正交法試驗優(yōu)選豨薟草的提取工藝

張磊 劉佳 于靜

豨薟草為菊科植物豨薟Siegebeckia orientalis L、腺梗豨薟Spubescens Makino或毛梗豨薟Sglabrescens Makino 3種植物的干燥地上部分，具有祛風濕、利關(guān)節(jié)、解毒的功效，常用于風濕痹痛、筋骨無力、腰膝酸軟、四肢麻痹、半身不遂、風疹濕瘡等癥［1］?；瘜W成分主要含萜和苷類等［2］，其中奇壬醇、豨薟精醇、豨薟苷在免疫調(diào)節(jié)、抗炎抗風濕、心血管系統(tǒng)、抗病原微生物、抗氧化及抗早孕方面有明顯活性［3］。目前，奇壬醇作為其定量檢測標準［4］。故本實驗擬以奇壬醇為指標，采用HPLC法測定，利用正交試驗設(shè)計，分別以70%、80%和90%乙醇為溶媒加熱回流提取，考察影響奇壬醇提取率的因素，篩選豨薟草的最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 美國Agilent-1100高效液相色譜儀系統(tǒng)(在線脫氣機，四元泵，自動進樣器，PDA檢測器);Agilent Chem Office色譜工作站。甲醇、乙腈為色譜純(國藥集團化學試劑有限公司)，水為滅菌注射用水(石家莊四藥有限公司，批號130925404)，其他試劑均為分析純。奇壬醇對照品(批號111726-200601)由中國生物制品檢定所提供。豨薟草購于國藥樂仁堂石家莊藥材公司，經(jīng)河北省藥品檢驗院段吉平主任藥師鑒定為豨薟草的全草。

1.2 方法

1.2.1 供式品溶液的制備:精密稱取豨薟草20.0 g置于500 ml圓底燒瓶中，加適量乙醇溶液提取，搖勻，稱定質(zhì)量，加熱回流提取40 min，取出，冷卻，用適量乙醇溶液補足質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，即得。

1.2.2 對照品溶液的制備:取奇壬醇對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成質(zhì)量濃度分為為0.24 mg/ml的溶液，即得。

1.2.3 色譜條件:色譜柱為 Kromasil WQ C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);甲醇-乙腈 － 0.05 mol/L KH2PO4溶液為流動相梯度洗脫，洗脫程序見表1;檢測波長215 nm;體積流量1 ml/min;柱溫30℃;進樣量10 μl。

表1 梯度洗脫程序表

1.2.4 線性關(guān)系:取奇壬醇對照品儲備液，稀釋使配制成奇壬醇為15～240 μg/ml的對照品溶液。吸取上述溶液10 μl，注入HPLC色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，經(jīng)回歸處理得回歸方程為，奇壬醇:Y=6.57X+9.50(R2=0.9999)。結(jié)果表明奇壬醇在 0.15 ～2.4 μg呈良好的線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計因素與水平 以奇壬醇的提取量為指標，選用L9(34)正交試驗表，對提取次數(shù)、提取時間、提取溶媒和溶媒用量進行考察。取豨薟草20 g，按L9(34)正交試驗表設(shè)計分別進行提取，所得的提取液經(jīng)合并、濾過，濃縮至一定體積，作為1～9號樣品。取1～9號樣品，制備供試品溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測定色譜峰的峰面積，計算樣品中奇壬醇的提取率(奇壬醇提取率=樣品中奇壬醇總量/投入藥材中豨薟草總量×100%)。見表4。

表2 因素水平

表3 L9(34)試驗安排和結(jié)果

表4 方差分析表

2.2 提取工藝優(yōu)選 可知在上述4個因素中，對奇壬醇提取率的影響程度依次為:D＞B＞C＞A。據(jù)測定結(jié)果并考慮省時節(jié)能、降低成本的角度，優(yōu)選出最佳提取工藝為A2B3C2D3，即80%乙醇回流提取3次，每次40 min，12 倍溶媒。

2.3 驗證試驗

2.3.1 精密度試驗:取豨薟草藥材適量，精密稱定，制備供試品溶液，吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，按確定的色譜條件記錄峰面積，奇壬醇質(zhì)量分數(shù)的RSD 0.6%。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗:取豨薟草藥材適量，精密稱定，制備供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12、24 h，吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，奇壬醇質(zhì)量分數(shù)的 RSD為1.0%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗:取豨薟草藥材適量，精密稱定6份，制備供試品溶液，分別吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，奇壬醇質(zhì)量分數(shù)的RSD為1.7%。

2.3.4 回收率試驗:取豨薟草藥材約10.0 g，共6份，精密稱定，精密量取奇壬醇對照品溶液1 ml(約相當于豨薟草藥材含奇壬醇的50%)，依次加入上述6份藥材中，制備供試品溶液，分別吸取10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，奇壬醇的平均回收率為99.18%，RSD 為 0.9%。

3 討論

2005年版《中國藥典》收載豨薟草的質(zhì)量控制指標成分為奇壬醇，因為奇壬醇為3種藥用豨薟草原植物的共有成分，專屬性強且為主要的活性成分。有文獻證實用HPLC法測定豨薟草中奇壬醇的含量簡便易行、準確、重復性好［5，6］。但未有文獻考察不同提取工藝對奇壬醇提取率的影響。故本實驗以奇壬醇為指標，采用HPLC法測定，利用正交試驗設(shè)計，考察影響奇壬醇提取率的因素，篩選豨薟草的最佳提取工藝條件。

歷代本草對豨薟草的毒性考證為“有小毒”，但有文獻研究豨薟草水煎醇沉劑毒性較小，其半數(shù)致死量LD50測定相當于生藥414.3 g/kg，與水煎劑的LD50則相當于生藥146.7 g/kg相比，表明水煎醇沉劑的LD50劑量大于水煎劑，即水煎醇沉劑較水煎劑毒性減小［7］。該小組學者繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)毒性成分主要存在于極性大的溶劑中，而其有效成分存在于極性小的溶劑中［8］。故本實驗直接采用乙醇為溶媒對豨薟草進行提取，并從溶媒濃度、溶媒用量/倍、提取時間、提取次數(shù)四個方面考察。

本實驗通過正交試驗表設(shè)計分別進行提取，并進行方差分析得出結(jié)論4個因素對奇壬醇提取率的影響程度依次為提取次數(shù)＞提取時間＞溶媒用量＞提取溶媒，綜合結(jié)果表明豨薟草采用80%乙醇回流提取3次，每次40 min，12倍量溶媒為最佳工藝。經(jīng)方法學考察試驗表明，本方法的線性好，精密度高，重現(xiàn)性及回收率均較好，測得結(jié)果準確。

1 張超，吳素香，樓招歡，等.豨薟草化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展.安徽醫(yī)藥，2011，15:274-276.

2 程志紅，侴桂新，王錚濤.豨薟草的質(zhì)量標準研究.中國中藥雜志，2005，30:257-259.

3 侴桂新，金若敏，王錚濤，等.豨薟草抗血栓有效組分成分分析.中藥材，2006，29:235-237.

4 國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典.第1部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.345.

5 劉贊，侴桂新，王錚濤.高效液相色譜法測定酒豨薟草中奇壬醇的含量.中國中藥雜志，2010，35:729-731.

6 許鳳清，劉金旗，王舉濤，等.高效液相色譜法同時測定豨薟草中豨薟苷和奇壬醇.中成藥，2011，33:1444-1446.

7 關(guān)建紅，薛征，任晉斌.豨薟草水煎醇沉劑口服小鼠急性毒性.中國中藥雜志，2005，30:1712-1713.

8 關(guān)建紅，裴香萍，劉秉成.豨薟草不同提取部位毒性比較研究.山西中醫(yī)學院學報，2009，10:15-16.