或活化的氣道上皮細(xì)胞可產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)氣道炎癥和氣道重構(gòu)持續(xù)進(jìn)展［11］。IL-5可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)的浸潤; IL-13可上調(diào)氣道黏蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞增生，致使氣道黏液過度分泌，Raw增加。因此IL-5、IL-13 等Th2型細(xì)胞因子是哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性及氣道重構(gòu)的重要調(diào)控因子［11］。長期吸入煙曲霉孢子可上調(diào)BALF中細(xì)胞因子水平和血清總IgE水平，而肺組織和氣道內(nèi)炎性因子的增高及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤與哮喘嚴(yán)重性正相關(guān)［10］。氣道重構(gòu)是支氣管哮喘最重要的病理學(xué)特征之一，也是加重哮喘氣流受限及氣道高反應(yīng)性的基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為氣道上皮杯狀細(xì)胞增生、氣道平滑肌肥厚和基底膜下膠原沉積等病理改變［11］。TGF-β具有促纖維化活性，與氣道重構(gòu)密切相關(guān)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，慢性煙曲霉暴露可致慢性哮喘大鼠氣道上皮細(xì)胞損傷脫落、基底膜裸露加重，激活損傷—修復(fù)機(jī)制，這種損傷與修復(fù)持續(xù)交替發(fā)生，最終導(dǎo)致氣道重構(gòu)，同時氣道上皮細(xì)胞受損程度與氣道炎癥和氣道重構(gòu)密切相關(guān)［13］。

本研究采用非變應(yīng)性支氣管肺曲霉病哮喘大鼠模擬哮喘患者，對OVA致敏的哮喘大鼠長期吸入煙曲霉孢子，模擬哮喘患者生活中煙曲霉暴露情況，觀察慢性煙曲霉暴露對氣道炎癥和重構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，慢性哮喘大鼠長期低濃度吸入煙曲霉孢子后，氣道阻力增加，BALF中IL-5、IL-13、TGF-β水平升高，血清總IgE增多，氣道炎細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞增生、上皮下膠原纖維沉積程度均明顯升高，且隨著吸入煙曲霉孢子時間的延長，哮喘大鼠BALF中Th2細(xì)胞分泌的IL-5、IL-13、TGF-β水平隨之升高，氣道炎癥及氣道高反應(yīng)更加明顯，氣道重構(gòu)程度加重，而Th1細(xì)胞分泌的IFN-β水平無明顯變化，提示慢性煙曲霉暴露呈時間依賴性加重哮喘大鼠Th2型氣道炎癥、氣道高反應(yīng)及氣道重構(gòu)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，煙曲霉暴露5周后，B、E組大鼠氣道和肺實質(zhì)內(nèi)均無煙曲霉菌絲生長; B組大鼠肺部單核細(xì)胞中均可見數(shù)量不等的完整或部分降解的煙曲霉孢子滯留。說明慢性煙曲霉暴露并未導(dǎo)致哮喘大鼠發(fā)生煙曲霉菌氣道定植或侵襲性感染，但煙曲霉孢子可在哮喘大鼠肺內(nèi)積聚，這與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)慢性化密切相關(guān)［9］。非哮喘大鼠鼻腔滴入煙曲霉孢子懸液5周(E組)后，無明顯氣道病理改變，且未發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)存在煙曲霉孢子或菌絲，表明長期低濃度煙曲霉暴露不會導(dǎo)致非哮喘大鼠氣道過敏性炎癥和侵襲性感染。提示慢性煙曲霉暴露對哮喘大鼠氣道重構(gòu)及氣道炎癥的影響并不依賴于煙曲霉的氣道定植或感染，即使未發(fā)生煙曲霉的氣道定植或感染，慢性煙曲霉暴露也可造成哮喘大鼠氣道重構(gòu)及氣道炎癥。哮喘大鼠鼻腔滴入生理鹽水5周后(C組)，其氣道炎癥有一定程度減輕，氣道重構(gòu)和氣道高反應(yīng)性無明顯變化。本結(jié)果與Kumar等［14］在小鼠慢性哮喘模型中的發(fā)現(xiàn)相符。

綜上所述，慢性煙曲霉暴露可加重OVA致敏的哮喘大鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥，誘導(dǎo)氣道重構(gòu)加重，因此避免煙曲霉暴露可能有助于防止支氣管哮喘的進(jìn)行性加重。

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Effects of chronic Aspergillus fumigatus exposure on bronchial hyperresponsiveness，airway inflammation and remodeling in rats with bronchial asthma

WANG Ze1，GAO Yan-yan，LIU Yong-quan，GAO Fu-sheng (1 Weifang Medical College，Weifang 261053，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of chronic Aspergillus fumigatus (A.fumigatus) exposure on the bronchial hyperresponsiveness，airway inflammation and remodeling in rats with bronchial asthma.Methods Sixty-four male Wistar rats were randomly divided into group A (chronic asthma group)，group B (chronic asthma+ Af spore inhalation group)，group C (chronic asthma+ saline inhalation group)，group D (OVA-sensitized and saline-challenged+ saline inhalation group) and group E (OVA-sensitized and saline-challenged+ Af spore inhalation group).Meanwhile，group B was then divided into groups B1，B2 and B3 (Af spore inhalation for 1 week，3 weeks and 5 weeks) (n=8).The airway resistance (R(aw)) and change rate of R(aw)after administration of acetylcholine chloride were measured by using a computerized system.The concentration of total serum IgE and IL-5，IL-13，IFN-γ，TGF-β levels in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were measured by ELISA.Lung sections were made and then received hematoxylin and eosin (HE) staining，periodic acid Schiff (PAS) staining and Masson trichrome staining.The images were analyzed morphometrically to evaluate the airway epithelial detachment，goblet cell hyperplasia and subepithelial fibrosis in rats of the 7 groups.Results

The change rate of Rawafter administration of acetylcholine chloride，the IL-5，IL-13，TGF-β levels，the concentration of total serum IgE，the inflammatory cell infiltration，the eosinophils，the airway epithelial detachment length/epithelial diameter，the goblet cell hyperplasia and subepithelial collagen deposition were all higher than those in the groups of A，C，D and E(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionsChronic Aspergillus fumigatus (A.fumigatus) exposure aggravates the bronchial hyperresponsiveness，airway inflammation and the degree of airway remodeling in rats with bronchial asthma.

Key words:bronchial asthma; Aspergillus fumigates; bronchial hyperresponsiveness; airway inflammation; airway remodeling;rats

(收稿日期:2015-02-03)

通信作者:高福生

基金項目:山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2012HM094)。

文章編號:1002-266X(2015) 18-0030-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R562

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.010