牛大腸桿菌病的病原學(xué)檢疫

谷作霖

(黑龍江省密山市畜牧獸醫(yī)局動(dòng)物檢疫站,黑龍江密山 158300)

牛大腸桿菌病的病原學(xué)檢疫

谷作霖

(黑龍江省密山市畜牧獸醫(yī)局動(dòng)物檢疫站,黑龍江密山 158300)

大腸桿菌主要寄居于人和動(dòng)物的腸道內(nèi),在自然界分布廣泛,屬于條件致病菌。大腸桿菌能通過(guò)消化道使人類(lèi)和畜禽發(fā)生感染和中毒。對(duì)大腸桿菌病的防治和流行病學(xué)調(diào)查都依賴(lài)于對(duì)病原的及時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)和鑒定。

大腸桿菌病;病原學(xué)檢疫

1 病料采集和處理

為了分離到病原性大腸桿菌，應(yīng)于急性期采集病料，可采集糞便、血液、分泌物；病牛各種臟器如心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等病料，用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。可對(duì)分離培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌染色鏡檢檢查。

2 細(xì)菌分離

將采集的病料樣品作畫(huà)線(xiàn)培養(yǎng)，接種于普通瓊脂平皿，麥康凱培養(yǎng)基、遠(yuǎn)藤氏瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂平皿上，于37℃培養(yǎng)24h。大腸桿菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，可形成光滑型菌落（S），直徑2～3mm，表面光滑，微隆起，濕潤(rùn)，半透明帶淡灰色菌落易分散于鹽水中。也可形成粗糙型菌落（R），菌落較大，干燥，表面粗糙，邊緣不整齊，在生理鹽水中容易發(fā)生自凝集。此外，還有一種黏液型菌落，這種型菌落常見(jiàn)于有莢膜的菌株，在培養(yǎng)基中含有糖類(lèi)或在室溫中放置易出現(xiàn)黏液型菌落。在麥康凱和遠(yuǎn)藤氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，可形成紅色菌落，是由于大腸桿菌能分解乳糖所致。某些大腸桿菌菌株在血液瓊脂平皿上可出現(xiàn)β溶血環(huán)。

3 細(xì)菌學(xué)檢查

挑取上述菌落涂片、染色、鏡檢，如菌體為革蘭氏陰性，卵圓形或桿狀，大小為1～3μm×0.4～0.7μm，單獨(dú)或成雙存在，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，大多數(shù)能運(yùn)動(dòng)，具周身鞭毛，則可初步確診；多數(shù)菌株在適宜培養(yǎng)條件下可以出現(xiàn)菌毛，菌毛是取得營(yíng)養(yǎng)、傳遞質(zhì)粒的通道，也是噬菌體接觸的地方，還能使某些動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集。這種凝集性能有的菌株常因甘露糖存在而不出現(xiàn)，稱(chēng)為甘露糖敏感株，簡(jiǎn)稱(chēng)為MS株；另一些菌株稱(chēng)之為甘露糖抵抗株，簡(jiǎn)稱(chēng)為MR株，即有甘露糖時(shí)仍照樣凝集。

4 生化特性

大腸桿菌對(duì)氧化酶試驗(yàn)陰性，不利用檸檬酸鹽，通常利用醋酸鹽作為碳原。還原硝酸鹽，產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫。MR試驗(yàn)陽(yáng)性，VP試驗(yàn)陰性，不液化明膠，不分解尿素；所有菌株能分解葡萄糖、甘露醇、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，70%～90%菌株分解蔗糖、乳糖、衛(wèi)矛醇、水楊苷、山梨醇、阿拉伯膠糖、棉籽糖、鼠李糖、麥芽糖、木糖和蕈糖。

5 分離培養(yǎng)物的鑒定

經(jīng)選擇性培養(yǎng)基（麥康凱、遠(yuǎn)藤、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基）從病牛體內(nèi)分離培養(yǎng)獲得的特征性大腸桿菌菌落，未必都是病原菌。所以需對(duì)分離的菌落進(jìn)行生化特性試驗(yàn)、病原性鑒定（腸毒素測(cè)定，黏附素測(cè)定，回歸動(dòng)物試驗(yàn)）以及最后作血清學(xué)定型試驗(yàn)。

5.1 大腸桿菌熱敏腸毒素（LT）的檢測(cè)

（1）熱敏腸毒素的制備：將被檢大腸桿菌接種到1ml的Ca-YE-I培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18h后，將此1ml培養(yǎng)物加入到盛有15ml同樣培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，仍置37℃培養(yǎng)18h后取出，加入1%硫柳汞0.15ml，其硫柳汞的終濃度為萬(wàn)分之一，冰箱中過(guò)夜殺菌，次日以3500轉(zhuǎn)/min離心20min，取上清液，供熱敏感腸毒素試驗(yàn)用，此液應(yīng)新鮮制備，在冰箱中保存不宜超過(guò)3d。

（2）熱敏感腸毒素的檢測(cè)

A.兔皮膚藍(lán)斑試驗(yàn)。將成年健康家兔的背部剃毛，或在背部剪毛后涂以脫毛劑（硫化鈉8g、淀粉7g，白糖4g，甘油5g，硼砂1g，水75ml混勻）5min后用溫水洗凈，該部即脫毛。將無(wú)毛皮膚區(qū)分成15mm見(jiàn)方的小格，在小格的中央皮內(nèi)注射檢測(cè)的濾液0.1ml，每一被檢液作一個(gè)重復(fù)；在鄰近另一方格中央皮內(nèi)注射未接種細(xì)菌的CaYE-I培養(yǎng)基0.lml作為培養(yǎng)基對(duì)照；另取加熱（56℃10min）的被檢濾液接種到另一方格，作為毒素?zé)崦魧?duì)照。24h后向試驗(yàn)兔耳靜脈注射1%伊文思藍(lán)生理鹽水液4ml，6h后觀察至24h為止。藍(lán)斑直徑大于7mm以上者為陽(yáng)性，培養(yǎng)基對(duì)照及毒素?zé)崦魧?duì)照，均應(yīng)為陰性。

B.乳兔口服試驗(yàn)。用7～9日齡乳兔，每克體重口服被檢熱敏毒素0.05ml（用細(xì)、圓頭塑料管插入食道投入），5h后將乳兔麻醉死亡，剖檢，并稱(chēng)腸道重（X）與剩余體重（Y），當(dāng)X：Y≥0.085為陽(yáng)性，因熱敏毒素能引起腸道炎癥、水腫；如X：Y≤0.074為陰性；比值介于0.073～0.084為可疑。

C.兔回腸結(jié)扎試驗(yàn)。取體重2kg以上的健兔，給水不喂食物饑餓2d。以外科手術(shù)切開(kāi)腹壁，自盲腸游離端處的回腸開(kāi)始，沿向心方向結(jié)扎，每結(jié)扎8～10cm一段，間隔3～5cm，再結(jié)扎8～10cm一段，間隔3～5cm，又結(jié)扎8～10cm一段……。向其中一段腸腔注射被檢熱敏腸毒素1ml，向另一段腸腔注射1ml培養(yǎng)基作為對(duì)照。注射完后縫合，給飲水不給食物饑餓12h后，將兔撲殺，測(cè)結(jié)扎腸段內(nèi)的液體量（ml）與結(jié)扎腸道長(zhǎng)度（cm）的比，ml：cm＞l者為陽(yáng)性，培養(yǎng)基對(duì)照段的比值應(yīng)小于1。

5.2 黏附素測(cè)定

取回腸前段，經(jīng)反復(fù)沖洗之后，將黏膜制成涂片，用革蘭氏法染色，鏡檢。如觀察到有大量革蘭氏陰性大腸桿菌樣細(xì)菌，即為陽(yáng)性。也可將沖洗的回腸前段，制成切片、染色、鏡檢；如無(wú)黏附素的大腸桿菌樣細(xì)菌則易被沖掉；具有黏附素的大腸桿菌，一般均為產(chǎn)LT毒素的致病大腸桿菌。

5.3 回歸動(dòng)物試驗(yàn)

將分離獲得的大腸桿菌18h肉湯培養(yǎng)物以0.5～1.0ml劑量口服感染未吃初乳的新生牛犢。如病犢發(fā)熱，精神委頓，排水樣稀糞，常致突然死亡，即可做出初步診斷；此時(shí)從尸體的內(nèi)臟和組織里都可分離到單一血清型的大腸桿菌純培養(yǎng)。

[1] 李升團(tuán)，韓光紅.大腸桿菌O157：H7感染的病原學(xué)與流行病學(xué)[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1997，（5）：387-389.

[2] 冉旭華，王密，聞曉波，等.大腸桿菌病病原學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，（2）：51-54.

谷作霖（1971—），男，大專(zhuān)，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物檢疫檢驗(yàn)工作。