大鼠BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中miR-128對(duì)Nkx2-5基因的調(diào)控作用

朱國(guó)偉，鞠延玲，高振宇(錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州121001)

大鼠BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中miR-128對(duì)Nkx2-5基因的調(diào)控作用

朱國(guó)偉，鞠延玲，高振宇
(錦州市中心醫(yī)院，遼寧錦州121001)

摘要:目的探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中miR-128對(duì)Nkx2-5基因的調(diào)控作用。方法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，應(yīng)用5-氮雜胞苷將其誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞，采用Real-time PCR法檢測(cè)誘導(dǎo)6、10、14、18、22d時(shí)miR-128、Nkx2-5基因的表達(dá)。用生物信息學(xué)方法對(duì)miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，顯示miR-128與Nkx2-5mRNA的3'UTR結(jié)合情況良好。提取心肌細(xì)胞總RNA，擴(kuò)增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段，構(gòu)建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO熒光素酶報(bào)告載體，雙熒光素酶檢測(cè)轉(zhuǎn)染Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO以及miR-128模擬物或?qū)φ誱iRNA的熒光強(qiáng)度，鑒定miR-128與Nkx2-5的靶向關(guān)系。結(jié)果將誘導(dǎo)6d的Nkx2-5和miR-128的表達(dá)量分別設(shè)為1，誘導(dǎo)10d的Nkx2-5表達(dá)量為4.33±1.32、22d為14.78±6.05，誘導(dǎo)10d的miR-128表達(dá)量為0.776 2±0.054 3、22d為0.197 6±0.083 6。miR-128與Nkx2-5的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r =－0.546，P =0.021)。相對(duì)于轉(zhuǎn)染對(duì)照miRNA(設(shè)定其熒光素酶活性為1)，轉(zhuǎn)染miR-128能使Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的熒光素酶表達(dá)下降為0.435 4±0.072 6。結(jié)論miR-128通過(guò)結(jié)合Nkx2-5mRNA 3'UTR抑制其表達(dá)，具有負(fù)性調(diào)控BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化過(guò)程中Nkx2-5表達(dá)的作用。

關(guān)鍵詞:微小核糖核酸; Nkx2-5基因;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;心肌樣細(xì)胞;大鼠

Regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells

ZHU Guo-wei，JU Yan-ling，GAO Zhen-yu
(Jinzhou Central Hospital，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To investigate the regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat bonemarrowmesenchymal stem cells(BMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.Methods BMSCs were isolated from bonemarrow and induced into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The expression ofmiR-128 and Nkx2-5 wasdetermined by real-time PCR for the induction of 6，10，14，18 and 22days.Thematching relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 gene were predicted by using bioinformaticsmethod which showed thatmiR-128 was well combined with 3'-untranslated region(3'UTR)of Nkx2-5mRNA.The total RNA of themyocardial cells was extracted.We amplified Nkx2-5mRNA 3 'UTR segment and constructed Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO luciferase reporter plasmid.Luciferase activities of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO，miR-128mimics or the controlmiRNA weredetected by using thedual-luciferase assay system.The targeted relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 were identified.Results If the expression ofmiR-128 and Nkx2-5 on the sixthday was arbitrarilydefined as 1，the expression of Nkx2-5mRNA on the tenthday was 4.33±1.32 and increased to 14.78±6.05 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 on the tenthday was 0.776 2±0.054 3 anddecreased to 0.197 6±0.083 6 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 was negatively correlated with Nkx2-5(r =－0.546，P = 0.021).ThemiR-128decreased the luciferase expression of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO to 0.435 4± 0.072 6as compared with that of the controlmiRNA(which wasdifined as 1).Conclusion ThemiR-128may inhibit the Nkx2-5 expression by combing with Nkx2-5mRNA 3'UTR，which negatively regulates the expression of Nkx2-5during the process of BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells.

Key words:microRNA; Nkx2-5 gene; bonemarrowmesenchymal stem cells; cardiomyocyte-like cells;rats

Nkx2-5基因是心肌細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中早期表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，于心肌細(xì)胞分化前已有表達(dá)，開(kāi)始見(jiàn)于心肌前體細(xì)胞并于心肌細(xì)胞分化階段持續(xù)表達(dá)，在胚胎和成體心肌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，是調(diào)控心肌細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子［1～3］。微小RNA(miRNA)是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛參與基因表達(dá)的調(diào)控，但miRNA參與心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的報(bào)道少見(jiàn)。2014年3月，我們應(yīng)用5-氮雜胞苷誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為心肌樣細(xì)胞，檢測(cè)分化過(guò)程中miR-128和Nkx2-5的表達(dá)，探討miR-128對(duì)Nkx2-5基因表達(dá)的調(diào)控作用。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡SD大鼠，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，體質(zhì)量80～120 g。LG-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購(gòu)于Hyclone公司，5-氮雜胞苷購(gòu)自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆cTnI和Nkx2-5抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞系購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)將大鼠脫頸處死，取出股骨和脛骨，反復(fù)沖出骨髓，接種到25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi); 于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d換液1次，待細(xì)胞達(dá)到80%融合后，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞傳代。取第3代細(xì)胞做誘導(dǎo)，培養(yǎng)基中加入10 μmol/L的5-氮雜胞苷培養(yǎng)24 h后，更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3周;倒置顯微鏡下觀察，顯示BMSCs均勻分布，呈梭形，誘導(dǎo)后細(xì)胞變細(xì)長(zhǎng)，形態(tài)規(guī)則，平行排列。采用免疫熒光法檢測(cè)cTnI和Nkx2-5蛋白的表達(dá)，光鏡下顯示細(xì)胞內(nèi)cTnI呈綠色熒光，Nkx2-5蛋白呈紅色熒光，二者均呈高表達(dá)。提示BMSCs向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

1.3miR-128、Nkx2-5表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR方法。取誘導(dǎo)6、10、14、18、22d的細(xì)胞，分別加入RNAiso for small RNA(TaKaRa)和RNAiso Plus提取總miRNA和總RNA;用RNase-free水稀釋為1 μg/μL，按照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;得到的cDNA樣品稀釋4倍，加入SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)和miR-122檢測(cè)引物或Nkx2-5檢測(cè)引物;以U6或GAPDH為內(nèi)參基因，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)，應(yīng)用軟件對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.4miR-128與Nkx2-5的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)采用靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda(http: / /www.microrna.org/)和TargetScan(http: / /www.targetscan.org/)對(duì)miR-128和Nkx2-5基因(NM_053651)的靶向匹配關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明miR-128與Nkx2-5mRNA的3' UTR結(jié)合情況良好。

1.5miR-128與Nkx2-5的靶向關(guān)系鑒定

1.5.1 Nkx2-5 3'UTR的克隆取誘導(dǎo)培養(yǎng)22d的心肌樣細(xì)胞，加入RNAiso Plus提取總RNA;反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用正向引物5'-CCGAGCTCCCAGGAGAAGGGCGAGA-3'和反向引物5'-GCTCTAGAGGTCCTGTTGGGTCCGT-3'擴(kuò)增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段;瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，克隆到pMD 18-T(TaKaRa)載體上測(cè)序。

1.5.2Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的構(gòu)建分別用SacⅠ和XbaⅠ雙酶切pmirGLO質(zhì)粒載體以及Nkx2-5 3'UTR，參照TaKaRadNA連接試劑盒說(shuō)明書(shū)，將Nkx2-5 3'UTR酶切片段與pmirGLO載體酶切片段相連;構(gòu)建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO熒光素酶報(bào)告載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中克隆擴(kuò)增;按照AxyPrep質(zhì)粒DNA小量試劑盒(Axygen)說(shuō)明書(shū)從菌液中提取重組質(zhì)粒，測(cè)序鑒定。

1.5.3雙熒光素酶檢測(cè)取NIH3T3細(xì)胞，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前1d，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日融合為90%～95%。對(duì)于每孔細(xì)胞，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO 200 ng以及miR-128模擬物或?qū)φ誱iRNA 30 nmol/L;轉(zhuǎn)染24 h后，按照Promega公司Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)兩組熒光強(qiáng)度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。結(jié)果以珋x±s表示，比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1miR-128、Nkx2-5表達(dá)將誘導(dǎo)6d的Nkx2-5 和miR-128的表達(dá)量分別設(shè)為1，誘導(dǎo)10d的Nkx2-5表達(dá)量為4.33±1.32、22d為14.78±6.05，誘導(dǎo)10d的miR-128表達(dá)量為0.776 2±0.054 3、22d 為0.197 6±0.083 6。相關(guān)性分析顯示，二者呈負(fù)相關(guān)(r =－0.546，P =0.021)。

2.2miR-128對(duì)Nkx2-5表達(dá)的調(diào)控作用雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照miRNA(設(shè)定其熒光素酶活性為1)，miR-128能使Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO的熒光素酶表達(dá)下降為0.435 4± 0.072 6。

3　討論

NK-2基因主要編碼轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠結(jié)合目的基因啟動(dòng)子的共有序列［T(C/T)AAGTG］，從而激活轉(zhuǎn)錄。Nkx2-5基因是NK型同源盒基因家族成

員之一，其蛋白產(chǎn)物為心肌前體細(xì)胞早期標(biāo)志物，在心肌細(xì)胞分化前就已經(jīng)表達(dá)，于分化過(guò)程中高表達(dá)，是心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子［4～6］。Lyons等［7］研究發(fā)現(xiàn)，敲除Nkx2-5基因的小鼠心臟發(fā)育出現(xiàn)異常。Schott等［8］發(fā)現(xiàn)，先天性心臟病患者中Nkx2-5基因發(fā)生突變，其類型主要是無(wú)義突變、RNA剪接信號(hào)突變以及閱讀框架異位突變等。雖然發(fā)育階段的脾、胃和甲狀腺組織有少量Nkx2-5蛋白表達(dá)，但出生后其表達(dá)水平顯著降低，而心肌中有顯著的特異性表達(dá)。表明Nkx2-5蛋白對(duì)多種器官發(fā)育有影響，但主要以對(duì)心肌的發(fā)育和分化作用為主［9］。本研究應(yīng)用5-氮雜胞苷將大鼠BMSCs誘導(dǎo)為心肌樣細(xì)胞，免疫熒光化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)有cTnI和Nkx2-5蛋白表達(dá)。

miRNA廣泛參與生命活動(dòng)過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控［10～13］，其中miR-128參與了細(xì)胞分化以及癌癥發(fā)生等過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控。Shi等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-128能夠靶向作用于成肌細(xì)胞分化過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子肌生成抑制蛋白，過(guò)表達(dá)miR-128能夠抑制小鼠成肌細(xì)胞系C2C12的增殖，卻促進(jìn)其分化為肌細(xì)胞。Huang等［15］應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中miR-128的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其較癌旁正常組織顯著降低，進(jìn)一步在肝癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)miR-128能夠靶向調(diào)控PI3KR1的表達(dá)，激活PI3K/ AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制癌細(xì)胞的增殖，推測(cè)其或可作為診斷肝細(xì)胞癌的標(biāo)志物。

本次研究運(yùn)用靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda和TargetScan對(duì)miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者匹配關(guān)系良好。隨后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-128能夠靶向作用于Nkx2-5 3'UTR并抑制其表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果表明隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，miR-128表達(dá)量逐漸降低，與Nkx2-5表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，提示miR-128參與了心肌樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過(guò)程。

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收稿日期:( 2015-05-11)

作者簡(jiǎn)介:第一朱國(guó)偉(1971-)，男，副主任醫(yī)師。研究方向?yàn)樾呐K的介入治療。E-mail: suifeng800sd@163.com

文章編號(hào):1002-266X(2015)34-0001-03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.001