Rho/ROCK通路在脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生中的研究進(jìn)展

丁李立強(qiáng)，何興偉，閔友江

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006）

·綜 述·

Rho/ROCK通路在脊髓損傷后神經(jīng)軸突再生中的研究進(jìn)展

丁李立強(qiáng)1，何興偉2，閔友江2

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006）

通過(guò)介紹Rho/ROCK信號(hào)通路的相關(guān)概念及其對(duì)神經(jīng)軸突再生的影響和作用機(jī)制，為研究通過(guò)抑制此信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)神經(jīng)的再生及功能的恢復(fù)，從而進(jìn)一步為臨床治療神經(jīng)損傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。

Rho/ROCK；脊髓損傷；神經(jīng)再生；針灸療法

Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出來(lái)的蛋白，它們是一組相對(duì)分子質(zhì)量大約為20～30 kd的三磷酸鳥(niǎo)苷（guanosine t riphosphate，GTP）結(jié)合蛋白，又稱小分子量G蛋白，因具有GTP酶活性，習(xí)慣被稱為Rho GTP酶（Rho GTPases）。Rho族蛋白最主要的功能是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的重組，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化和運(yùn)動(dòng)，Rho可以通過(guò)其下游效應(yīng)因子Rho激酶（ROCK或 Rho-kinase）調(diào)節(jié)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組。有研究表明［1-2］，Rho蛋白及其相關(guān)的信號(hào)分子通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，在軸突導(dǎo)向的信號(hào)通路中發(fā)揮了重要的作用。在脊髓損傷之后，Rho/ROCK信號(hào)通路受到神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子作用的影響，而抑制神經(jīng)軸突的再生。本文就Rho/ROCK信號(hào)通路及其對(duì)軸突導(dǎo)向和再生的作用做一綜述。

1 Rho/ROCK信號(hào)通路的基本概念

Rho/ROCK信號(hào)通路的關(guān)鍵分子包括Rho、Rho激酶（ROCK）和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）。Rho是小分子量GTPases超家族Rho亞家族成員，到目前為止已發(fā)現(xiàn) 4個(gè)亞家族共 18個(gè)成員，Rho亞家族分子量約為20～30 kd，根據(jù)其序列和功能的不同可分為Rho、Rac和Cdc42亞家族以及不具備GTPase活性的Rho亞家族，各成員間有 50%～55%的同源性。其中哺乳動(dòng)物的 Rho家族蛋白至少包括 Rho（RhoA、RhoB、RhoC），Rac（Rac1、Rac2、Rac3、RacG），Cdc42（Cdc42H、G25K、TC10），Rnd、RhoD和TTF等。其中研究最多的是Rho、Rac和Cdc42［3］。這些蛋白最主要的功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和肌動(dòng)蛋白重組，其他功能包括調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期和膜泡運(yùn)輸?shù)取?/p>

Rho蛋白以活化的Rho-GTP形式和非活化的Rho-GDP形式兩種狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中［4］。Rho受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，鳥(niǎo)苷酸交換因子（GEFs）為 Rho激活劑；GTP酶激活蛋白（GAPs）和GDP解離抑制因子（GDIs）為Rho滅活劑。即Rho-GEF能夠使Rho釋放GDP并結(jié)合GTP；而Rho-GAP卻催化GTP的水解使Rho蛋白失活；且Rho GDI可與失活狀態(tài)的Rho族蛋白（Rho-GDP）結(jié)合，使其穩(wěn)定在失活狀態(tài)而不能被Rho-GEF活化。在上述分子的調(diào)節(jié)作用下使 Rho完成兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，以實(shí)現(xiàn)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的“分子開(kāi)關(guān)”作用。

Rho激酶（ROCK）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，以兩種同源性極高的異構(gòu)體存在：ROCKα /ROCKⅠ和ROCKβ/ROCKⅡ，是目前研究最為清楚的Rho下游效應(yīng)分子。ROCKⅠ主要分布于非神經(jīng)元的組織，ROCKⅡ則主要分布于大腦、心臟和肌肉。Rho激酶的分子結(jié)構(gòu)包括氨基端的催化結(jié)構(gòu)域、中間結(jié)合Rho的α卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和羧基端的催化結(jié)構(gòu)域以及 Cys/ His區(qū)。Rho能與Rho激酶的α卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活Rho激酶［5］。Rho激酶被激活后能夠使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，使得肌球蛋白磷酸化程度增高［6］，從而影響肌動(dòng)-球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐的塌陷，抑制軸突生長(zhǎng)［7］。

肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin l ight chain phosphatase，MLCP）為 Rho激酶（ROCK）的底物。MLCP的空間結(jié)構(gòu)是由3個(gè)亞單位組成，分別為分子量為38 kDa的1型磷酸酶催化亞單位（PPIc），20 kDa功能不明的亞單位（M20）以及130 kDa的肌球蛋白磷酸酶靶標(biāo)亞單位（myosin phosphatase target subunit，MYPT）。研究發(fā)現(xiàn)MYPT家族包括MYPT1、MYPT2、MBS85、MYPT3 和TIMAP［8］。Feng J等［9］研究證實(shí)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路主要通過(guò)磷酸化MYPT1第695位和第850位蘇氨酸來(lái)抑制MLCP的活性。因此，ROCK使MLCP發(fā)生磷酸化，磷酸化的肌球蛋白輕鏈磷酸酶失活后不能將磷酸化的MLC的磷酸基團(tuán)水解，從而使MLC持續(xù)保持磷酸化的狀態(tài)，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的崩解［10］。

2 Rho/ROCK信號(hào)通路與軸突導(dǎo)向及生長(zhǎng)過(guò)程的研究

軸突生長(zhǎng)主要發(fā)生在生長(zhǎng)錐內(nèi)，實(shí)驗(yàn)研究表明，神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、延長(zhǎng)與分枝是細(xì)胞骨架介導(dǎo)的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)性、組裝與轉(zhuǎn)運(yùn)是軸突生長(zhǎng)的分子基礎(chǔ)［11］，調(diào)控生長(zhǎng)錐內(nèi)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)性是調(diào)控軸突生長(zhǎng)的關(guān)鍵［12-13］，無(wú)論哪一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑要實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的影響，最終都是通過(guò)作用于生長(zhǎng)錐細(xì)胞骨架來(lái)實(shí)現(xiàn)的［14］。

生長(zhǎng)錐是位于軸突遠(yuǎn)端的膨大，具有高度的結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)性，按結(jié)構(gòu)與功能的不同分為3部分，P區(qū)（周圍區(qū)）是生長(zhǎng)錐邊緣部分，為扇形膨大的板狀偽足（主要為肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)），其表面伸出許多細(xì)小的絲狀偽足（主要為肌動(dòng)蛋白束），通過(guò)肌動(dòng)蛋白的聚合和解聚以及形成的逆流不斷伸長(zhǎng)和回縮，改變生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)行為。C區(qū)（中央?yún)^(qū)）位于生長(zhǎng)錐的基部，軸突末端相對(duì)膨大、變厚的區(qū)域，主要細(xì)胞骨架是動(dòng)態(tài)性的微管，肌動(dòng)蛋白絲在該區(qū)逐漸減少或消失。其大小與軸突的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，快速生長(zhǎng)的軸突較細(xì)，靜止期則較粗大。過(guò)渡帶位于C區(qū)和P區(qū)之間，大量的分子馬達(dá)位于此區(qū)，使肌動(dòng)蛋白收縮形成肌動(dòng)蛋白弧，與P區(qū)肌動(dòng)蛋白“逆流”協(xié)同阻止微管伸入P區(qū)［15］。

生長(zhǎng)錐中的細(xì)胞骨架成分主要包括微管（microtubule）、微絲（actin f i lament，F(xiàn)-actin）和肌球蛋白（myosin）等。微管是由微管蛋白（tubulin）聚合而成，通常只延伸到生長(zhǎng)錐的基部，也有少量進(jìn)入生長(zhǎng)錐。微絲是由肌動(dòng)蛋白單體（G-actin）聚合成的纖維（F-actin），呈束狀分布在絲狀偽足（f i lapodia）中，而呈網(wǎng)狀有序地分布在片狀偽足（lamel l ipodia）中。肌球蛋白通常與肌動(dòng)蛋白結(jié)合成束形成張力纖維絲（st ress f iber）。張力纖維一端終止于局部粘聯(lián)復(fù)合物（focal adhesion complex），另一端連接到微管束。

軸突生長(zhǎng)的驅(qū)動(dòng)始于軸突生長(zhǎng)錐中肌動(dòng)蛋白不斷的聚集和解聚，在生長(zhǎng)錐形態(tài)發(fā)生改變之前，肌動(dòng)蛋白骨架就不斷地發(fā)生著聚集和解聚的改變使板狀偽足和絲狀偽足不斷地伸縮，在復(fù)雜的環(huán)境中驅(qū)動(dòng)軸突沿特定的方向向前延伸，生長(zhǎng)錐在遇到導(dǎo)向性信號(hào)時(shí)會(huì)沿著特定的方向生長(zhǎng)，當(dāng)軸突生長(zhǎng)錐探測(cè)到方向性的信號(hào)時(shí)，生長(zhǎng)錐內(nèi)的actin成分發(fā)生不對(duì)稱聚合，絲狀偽足及片狀偽足向一側(cè)優(yōu)先延伸，而另一側(cè)趨向于回縮；進(jìn)而軸突內(nèi)微管也可以主動(dòng)或被動(dòng)地朝同側(cè)延伸，使生長(zhǎng)方向進(jìn)一步穩(wěn)定下來(lái)；肌球蛋白在這個(gè)過(guò)程中通過(guò)其收縮引起絲狀偽足的回縮，發(fā)揮負(fù)調(diào)控的作用［16］。

生長(zhǎng)錐對(duì)周圍環(huán)境極其敏感，其表面受體可識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)中或周圍細(xì)胞上的導(dǎo)向分子，這些導(dǎo)向分子中有的能夠吸引生長(zhǎng)錐向其生長(zhǎng)，有的卻是排斥生長(zhǎng)錐向其生長(zhǎng)，各種導(dǎo)向因子的信號(hào)最終通過(guò)Rho GTP酶調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)錐中的細(xì)胞骨架成分的重組，Rho及其相關(guān)分子在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程，軸突生長(zhǎng)、分化、延伸及突觸的形成過(guò)程中起重要作用［17］。

在 Rho GTPase家族中，目前了解最清楚的有Cdc42、Rac和RhoA 3種。Cdc42和Rac能夠通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和穩(wěn)定，激活的 Rac調(diào)節(jié)細(xì)胞周邊肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)絡(luò)的組裝，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的聚合，介導(dǎo)板狀偽足與膜泡的形成；激活的 Cdc42促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚，調(diào)節(jié)微管的組裝與動(dòng)態(tài)性，介導(dǎo)絲狀偽足的形成［18］；而RhoA能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)張力纖維引起生長(zhǎng)錐的塌陷（col lapse）和回縮（ret raction）［19］。己知最重要的對(duì)生長(zhǎng)錐具有調(diào)節(jié)作用的 RhoA的下游分子是Rho-kinasa/ROCK［20］。離體實(shí)驗(yàn)中使用ROCK的特異抑制劑證明 ROCK對(duì)生長(zhǎng)錐的活動(dòng)性具有負(fù)的調(diào)控作用［21］。ROCK磷酸化抑制myosin輕鏈脂酶（MLCP），以及直接磷酸化 myosinⅡ輕鏈本身［22］，這些都導(dǎo)致肌球蛋白的收縮性增加，從而引起生長(zhǎng)錐的回縮及塌陷［23］。

3 Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)損傷后軸突再生的影響

相關(guān)研究表明，腦脊髓損傷及其鄰近結(jié)構(gòu)、疤痕組織及 CNS髓磷脂上存在大量的神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，可以抑制軸突再生［24］，當(dāng)生長(zhǎng)錐接觸到髓鞘中的抑制因子后，其細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)就會(huì)發(fā)生變化，繼而引起生長(zhǎng)錐塌陷、回縮，軸突生長(zhǎng)停止。其主要包括3種來(lái)源于髓鞘的抑制蛋白：髓鞘相關(guān)糖蛋白（MAG）［25］、Nogo［26］和少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白（OMGP）［27］。而這些抑制因子均可通過(guò)其共同膜受體NgR受體/p75NTR復(fù)合體激活細(xì)胞內(nèi) Rho信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，引起肌動(dòng)蛋白骨架的重組和軸突生長(zhǎng)錐的塌陷，從而阻斷軸突再生過(guò)程［28］。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外環(huán)境中的許多導(dǎo)向信息分子如溶血磷脂酸（LPA）、凝血酶受體激活蛋白（TRP）、激活后的前列腺素E受體EP3B等均可激活Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起生長(zhǎng)錐塌陷［29］。由于神經(jīng)生長(zhǎng)錐的崩解、球莖回縮、神經(jīng)突退縮，使神經(jīng)生長(zhǎng)不可逆性停止。Conrad S等［30］和Erschbamer MK等［31］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明盡管在正常脊髓中有RhoA mRNA量低水平表達(dá)，但脊髓損傷后8hRhoAmRNA的表達(dá)明顯升高，3 d后達(dá)高峰，并持續(xù)高表達(dá)4周之久。

在體脊髓損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在損傷區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞突起處存在大量活化的 RhoA，從而激活 ROCK，研究表明阻斷RhoA和ROCK均可以促進(jìn)軸突生長(zhǎng)［32］。Monnier PP等［33］發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)Y-27632不僅可以抑制ROCK活性，還可以阻斷硫酸軟骨素蛋白多糖的作用。Y- 27632作為ROCK的主要抑制劑，對(duì)各種原因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷均具有保護(hù)作用，可增加神經(jīng)元細(xì)胞的存活和神經(jīng)突起的延長(zhǎng)［34］。大鼠SCI后鞘內(nèi)注射Y-27632，可以觀察到背側(cè)脊髓軸突生長(zhǎng)，且大鼠后肢功能可以得到明顯改善［35］。Lingor P等［36］發(fā)現(xiàn)Y-27632與CNTF（另一種 ROCK抑制劑）聯(lián)合使用更有利于神經(jīng)突起的生長(zhǎng)和再生，并有望用于臨床治療各種神經(jīng)損傷及退行性病變。在使用Rho或者Rock的抑制劑后，如P21，Y27632，fasudi l等，都觀察到這些抑制劑可以促進(jìn)軸突的再生［37］。以上研究表明，細(xì)胞內(nèi)Rho/ROCK通路在介導(dǎo)抑制性信號(hào)阻斷軸突再生的抑制過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

4 針灸作用于Rho/ROCK信號(hào)通路的研究進(jìn)展

目前有關(guān)針灸作用于Rho信號(hào)通路方面的研究尚不多見(jiàn)，譚峰等［38］研究觀察電針對(duì)腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死頸髓 Rho-A表達(dá)的影響，結(jié)果顯示電針組頸髓 Rho-A表達(dá)較腦梗死組明顯降低，提示電針具有抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的作用，其促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用可能與此有關(guān)。李鳳等［39］研究觀察大鼠局灶性腦梗死后大腦皮質(zhì)Rho-A和ROCK的表達(dá)以及電針刺激對(duì)其表達(dá)的影響，結(jié)果顯示電針組中Rho-A和ROCK蛋白表達(dá)較模型組減少，說(shuō)明電針抑制梗死區(qū)周圍抑制因子Rho-A和ROCK的表達(dá)，提示電針刺激對(duì)局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的改善作用可能與其有關(guān)。以上有關(guān)電針與 Rho/ROCK信號(hào)通路等研究顯示電針能夠降低神經(jīng)系統(tǒng)損傷后Rho-A和ROCK蛋白表達(dá)，表明電針具有抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的作用，其促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)受損后功能的恢復(fù)可能與此機(jī)制有密切的關(guān)系。

5 總結(jié)

綜上所述，Rho族蛋白通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，在神經(jīng)軸突的導(dǎo)向及生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要的作用，而其中Rho/ROCK信號(hào)通路則是負(fù)調(diào)控生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)。在脊髓損傷后產(chǎn)生的各種神經(jīng)生長(zhǎng)抑制分子通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)傳遞途徑共同作用于Rho/ROCK信號(hào)通路，引起細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架的重組影響軸突再生，不利于脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。相關(guān)研究表明通過(guò)使用Rho激酶抑制劑等手段能夠抑制此信號(hào)通路，從而促進(jìn)神經(jīng)的再生及功能的恢復(fù)。目前針灸在神經(jīng)功能的修復(fù)方面取得了比較好的療效。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度對(duì)于針灸的作用機(jī)制也進(jìn)行了大量的研究，但針灸對(duì)于 Rho/ROCK信號(hào)通路作用的研究尚屬罕見(jiàn)，對(duì)于針灸的作用機(jī)制的研究還有相當(dāng)大的探索空間。研究針灸對(duì)于 Rho/ ROCK信號(hào)通路的影響及作用機(jī)制，對(duì)Rho/ROCK信號(hào)通路的機(jī)理和針灸干預(yù) Rho/ROCK信號(hào)通路的作用進(jìn)行更深入探討，將為臨床治療神經(jīng)損傷及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供幫助，也為針灸治療提供更多的理論依據(jù)。

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Advances in the Study of Rho/Rock Pathway in Axonal Regeneration After Spinal Cord Injury

DINGLI Li-qiang1, HE Xing-wei2, MIN You-jiang2.
1.J iangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China; 2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Nanchang 330006,China

This article presents concepts related to Rho/ROCK signal pathway, and its effect on axonal regeneration and the mechanism of its action to provide a theoretical basis for the inhibition of this signal pathway to promote neural regeneration and functional recovery and further for clinical treatment of nerve injuries and other nervous system diseases.

Rho/ROCK; Spinal cord injury; Neural regeneration; Acupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.12.1246

1005-0957（2015）12-1246-04

2015-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360562）

丁李立強(qiáng)（1991 - ），男，2012級(jí)碩士生，Emai l：491844285@qq. com

閔友江（1975 - ），男，副主任醫(yī)師，博士，Email：myj2002@126. com