阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)對肝纖維化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影響

張曉梅，焦占江，殷鵬，丁國善，周杰，崔忠林，錢建平，曾德華(第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院器官移植研究所，上海0000;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)

阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)對肝纖維化大鼠ACE2、AngⅡ、Ang 1-7的影響

張曉梅1，焦占江2，殷鵬1，丁國善1，周杰2，崔忠林2，錢建平2，曾德華3
(1第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院器官移植研究所，上海200003;2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院; 3南京軍區(qū)福州總醫(yī)院)

摘要:目的觀察阻斷腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)不同環(huán)節(jié)對實驗性肝纖維化大鼠肝組織纖維化程度的影響并探討其作用機(jī)制。方法取6周齡SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、卡托普利組、氯沙坦組和螺內(nèi)酯組各10只。正常對照組皮下注射橄欖油，其他組給予40% CCL4腹壁皮下注射制備肝纖維化模型;自次日起，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組分別經(jīng)胃管內(nèi)灌注ACE抑制劑卡托普利、血管緊張素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯，模型組和正常對照組灌注等量生理鹽水。各組動物均于第8周處死，取肝組織行HE染色和Masson染色，觀察其病理變化。ELISA法測定血清與肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7。結(jié)果卡托普利組、氯沙坦組和螺內(nèi)酯組肝纖維化程度較模型組明顯好轉(zhuǎn);模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常對照組，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組(P均＜0.05) ;氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)均可抑制肝纖維化形成，其機(jī)制可能是通過升高血清及肝組織中ACE2、Ang 1-7水平、降低AngⅡ水平來發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

關(guān)鍵詞:腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng);肝纖維化;血管緊張素Ⅱ;血管緊張素1-7

肝纖維化是諸多肝病共同的病理改變。腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)為一內(nèi)分泌系統(tǒng)，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，作用于全身多個器官。除了循環(huán)系統(tǒng)中存在RAAS，許多器官如心、腎、肺、胰腺和肝臟都存在局部或器官內(nèi)的RAAS［1］。研究表明，肝臟局部的RAAS參與肝纖維化的發(fā)展［2］。2012～2015年，我們對肝纖維化大鼠模型胃管灌注血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑卡托普利、血管緊張素(Ang)Ⅱ的Ⅰ型受體阻斷劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯，觀察其對血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平的影響，探討阻斷RAAS不同環(huán)節(jié)抗肝纖維化的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料6周齡清潔級SD大鼠(福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供) 50只，雌雄不拘，體質(zhì)量180～220 g，室溫18～25℃，濕度30%～50%，精制飼料喂養(yǎng)。氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司)，卡托普利片(湖南湘雅制藥有限公司)，螺內(nèi)酯片(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品)。ACE2、AngⅡ、Ang 1-7酶聯(lián)免疫測定試劑盒均購自美國mybiosource公司。

1.2分組與給藥方法將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、卡托普利組、螺內(nèi)酯組和氯沙坦組，每組各10只。正常對照組皮下注射橄欖油，余均予以40% CCL4腹壁皮下注射，3 mL/kg，首劑加倍，1次/3 d，復(fù)制大鼠肝纖維化模型;次日起，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組胃管內(nèi)分別灌注卡托普利60 mg/kg、氯沙坦10 mg/kg、螺內(nèi)酯100 mg/kg，模型組和正常對照組灌注等量生理鹽水，均1次/d。各組動物均于第8周處死，取肝臟相同部位的組織，液氮保存，且在大鼠處死前于大鼠尾靜脈取血。

1.3觀察指標(biāo)①一般情況:觀察大鼠體質(zhì)量、精神、飲食、活動、死亡等情況。②肝組織病理檢查及纖維化評分:肝臟組織染色后在光鏡下觀察其病理變化。參照肝纖維化半定量計分系統(tǒng)(SSS)對大鼠肝纖維化進(jìn)行評分［3］。對大鼠肝組織切片進(jìn)行Masson染色，每張切片選取四周及中央?yún)^(qū)域膠原纖維含量最多的視野，采集圖像后應(yīng)用HIPAS-2000型計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理，計算著色面積和總面積，于100倍鏡下測定膠原纖維面積，以膠原纖維面積/肝組織面積×100%計算膠原纖維面積百分比。③血清及肝組織中ACE2、AngⅡ、Ang 1-7檢測:采用ELISA法測定，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。取出凍存血清及肝組織勻漿后的上清液，室溫溶解。嚴(yán)格按照說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品，逐一梯度稀釋，最后的一管作為空白對照，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，均設(shè)復(fù)孔，每孔100 μL，震蕩混勻。37℃反應(yīng)120 min。洗滌，依次加入一抗、酶標(biāo)抗體、底物工作液100 μL，混合均勻，37℃反應(yīng)30 min。加入終止液100 μL終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD)值。計算濃度:所有OD值減去空白值后再計算，以標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)所測樣品對應(yīng)的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的濃度(樣本被稀釋后的，還應(yīng)乘以稀釋的倍數(shù))。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以珋x±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組一般情況各組均無大鼠死亡。正常對照組精神良好，毛色光澤，運(yùn)動活潑，反應(yīng)敏銳，進(jìn)食、飲水正常，體質(zhì)量增加;模型組精神萎靡，活動少，反應(yīng)遲鈍，進(jìn)食、飲水少，體質(zhì)量下降明顯;卡托普利組、螺內(nèi)酯組和氯沙坦組精神、活動、反應(yīng)、飲食、體質(zhì)量均較模型組好。

2.2各組肝組織病理檢查結(jié)果HE染色顯示，正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向周圍呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)完整。模型組肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，空泡形成，匯管區(qū)擴(kuò)大，匯管區(qū)和肝小葉內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤，假小葉形成?？ㄍ衅绽M、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組見肝細(xì)胞壞死及空泡變性減少，淋巴細(xì)胞浸潤減少。Masson染色可見正常組膠原纖維在血管周圍少量表達(dá)，模型組膠原纖維增生明顯，纖維間隔形成，可見弓形纖維，部分區(qū)域形成假小葉，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組膠原纖維減少，形成的纖維間隔和假小葉明顯減少。

2.3各組肝纖維化SSS評分正常對照組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組肝纖維化評分分別為(0.53±0.15)、(7.05±0.26)、(7.15±0.11)、(6.68±0.31)分，均低于模型組的(19.40±0.87)分(P均＜0.05)，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組均高于正常對照組(P均＜0.05)，氯沙坦組、螺內(nèi)酯組、卡托普利組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4各組膠原纖維面積百分比正常對照組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組膠原纖維面積百分比分別為(0.71±0.04) %、(9.95±0.57) %、(11.18± 0.62) %、(11.53±0.55) %，均低于模型組的(23.70 ±1.87) %，P均＜0.05，卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組均高于正常對照組(P均＜0.05)，氯沙坦組、螺內(nèi)酯組與卡托普利組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5各組血清及肝組織中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平見表1。

表1　各組血清及肝組織中ACE2、AngⅡ和Ang 1-7水平比較(ng/mL，±s)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05。

組別　n ACE2血清　肝組織Ang Ⅱ血清　肝組織Ang 1-7血清　肝組織正常對照組　10　6.30±0.24　7.30±0.30　0.10±0.01　0.23±0.03　0.11±0.01　0.30±0.02模型組　10　13.70±0.57*　14.90±0.48*　0.40±0.03*　0.76±0.03*　0.80±0.02*　0.89±0.02*卡托普利組　10　27.00±0.73＊△　23.30±0.79＊△　0.20±0.02＊△　0.40±0.02＊△　1.49±0.08＊△　1.57±0.28＊△氯沙坦組　10　28.50±1.23＊△　24.30±0.45＊△　0.17±0.02＊△　0.37±0.03＊△　1.32±0.02＊△　1.52±0.35＊△螺內(nèi)酯組　10　28.40±1.03＊△　24.50±0.42＊△　0.16±0.01＊△　0.42±0.03＊△　1.35±0.03＊△　1.50±0.03＊△

3　討論

肝纖維化是由于多種病因(如病毒、乙醇、寄生蟲、銅鐵沉積等)引起慢性肝損傷，最終導(dǎo)致以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)各成分合成增多，降解相對不足，過多沉積在肝內(nèi)，引起肝纖維化［4，5］。肝纖維化屬可逆性病變，肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)。肝纖維化是肝細(xì)胞肝癌的危險因素之一［5］。

RAAS在慢性肝損傷、肝纖維化中起重要作用。除了循環(huán)系統(tǒng)中存在RAAS外，肝臟局部的RAAS也參與了肝纖維化的發(fā)展，并在肝纖維化的形成及發(fā)展過程中起重要作用。以往認(rèn)為，RAAS作用軸ACE-AngⅡ-AT1受體軸是生物關(guān)聯(lián)性的惟一體系，具有促進(jìn)肝纖維形成的作用。ACE2-Ang 1-7-Mas受體軸是新發(fā)現(xiàn)的RAAS作用軸，對肝纖維化的發(fā)生具有保護(hù)作用［6］，被認(rèn)為是ACE-AngⅡ-AT1受體軸的反向調(diào)節(jié)軸［7］。ACE2在RAAS中的作用與ACE相反，被認(rèn)為是RAAS的一個負(fù)性拮抗劑。

ACE2是通過克隆技術(shù)從心衰患者和淋巴癌cDNA庫中克隆出來的人類ACE相關(guān)羧肽酶［8，9］，定位于X染色體的Xp22位點(diǎn)。人類ACE2分子量約為120 kD，由805個氨基酸組成，是Ⅰ型膜結(jié)合糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包括一個由17個氨基酸組成的N末端信號肽區(qū)、一個錨定在細(xì)胞膜C末端的跨膜區(qū)和一個與ACE活性位點(diǎn)相一致的單一HExXH鋅結(jié)合區(qū)。人與嚙齒動物的ACE2是結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，小鼠與人的ACE2有83%的同源性，ACE與ACE2的金屬蛋白酶催化區(qū)有42%是一致的［10］。ACE2被認(rèn)為是慢性肝損傷的負(fù)調(diào)節(jié)劑［11］，對ACE具有拮抗作用。研究表明，RAAS的主要作用成分AngⅡ具有促纖維化的作用［12］，可誘導(dǎo)肝臟星形細(xì)胞收縮和增殖，這是肝腺泡纖維化的主要因素［10～14］。隨著肝纖維化的進(jìn)展，AngⅡ在肝臟中的表達(dá)逐漸增多［15］。研究表明，ACE裂解AngⅠ生成AngⅡ，ACE2可裂解AngⅠ和AngⅡ，分別生成Ang 1-9和Ang 1-7，而Ang 1-9可被ACE裂解，生成Ang 1-7。Ang 1-7對AngⅡ介導(dǎo)的肝臟纖維化具有保護(hù)作用［16］。研究證實，Ang 1-7能夠減輕肝纖維化的程度，同時減少羥脯氨酸及膠原1A1、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGH)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、ACE及Mas受體的基因表達(dá)［17］。亦有研究表明，ACE2可裂解AngⅡ，增加Ang 1-7的生成，在膽管結(jié)扎肝纖維化大鼠中表現(xiàn)出抗肝纖維化的作用［18］。

本研究對循環(huán)中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平均高于正常對照組;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2及Ang 1-7水平均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組;氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示循環(huán)中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均參與了肝纖維化的形成和發(fā)展，肝纖維化形成及發(fā)展中ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，而采用ACE抑制劑卡托普利、AngⅡ受體阻滯劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯分別作用于RAAS的不同環(huán)節(jié)可以提高循環(huán)中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，從而起到抗肝纖維化的作用。

肝臟局部RAAS亦參與肝纖維化的形成及發(fā)

展。本研究對肝臟組織中的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，模型組、卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平亦均高于正常對照組;卡托普利組、氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2及Ang 1-7水平亦均高于模型組、AngⅡ水平低于模型組;氯沙坦組、螺內(nèi)酯組的ACE2、AngⅡ、Ang 1-7水平與卡托普利組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示肝組織中的ACE2、Ang 1-7、AngⅡ均參與了肝纖維化的形成和發(fā)展，肝纖維化組織中，ACE2、Ang 1-7、AngⅡ水平均升高，采用ACE抑制劑卡托普利、AngⅡⅡ受體阻滯劑氯沙坦、醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯分別作用于RAAS的不同環(huán)節(jié)可以提高肝組織中ACE2、Ang 1-7水平，降低AngⅡ水平，從而起到抗肝纖維化的作用。

綜上所述，循環(huán)及肝臟組織中的AngⅡ在肝纖維化形成和發(fā)展中起著促肝纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，而ACE2、Ang 1-7在肝纖維化形成和發(fā)展中具有重要的調(diào)控作用。干預(yù)RAAS不同的環(huán)節(jié)拮抗肝纖維化，可能是通過升高循環(huán)及肝臟組織中的ACE2、Ang 1-7、降低循環(huán)及肝臟組織中的AngⅡ來發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

參考文獻(xiàn):

［1］Bataller R，Sancho-Bru P，Gines P，et al.Activated human hepatic stellate cells express the renin-angiotensin system and synthesize angioteasinⅡ［J］.Gastroenterology，2003，125(1) : 117-125.

［2］Paizis G，Gilbert RE，Cooper ME，et al.Efects of angiotensinⅡtype 1 receptor blockade on experimental hepatic fibrogenesis［J］.Hepatol，2001，35(3) : 376-385.

［3］曾民德，王秦齡.肝纖維化診斷及療效評估共識［J］.中華肝臟病雜志，2002，10(5) : 327-328.

［4］Friedman SL.Liver fibrosis-from bench to bedside［J］.J Hepatol，2003，38(Suppl1) : 38.

［5］Gines P，Cardenas A，Arroyo V，et al.Management of cirrhosis and ascites［J］.N Engl J Med，2004，350(16) : 1646-1654.

［6］Hu YY，Liu P，Liu C，et al.The value of serum markers in evaluating liver fibrosis Changes［J］.Chin J Hepatol，2006，14(3) : 174-177.

［7］Warner FJ，Lubel JS，Mc Caughan GW，et al.Liver fibrosis: a balance of ACEs［J］.Clin Sci(Lond)，2007，113(3) : 109-118.

［8］Iwai M，Horiuchi M.Devil and angel in the renin-angiotensin system: ACE-angiotensinⅡ-AT(1) receptor axis vs ACE2-angiotensin-(1-7) -Mas receptor axis［J］.Hypertens Res，2009，32(7) : 533-536.

［9］Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-converting enzyme.Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase［J］.J Biol Chem，2000，275(43) : 33238-33243.

［10］Donoghue M，Hsieh F，Baronas E，et al.A novel angiotensin-eonverting enzyme-related carboxypeptidase(ACE2) converts angiotensin I to angiotensin 1-9［J］.Circ Res，2000，87(5) : 1-9.

［11］Oesterreicher CH，Seki E，Mincis SD，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 is a negative regulator of chronic liver injury［J］.Hepatology，2007，46(S1) : 298-299.

［12］Abbas G，Silveira MG，Lindor KD.Hepatic fibrosis and the reninangiotensin system［J］.Am J Ther，2011，18(6) : 202-208.

［13］Yang L，Bataller R，Dulyx J，et al.Attenuated hepatic inflammation and fibrosis in angiotensin type 1 a receptor deficient mice ［J］.J Hepatol，2005，43(2) : 317-323.

［14］Yang C，Zeisberg M，Liveiy JC，et al.Integrin alpha1betal and alpha2betal are the key regulators of hepatocarcinoma cell invasion across the fibrotic matrix microenvironment［J］.Cancer Res，2003，63(23) : 8312-8317.

［15］張晶，宗春華，李定國，等.肝內(nèi)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)與大鼠肝纖維化的關(guān)系［J］.世界胃腸病學(xué)雜志，2002，10(4) : 397-400.

［16］Pereira RM，Dos Santos RA，Teixeira MM，et al.The renin-angiotensin system in a rat model of hepatic fibrosis: evidence for a protective role of Angiotensin-(1-7)［J］.J Hepatol，2007，46(4) : 674-681.

［17］Lubel JS，Herath CB，Tchongue J，et al.Angiotensin 1-7，an alternative metabolite of the renin angiotensin system，is up regulated in human liver disease and has antifibrotic activity in the bile duct ligated rat［J］.Clin Sci (Lond)，2009，117(11) : 375-386.

［18］Lubel JS，Herath CB，Tchongue J，et al.Angiotensin-(1-7)，an alternative metabolite of the renin-angiotensin system，is up-regulated in human liver disease and has antifibrotic activity in the bileduct-ligated rat［J］.Clin Sci(Lond)，2009，117(11) : 375-386.

Effects of local blockage of RAAS at different levels on expression of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in rats with hepatic fibrosis

ZHANG Xiao-mei1，JIAO Zhan-jiang，YIN Peng，DING Guo-shan，ZHOU Jie，CUI Zhong-lin，QIAN Jian-ping，ZENG De-hua
(1 PLA Institution of Organ Transplantation，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of local blockage of renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) on the degrees of fibrosis and to investigate its mechanism in liver tissues of experimental rats with hepatic fibrosis.Methods Fifty SD rats aged 6 weeks were randomly divided into five groups: the normal control group，model group，captopril group，losartan group and spironolactone group，with 10 rats in each group.In the normal control group，the rats received subcutaneous injection of olive oil，while other rats received subcutaneous injection of 40%CCL4to make the hepatic fibrosis models.The next day，rats of the three treatment groups were daily injected with captopril (captopril group)，losartan (losartan group) and spironolactone (spironolactone group).Rats in the control group and model group received the same amount of normal saline everyday.Rats in each group were sacrificed at 8 weeks.The liver tissues were obtained and stained by HE staining and Masson staining to observe the pathological changes.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the levels of ACE2，AngⅡand Ang 1-7 in the serum and liver tissues.Results The degree of liver fibrosis in the captopril group，losartan group and spironolactone group was significantly improved as compared with that of the model group; the levels of ACE2，AngⅡ，Ang 1-7 in the serum and liver tissue of the model group，captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher than those of the normal control group; the levels of ACE2 and Ang 1-7 in the captopril group，losartan group and spironolactone group were all higher，but the AngⅡlevel was lower than that of the model group (all P＜0.05).No statistically significant differences were found in the levels ofbook=15,ebook=20ACE2，AngⅡ，and Ang 1-7 between the losartan group，spironolactone group and captopril group.ConclusionThe local blockage of RAAS at different levels may all inhibit the liver fibrosis，whose mechanism may be related with the increase of ACE2 and Ang 1-7 and the decrease of AngⅡin the serum and liver tissues.

Key words:renin-angiotensin-aldosterone system; liver fibrosis; angiotensinⅡ; angiotensin 1-7

(收稿日期:2015-01-28)

通信作者簡介:焦占江(1981-)，男，主治醫(yī)師。研究方向為肝纖維化的臨床和基礎(chǔ)研究E-mail: zhanjiangjiao@ yeah.net

作者簡介:第一張曉梅(1984-)，女，住院醫(yī)師。研究方向為肝移植及肝纖維化的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail: 910195473@ qq.com

基金項目:廣東省自然科學(xué)基金資助項目(S2011010003901)。

文章編號:1002-266X(2015)18-0014-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號:R575

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.18.005