熒光碳點(diǎn)及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

趙菁，叢明宇，趙亮，王丹丹，常蓓，孫宏晨(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春130021)

熒光碳點(diǎn)及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

趙菁，叢明宇，趙亮，王丹丹，常蓓，孫宏晨
(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春130021)

摘要:熒光碳點(diǎn)是納米材料領(lǐng)域的新興材料，作為新興量子點(diǎn)具有生物相容性好、粒徑小、熒光穩(wěn)定無(wú)閃爍不漂白、易于修飾等獨(dú)特的理化特征，這些優(yōu)勢(shì)使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。目前關(guān)于熒光碳點(diǎn)的應(yīng)用主要集中在生物成像，熒光標(biāo)記、生物傳感器、藥物及基因載體等方面。本文綜述了熒光碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用基礎(chǔ)，包括其生物相容性、熒光性能、攝取機(jī)制，分析了碳點(diǎn)在上述各醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并討論了未來(lái)的研究?jī)?nèi)容和方向以及亟待研究的重要問(wèn)題。

關(guān)鍵詞:熒光碳點(diǎn);生物醫(yī)學(xué);生物成像;生物傳感器;納米載體

2004年，美國(guó)化學(xué)家Walter Scrivens在一次關(guān)于單壁碳納米管的實(shí)驗(yàn)中偶然得到了一種熒光納米材料，并命名為熒光碳點(diǎn)［1］。合成熒光碳點(diǎn)的原料非常廣泛，成本低廉，制備方式多樣。近年來(lái)，許多學(xué)者對(duì)熒光碳點(diǎn)的合成方法、生物學(xué)應(yīng)用展開(kāi)了大量研究，并取得了較大進(jìn)展。熒光碳點(diǎn)的粒徑為2～10 nm，具有多色熒光性能，由于其還具有上述易于制備、成本低廉等特征，并且水溶性好、表面官能團(tuán)豐富、易于修飾、生物相容性優(yōu)，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展前景十分廣闊?，F(xiàn)階段關(guān)于熒光碳點(diǎn)的研究主要集中在生物成像、生物傳感器、基因/藥物載體等方面。本研究對(duì)熒光碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀以及展望作一綜述。

1　熒光碳點(diǎn)的生物學(xué)性質(zhì)

1.1生物相容性從目前的研究成果來(lái)看，熒光碳點(diǎn)具有非常好的生物相容性。傳統(tǒng)的量子點(diǎn)含有金屬元素，對(duì)生物體的毒性較大，所以一般用于實(shí)驗(yàn)研究而不能作為臨床上體內(nèi)示蹤的試劑。而熒光碳點(diǎn)則毒性很低，在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究均有報(bào)道。有研究將熒光碳點(diǎn)和傳統(tǒng)量子點(diǎn)作用于MCF-7細(xì)胞和HT-29細(xì)胞，并通過(guò)增殖、凋亡率及存活率三方面對(duì)其毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果證明與量子點(diǎn)相比，熒光碳點(diǎn)具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)［2］。將碳點(diǎn)與細(xì)胞共孵育后，從形態(tài)學(xué)上看，未發(fā)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生改變［3］;在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，通過(guò)小鼠存活率、表現(xiàn)癥狀、體質(zhì)量變化、血生化檢測(cè)、病理學(xué)分析等多方面的評(píng)估，均未發(fā)現(xiàn)熒光碳點(diǎn)的任何毒性作用。為了監(jiān)測(cè)熒光碳點(diǎn)引起的免疫炎癥反應(yīng)，Unfried等［4］就碳點(diǎn)對(duì)免疫功能的影響作了研究，發(fā)現(xiàn)碳點(diǎn)能夠通過(guò)增加BALB/c鼠的CD+3和INF-γ分泌，減少CD+4/CD+8所占比例而減少Th1和Tc的反應(yīng);但這并不足以使其免疫器官發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變。雖然免疫學(xué)的評(píng)估需要進(jìn)一步完善，但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物活體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，由于熒光碳點(diǎn)粒徑小，可以及時(shí)地通過(guò)動(dòng)物腎臟排出體外。

1.2熒光性能近年來(lái)，雙光子成像材料，如量子點(diǎn)CdSe在體內(nèi)外成像研究中逐漸被應(yīng)用，該技術(shù)雖然在分辨率上有一定優(yōu)勢(shì)，且熒光穩(wěn)定無(wú)閃爍不漂白，但生物相容性較差。而熒光碳點(diǎn)不但具備這樣的性能而且具有更好的生物相容性［5］，因此隨著雙光子成像技術(shù)日漸廣泛地應(yīng)用于成像研究，基于熒光碳點(diǎn)的雙光子或多光子成像材料將更適于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用與研究［6］。實(shí)際上，目前熒光碳點(diǎn)的高效熒光性能在生物熒光標(biāo)記方面已得到一定的研究和應(yīng)用，并且將利于其進(jìn)行示蹤及對(duì)各種相關(guān)信號(hào)通路的研究。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)射量子產(chǎn)率隨著熒光碳點(diǎn)的尺寸而有所改變，尺寸減小，熒光效率得以提高，說(shuō)明熒光性能對(duì)粒徑有一定的依賴性，這一發(fā)現(xiàn)將有利于具有更佳性能的熒光碳點(diǎn)的研發(fā)［7］。另外，溶劑、pH等因素對(duì)熒光碳點(diǎn)的熒光性能也有重要影響［8］，提示在對(duì)熒光碳點(diǎn)的設(shè)計(jì)中應(yīng)充分、全面考慮上述因素。

1.3細(xì)胞對(duì)熒光碳點(diǎn)的攝取細(xì)胞對(duì)納米材料的攝取方式主要取決于如下三點(diǎn):①材料的物理化學(xué)

性能，如化學(xué)組成、尺寸、形狀等;②細(xì)胞因素，如細(xì)胞類型和分化狀態(tài);③體外實(shí)驗(yàn)微環(huán)境或細(xì)胞微環(huán)境等。值得注意的是，ROS的產(chǎn)生與細(xì)胞對(duì)一些納米顆粒的攝取有關(guān)，這解釋了納米顆粒細(xì)胞毒性的成因［4］。熒光碳點(diǎn)與細(xì)胞共孵育后，可見(jiàn)其主要聚集于細(xì)胞膜上及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，僅有少量進(jìn)入細(xì)胞核［9］。傳統(tǒng)的納米親水分子是以內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞膜，但是一些分子，如富勒烯、傳統(tǒng)量子點(diǎn)等由于其粒徑小可以通過(guò)滲透作用穿過(guò)細(xì)胞膜。Ruan等［10］的實(shí)驗(yàn)研究表明，熒光碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞的方式并非通過(guò)內(nèi)吞作用形成核內(nèi)體，在線粒體也未見(jiàn)明顯定位，這將更利于細(xì)胞對(duì)碳點(diǎn)的耐受，從而也表現(xiàn)出良好的生物相容性。

關(guān)于細(xì)胞對(duì)熒光碳點(diǎn)的攝取有很多影響因素，熒光碳點(diǎn)的濃度是很重要的一個(gè)方面。很多實(shí)驗(yàn)表明，隨著熒光碳點(diǎn)濃度的增加，細(xì)胞的攝取量也隨之增加;熒光碳點(diǎn)即使高達(dá)500 μg/mL也不會(huì)達(dá)到飽和狀態(tài)［10］。另外，熒光碳點(diǎn)被細(xì)胞攝取也受溫度的影響。Delehanty等［11］將熒光碳點(diǎn)水溶液作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，結(jié)果顯示，在37℃下，該細(xì)胞能夠被激發(fā)出明亮的熒光，然而在4℃下，并不能觀察到有意義的攝取行為。關(guān)于這一現(xiàn)象的具體原因尚未明確，有待進(jìn)一步探索。對(duì)于細(xì)胞對(duì)納米材料攝取的研究很廣泛，影響量子點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞的方式主要有三種:①鈍化材料(例如使用PEI、PPEI-EI等)，這主要與量子點(diǎn)的內(nèi)在理化性能相關(guān)。②用肽、蛋白質(zhì)等功能性分子或多聚物、藥物進(jìn)行表面修飾，以利于內(nèi)吞作用或增強(qiáng)與細(xì)胞間相互作用。③通過(guò)顯微注射或電穿孔法直接運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)。上述方法對(duì)干預(yù)熒光碳點(diǎn)這種新型量子點(diǎn)的攝取具有一定的指導(dǎo)意義。

2　熒光碳點(diǎn)在的生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1生物成像熒光碳點(diǎn)在生物醫(yī)學(xué)影像學(xué)和腫瘤診斷方面具有突出的優(yōu)勢(shì)和良好的發(fā)展前景。如前所述，熒光碳點(diǎn)表面具有很多官能團(tuán)，利于進(jìn)行表面修飾。若將熒光碳點(diǎn)與生物活性分子偶聯(lián)并特異性靶向某些細(xì)胞，在腫瘤的診斷治療、血管成像等方面將有一定的發(fā)展前景?，F(xiàn)普遍認(rèn)為人類許多腫瘤細(xì)胞都表現(xiàn)出葉酸受體的明顯上調(diào)，而在正常細(xì)胞中葉酸受體只有少量分布［12］。Song等［3］將4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺鈍化的熒光碳點(diǎn)與葉酸結(jié)合，利用熒光碳點(diǎn)的熒光特點(diǎn)可以將具有葉酸受體的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。Liu等［13］將葡萄糖與聚丙烯酸鈉合成了一種熒光碳點(diǎn)，并與葉酸溶液混合，作用于共培養(yǎng)的Hela和HEK-293細(xì)胞，通過(guò)共聚焦成像證實(shí)了該熒光碳點(diǎn)的靶向及示蹤性能。由此可見(jiàn)，雖然熒光碳點(diǎn)本身容易被細(xì)胞攝取，但是通過(guò)簡(jiǎn)單的鈍化步驟及表面基團(tuán)修飾或設(shè)計(jì)，可以使其被腫瘤細(xì)胞特異性攝取。這種主動(dòng)靶向行為，結(jié)合實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)這一被動(dòng)靶向更能夠起到靶向診斷和治療作用。關(guān)于碳點(diǎn)靶向腫瘤細(xì)胞并且成像的例子不勝枚舉，這一性能具有至關(guān)重要的診斷治療價(jià)值，尤其在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞難以區(qū)分時(shí)，在外科的術(shù)中切除及獲得腫瘤的實(shí)時(shí)信息方面具有非凡的臨床指導(dǎo)意義以及應(yīng)用價(jià)值。除此之外，在生物成像方面，熒光碳點(diǎn)以其獨(dú)特優(yōu)良的熒光性能得到了廣泛的應(yīng)用，例如通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光檢測(cè)體內(nèi)藥物的運(yùn)輸及分布。值得注意的是，量子點(diǎn)還可以用于標(biāo)記干細(xì)胞，觀察其分化、轉(zhuǎn)移、蛋白分布等［14］。

2.2作為生物傳感器利用熒光碳點(diǎn)可以檢測(cè)生物體內(nèi)各種生化物質(zhì)成分的變化過(guò)程，具有生物相容性好、簡(jiǎn)單易行、靈敏度高、背景干擾小、可檢測(cè)種類多等特點(diǎn)［15］。例如，用涂硼熒光碳點(diǎn)進(jìn)行葡萄糖水平的檢測(cè)，不但能夠達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，并且具有靈敏度高，干擾小的優(yōu)點(diǎn)［16］。再如，細(xì)胞內(nèi)銅離子穩(wěn)態(tài)的改變最終會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)退行性病變，生理和病理情況下的細(xì)胞內(nèi)的銅離子濃度有所不同，因此，對(duì)銅離子濃度的監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。有學(xué)者通過(guò)制備CQD-TPEA這一熒光碳點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)胞內(nèi)銅離子的監(jiān)測(cè)，并且具有較高特異性和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定性［17］。

2.3作為藥物/基因載體量子點(diǎn)藥物載體因能夠減少藥物的毒性、提高藥物效能、增加體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，靶向或控制藥物的釋放而逐漸取代病毒載體成為目前的研究焦點(diǎn)。熒光碳點(diǎn)，這一新興量子點(diǎn)，其表面一般因小尺寸效應(yīng)的存在，比表面積增加，表面可修飾官能團(tuán)豐富，可以共價(jià)修飾的方式作為藥物基因載體、控藥釋放以及實(shí)現(xiàn)監(jiān)測(cè)追蹤等功能，在疾病的診斷和治療中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［18］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)熒光碳點(diǎn)載抗腫瘤藥物的研究已取得一定進(jìn)展。有學(xué)者將多柔比星［19］、奧沙利鉑［20］等抗腫瘤制劑與碳點(diǎn)結(jié)合形成熒光碳點(diǎn)-抗腫瘤藥復(fù)合物，載藥效率可高達(dá)86%，該載藥碳點(diǎn)不但可以以監(jiān)測(cè)熒光的方式進(jìn)行追蹤，并且仍能保留原有的抗腫瘤細(xì)胞作用成為高效的藥物載體，提示了熒光碳點(diǎn)在抗腫瘤治療中的應(yīng)用前景，因此也提示了熒光碳點(diǎn)載藥和載基因應(yīng)用的可能性。除了共價(jià)修飾，也可以通過(guò)靜電吸引實(shí)現(xiàn)載藥:將帶負(fù)電的碳點(diǎn)與帶正電的介孔二氧化硅納米顆粒通過(guò)靜電引力結(jié)合而富于表面，設(shè)計(jì)成生理溫度下智能pH響應(yīng)的控釋系

統(tǒng)。介孔二氧化硅內(nèi)含藥物，在中性條件下被表面的熒光碳點(diǎn)封在二氧化硅內(nèi)部，在酸性條件下(利用腫瘤細(xì)胞具有外堿內(nèi)酸的特殊性)得以釋放，從而靶向發(fā)揮作用［21］。這也說(shuō)明熒光碳點(diǎn)在環(huán)境響應(yīng)性生物材料方面具有其一定的應(yīng)用前景。

熒光碳點(diǎn)在作為納米藥物載體方面具有卓越的優(yōu)越性，但是在作為DNA載體方面，由于熒光碳點(diǎn)與基因結(jié)合后在運(yùn)送過(guò)程中立即釋放使其應(yīng)用受到了限制。有學(xué)者在這一方面進(jìn)行了研究，用聚醚酰亞胺對(duì)熒光碳點(diǎn)進(jìn)行了表面鈍化使其功能化，發(fā)現(xiàn)聚醚酰亞胺接枝的熒光碳點(diǎn)可以在較低的質(zhì)量比下通過(guò)靜電吸引濃縮帶負(fù)電的DNA，而且能夠增強(qiáng)包裹的熒光碳點(diǎn)的熒光性能，這主要是因?yàn)槠浔砻娴木勖氧啺逢?yáng)離子聚合物層能夠介導(dǎo)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染。Wang等［22］用Alkyl-PEI2k對(duì)熒光碳點(diǎn)進(jìn)行鈍化處理，通過(guò)體內(nèi)外各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明其具有穩(wěn)定結(jié)合、保護(hù)、運(yùn)送質(zhì)粒DNA和siRNA的能力，成為極其具有前景的安全、高效、可監(jiān)測(cè)基因載體，值得注意的是該熒光碳點(diǎn)對(duì)19-23bp的siRNA運(yùn)載效果較差。

熒光碳點(diǎn)載體的可控釋放性能在抗菌藥物的使用上也具有應(yīng)用潛能。將熒光碳點(diǎn)與廣譜抗生素鹽酸環(huán)丙沙星共價(jià)結(jié)合獲得載藥碳點(diǎn)［23］，其結(jié)合率高于90%，抗生素在24 h內(nèi)于熒光碳點(diǎn)表面持續(xù)可控地釋放，且能很好地發(fā)揮抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌活性的作用。這一應(yīng)用策略對(duì)于應(yīng)對(duì)目前濫用抗生素使細(xì)菌耐藥的狀況有特殊意義。

2.4其他眾所周知，阿爾茲海默癥與Z-DNA具有密切的聯(lián)系，因此DNA的B-Z轉(zhuǎn)換在DNA納米技術(shù)中引起學(xué)者們的關(guān)注。研究表明，熒光碳點(diǎn)可以通過(guò)與DNA大溝結(jié)合減少B-DNA向Z-DNA的轉(zhuǎn)換，但這只是在體外環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有待進(jìn)一步的研究［24］。但這一發(fā)現(xiàn)無(wú)疑擴(kuò)展了碳點(diǎn)在DNA納米技術(shù)中的應(yīng)用范圍。

單純的熒光碳點(diǎn)(即不作為藥物或基因載體時(shí))對(duì)細(xì)胞的影響仍存在許多可能性，比如一些熒光碳點(diǎn)具有直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。例如，有學(xué)者從姜中提取出碳點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有特異性的殺傷作用，并與ROS的大量產(chǎn)生有關(guān)，而且得出其主要功能部分是其原料——姜黃素。有趣的是，該熒光碳點(diǎn)對(duì)另兩種腫瘤細(xì)胞A549(人肺腺癌細(xì)胞)和Hela(人宮頸癌細(xì)胞)并無(wú)明顯的殺傷作用，說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞具有高度選擇性［25］。Liu等［26］發(fā)現(xiàn)，由檸檬酸和RNase A微波法合成的熒光碳點(diǎn)能夠抑制并殺傷MGC-803細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞)，但具體機(jī)制尚未明確，可能與制備熒光碳點(diǎn)的原料有密切關(guān)系，有待進(jìn)一步探索，另外，值得注意的是該熒光碳點(diǎn)能夠進(jìn)入細(xì)胞核。

3　展望

隨著納米顆粒在組織工程學(xué)的蓬勃發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變納米顆粒的表面物理化學(xué)性能，能夠?qū)Ω杉?xì)胞的分化、衰老和病理性組織的更新和再生產(chǎn)生影響［27］。許多碳納米材料，如單壁或多壁的碳納米管材料已被證實(shí)具有促進(jìn)干細(xì)胞成骨分化從而促進(jìn)骨組織形成的作用［28］，因而可以推測(cè)熒光碳點(diǎn)作為碳納米材料可能具有同樣的功能。另外，已有研究表明，小尺寸的納米金顆粒水溶液可以通過(guò)與胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路并促進(jìn)干細(xì)胞的成骨向分化［29］。這一研究結(jié)果在納米材料的應(yīng)用方面有重要的提示意義，意味著納米材料本身，即在不作為載體的情況下，可以通過(guò)受體蛋白對(duì)細(xì)胞核產(chǎn)生作用，并進(jìn)一步產(chǎn)生促進(jìn)骨組織修復(fù)的作用，再次提示熒光碳點(diǎn)單獨(dú)應(yīng)用的可能性。值得注意的是，納米材料的理化性質(zhì)對(duì)其功能往往有著重要影響，包括濃度、大小、形狀、表面性能、表面電荷等［14］。當(dāng)然，制備原料的選擇也是至關(guān)重要的，這些因素在進(jìn)行碳點(diǎn)的選擇和修飾中都應(yīng)加以注意。

熒光碳點(diǎn)具有諸多優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)量子點(diǎn)相比，熒光碳點(diǎn)展現(xiàn)出的良好生物相容性，具有逐步取代傳統(tǒng)量子點(diǎn)的可能。但碳點(diǎn)也有一定的缺點(diǎn):①大多數(shù)熒光碳點(diǎn)的激發(fā)波長(zhǎng)處于紫外波段，紫外光對(duì)組織的穿透性差，將限制深層組織的光學(xué)成像，而且?guī)缀跛猩锝M織對(duì)于紫外光都會(huì)產(chǎn)生自發(fā)熒光，產(chǎn)生干擾。而近紅外光能夠深層穿透［30］，因此需要進(jìn)一步研制在近紅外光區(qū)發(fā)光的碳點(diǎn)。②關(guān)于熒光碳點(diǎn)的研究并不全面:比如上述關(guān)于碳點(diǎn)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響的研究少且范圍局限，只有對(duì)鼠的實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)結(jié)果并不能保證人類使用的安全性，而免疫系統(tǒng)作為人類的防御系統(tǒng)至關(guān)重要，因此熒光碳點(diǎn)對(duì)人體免疫學(xué)影響的研究應(yīng)當(dāng)引起注意。③在臨床應(yīng)用方面的研究較少，比如熒光碳點(diǎn)的有效給藥方式尚缺少文獻(xiàn)報(bào)道，這也是目前將其用于治療疾病亟待解決的問(wèn)題之一。另外，不同的給藥方式下碳點(diǎn)的血、尿清除速率不同，相關(guān)研究將為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。

熒光碳點(diǎn)作為新興的量子點(diǎn)依舊具有值得期待的開(kāi)發(fā)潛能，相信隨著不斷研究和發(fā)展，在不遠(yuǎn)的將來(lái)會(huì)對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:孫宏晨，E-mail: hcsun@mail.jlu.edu.cn

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81320108011，81271111)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)36-0089-04

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R943

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.36.036