臨床實(shí)驗(yàn)室-急性早幼粒細(xì)胞白血病早期救治中的重要參與者

肖作淼綜述，王小中審校

(1、贛州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 贛州341000；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

急性早幼粒細(xì)胞白血病 (acute promyelocytic leukemia,APL)俗稱M3,因發(fā)病急、病情進(jìn)展快，容易合并DIC繼發(fā)腦出血而視為內(nèi)科中的急癥[1-8]。該病由特異性染色體易位即t(15;17)(q24.1;q21.1)導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞異常增殖并分化障礙致機(jī)體發(fā)病。隨著全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)的應(yīng)用，使APL從高致死性疾病發(fā)展成為高治愈性的一類髓系白血病[7-12]。目前APL患者死亡主要發(fā)生在就診30天內(nèi)即早期死亡(early death，ED)[7-10]，該時(shí)期也成了患者的最危險(xiǎn)時(shí)期，ED主要與患者未及時(shí)就診或就診后未及時(shí)得到確診與專業(yè)救治有關(guān)[2,9,11,13]。因此，實(shí)驗(yàn)室在早發(fā)現(xiàn)早診斷過程中成為APL救治成功的重要因素，有著積極的的作用[14-18]，現(xiàn)就APL實(shí)驗(yàn)室診斷的傳統(tǒng)與新興手段作一綜述。

1 外周血象和外周血形態(tài)檢查

APL 患者發(fā)病會引起血象改變，血小板計(jì)數(shù)(BPC)大多數(shù)減少[4,16,19]，伴有血紅蛋白(Hb)減低和(或)白細(xì)胞(WBC)數(shù)改變，因此患者血象多表現(xiàn)為三系、二系減少，或血小板減少伴WBC增高，單獨(dú)血小板減少者少見。WBC和BPC數(shù)也是APL分層治療與預(yù)后的重要指標(biāo)[4,10,12,14]，WBC<10×109/L,BPC>40×109/L 為低危組， WBC<10×109/L,BPC<40×109/L為中危組，而WBC>10×109/L則劃分為高危組。因APL發(fā)病時(shí)臨床癥狀不同，患者就診科室不同，但大多數(shù)患者就診時(shí)都會查血象，也是涉及病源最廣的項(xiàng)目，因此臨床實(shí)驗(yàn)室有必要對上述血象改變者進(jìn)行外周血形態(tài)篩查。在血片中大多能檢見顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞或同時(shí)檢見柴捆狀細(xì)胞 (faggot cell)，這對APL診斷有重要指導(dǎo)意義，亦可作為臨床即刻使用ATRA治療的重要依據(jù)，故臨床實(shí)驗(yàn)室有必要將其視為“危急值”報(bào)告臨床醫(yī)生。對可疑APL血象者進(jìn)一步行形態(tài)學(xué)檢查通?？傻玫街匾€索，而且最快半小時(shí)內(nèi)(通常1小時(shí)內(nèi))出報(bào)告，所以是實(shí)用價(jià)值很高的篩查手段，成為APL救治的第一道重要關(guān)口。

2 骨髓形態(tài)學(xué)檢查(mo r p h o l o g y，M)

骨髓形態(tài)學(xué)檢查是WHO白血病MIMC分型(Morphology、Immunology、Cytogenetics 和 Molecular，MICM)的基礎(chǔ)，是診斷 APL 的傳統(tǒng)方法[2,15,18,20]，骨髓片自然干燥經(jīng)瑞(Wright)氏或瑞-吉(Wright-Giemsa)氏染色后分類計(jì)數(shù)500個(gè)有核細(xì)胞，APL患者骨髓中異常早幼粒細(xì)胞增多，此類特征性異常早幼粒細(xì)胞≥30%(NEC計(jì)數(shù))即達(dá)到APL之英法美(French-America-British,FAB)診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]。 根據(jù)顆粒多少及粗細(xì)，F(xiàn)AB分型分為M3和M3v，而國內(nèi)通常分為：①粗顆粒型 (M3a)②細(xì)顆粒型(M3b)。粗顆粒型(M3a)相當(dāng)于FAB分型中的M3為經(jīng)典型APL；而細(xì)顆粒型(M3b)相當(dāng)于M3v則為變異型APL，約占20%，主要見于WBC增高的高危組。除顆粒增多的異常早幼粒外，部分APL患者同時(shí)可見大量奧氏小體(Auer rod)的柴捆細(xì)胞[3,20,22],檢見此類細(xì)胞有助于APL的診斷。骨髓形態(tài)診斷為APL者應(yīng)盡快使用ATRA以減少出血風(fēng)險(xiǎn)[2,7,9,16,20]，故實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立即聯(lián)系臨床，以便及時(shí)按APL來救治患者。但約有15%~20%APL形態(tài)不典型[15,19]，需要仔細(xì)鑒別才能找到典型形態(tài)的APL細(xì)胞,要求工作人員有較豐富的骨髓形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)以及足夠的耐心,若能結(jié)合組化染色如過氧化物酶(POX)和特異性酯酶(SE)染色則能有效地與M5b鑒別。為提高APL的救治成功率，骨髓報(bào)告有必要執(zhí)行分級報(bào)告制度，即2h內(nèi)電話初步報(bào)告和24h內(nèi)正式報(bào)告相結(jié)合的模式，從而為早期救治贏取時(shí)間。骨髓形態(tài)學(xué)檢查最快能在1h內(nèi)得出骨髓像信息，且大多數(shù)APL形態(tài)學(xué)檢查能夠確診，最大的優(yōu)勢在于方便、快捷和低廉，是APL診斷的最快速和最基本的檢測方法，在APL早期救治中發(fā)揮著極其重要的作用。

3 免疫學(xué)檢查(i mmu n o l o g y，I)

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢查技術(shù)，加入單克隆抗體標(biāo)記分析骨髓細(xì)胞。因APL擁有顆粒增多的異常早幼粒細(xì)胞，其圖形側(cè)向散光(SSC)增大，擁有較獨(dú)特的免疫表型[2,3,15,18]，且不受染色體隱匿易位影響,最快能當(dāng)天(通常為2d)出報(bào)告,與形態(tài)學(xué)檢查結(jié)合能有效提高APL的診斷效率與正確率。APL最典型的表型多為CD34-HLA-DRCD13+、CD33+、CD117+, 但不屬于特異性表型[3,15,17]，因?yàn)橐陨媳硇鸵嘁娪诜茿PL的其他AML。有研究者嘗試不同單抗組合將AML中APL與非APL區(qū)分開業(yè)，如Zhou聯(lián)合CD11a和CD18區(qū)別于其他類型的AML[3]，其敏感性為83%，特異性達(dá)到79%；Dong等聯(lián)合CD11b和CD11c為特異性達(dá)95.3%，敏感性達(dá)96.2%[15]。針對APL免疫表型不同與形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)分型及其預(yù)后的相關(guān)研究也越來越多[3,9,14,18]，如表達(dá) CD2+、CD34+、CD56+提示預(yù)后不良，多見于 M3v(或 M3b)，PML/RARa融合基因多為BCR3(S型)。免疫學(xué)檢查主要缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，檢測費(fèi)用高，隨著FCM儀器的普及，其在APL的早期救治中發(fā)揮著越來越重要的作用，成為診斷APL的重要輔助手段，但目前尚不屬于APL確診方法。

4 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查(c y t o g e n e t i c，C)

4.1 染色體核型(karotype)把骨髓細(xì)胞接種于RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行24~48h培養(yǎng)后，收獲并制備染色體標(biāo)本通過顯帶進(jìn)行核型分析 染色體顯帶技術(shù)主要有G顯帶和R顯帶技術(shù)，前者最為常用，其染色體的帶紋較多且細(xì)致，有較強(qiáng)大的解象力容易查出更多細(xì)微變化。而R帶方法操作簡便重復(fù)性好帶型清晰，其顯帶成功率明顯高于G帶，對提示染色體末端的缺失和易位特別有價(jià)值，而血液病涉及染色體末端異常者較多，故在血液病核型分析應(yīng)用中也越來越普遍。APL具有獨(dú)特的染色體核型，其經(jīng)典核型通常為t(15；17)(q24；q21)[10,20,23]，其他變異核型少于 2%[5],如 t(11；17)(q23；q21)，t(5;17)(q22；q21)t(11；17)(q12；q21)等,t(11；17)(q23;q21)對 ATRA 治療無效。此外，t(15；17)伴隨附加異常有20%~30%的檢出率，但其預(yù)后與單純t(15;17)相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[16,19,24]。染色體核型是APL確診方法之一[2,3,9,19]，主要不足是操作復(fù)雜，出報(bào)告時(shí)間長(通常7~14d)，干擾因素多使染色體培養(yǎng)或核型分析失敗，顯然不利于APL的早期救治。

4.2 熒光原位雜交 (fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫熒光染色 FISH方法對骨髓或外周血標(biāo)本處理簡單，無細(xì)胞培養(yǎng)要求，雜交和檢測效率高，敏感性和特異性高，能同時(shí)檢測中期和間期細(xì)胞的基因融合信號，應(yīng)用FISH軟件分析技術(shù)，可以直觀地觀察到融合信號，是細(xì)胞遺傳學(xué)的重要補(bǔ)充手段，尤其是染色體培養(yǎng)失敗或核型正常，但臨床高度懷疑為隱匿易位時(shí)意義更大[21]。應(yīng)用FISH檢查PML/RARa融合基因，是一個(gè)簡便而快速(最快當(dāng)天發(fā)報(bào)告，通常為2d)的檢測方法[8]，能使APL快速得到確診，有利于APL早期救治。但FISH也存在一定的局限性：熒光顯微鏡昂貴、一個(gè)探針(probe)只能檢測一種融合基因、只能固定檢測目標(biāo)基因，如要檢測變異融合基因PLZF-RARa、NUM-RARa則要使用多個(gè)探針。因成本高，費(fèi)用貴,在國內(nèi)的臨床應(yīng)用中受到一定限制[25]，未能將FISH方法中簡便而快速的優(yōu)勢應(yīng)用于APL早期救治，而更多使用在染色體培養(yǎng)效果不佳或核型分析有疑問需要驗(yàn)證的情形。Rego應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)對130例APL可疑者的抗-PML進(jìn)行快速診斷(平均4h內(nèi)報(bào)告)[9]，結(jié)果與PCR檢測PML/RARa或染色體培養(yǎng)結(jié)果一致，所以抗-PML免疫熒光染色法對APL早期確診有著重要意義，但目前在國內(nèi)應(yīng)用并不普遍。

5 分子生物學(xué)檢查(mo l e c u l a r，M)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction,RQRT-PCR)技術(shù)分析技術(shù)檢測PML-RARa轉(zhuǎn)錄本。PML-RARa融合基因通常有三種類型，由不同的斷裂點(diǎn)所造成，6號內(nèi)含子處為bcr1(L型)；6號外顯子處的bcr2(V型)，及位于3號內(nèi)含子的bcr3(S型)，其中bcr1斷裂處最多約占55%，bcr3其次約占40%，bcr2最少約占5%[1,16]。PCR方法在核型正常的隱匿易位中同樣可檢出PML-RARa及變異異位如PLZF-RARa、NUM-RARa轉(zhuǎn)錄本，因其敏感性高(可達(dá)10-4個(gè)細(xì)胞)、費(fèi)用相對較低，但相對與形態(tài)和流式檢查而言技術(shù)要求較高、操作較繁雜(需要將提取的RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA)、更費(fèi)時(shí)，通常在3d內(nèi)可出報(bào)告，是國內(nèi)確診APL應(yīng)用最為廣泛的項(xiàng)目[1,9,10,16,27]，同時(shí)也是微小殘留(minimal residual disease,MRD)監(jiān)測中常用手段，在APL確診與監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。

APL的早期死亡與出血并發(fā)癥息息相關(guān)，在ATRA應(yīng)用前，出血相關(guān)的早期病死率(early death rate，EDR)高達(dá) 60%[7,10]。 進(jìn)入 ATRA 應(yīng)用時(shí)代，多個(gè)協(xié)作組EDR報(bào)道為5%~10%[6,8,11]，但反對者的文獻(xiàn)報(bào)道為10%~30%不等[6,9,13,26-28]，認(rèn)為ATRA的使用并未能有效地降低早期死亡率，許多APL的死亡者在入組研究前已經(jīng)死亡。死亡原因包括患者未及時(shí)就診或者醫(yī)院未及時(shí)明確診斷或ATRA使用過慢，導(dǎo)致ATRA還未能充分發(fā)揮誘導(dǎo)分化功能時(shí)，患者往往已繼發(fā)了DIC并發(fā)腦出血，這是最大的死亡原因。目前，國內(nèi)外專家達(dá)成共識：對形態(tài)學(xué)檢查或臨床癥狀上懷疑為APL的患者應(yīng)使用ATRA[2,6,7,19,27]這是降低EDR有效的途徑，待遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢查確診者繼續(xù)使用ATRA到完全緩解，而對于不支持者則停用ATRA臨床處理方法其利大于弊。

APL屬于危急病種[29]，明確診斷的時(shí)限需求應(yīng)該以小時(shí)而非天來計(jì)算[1]，盡早對APL患者采取救治措施如使用ATRA、輸血小板、冷沉淀是減低EDR的有效方法，因此實(shí)驗(yàn)室對APL早發(fā)現(xiàn)早診斷扮演著重要的角色。FISH或RT-PCR檢測PMLRARa融合基因(轉(zhuǎn)錄本)和染色體核型分析是APL確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但三種手段時(shí)間長、費(fèi)用高，在早發(fā)現(xiàn)和早診斷APL的實(shí)際工作中有所限制。骨髓形態(tài)學(xué)檢查能夠快速而準(zhǔn)確地識別出絕大多數(shù)APL患者，是第一時(shí)間能確診APL的檢查手段，尤其對于臨床上懷疑APL(包括外周血形態(tài)懷疑，或外周血WBC過低形態(tài)不確定者)，骨髓形態(tài)都能提供重要的診斷信息。而對骨髓形態(tài)不好確定的變異型(M3v)診斷，應(yīng)用FCM手段能快速地得出免疫表型結(jié)果，且APL具有特征性免疫表型，所以形態(tài)與FCM聯(lián)合能確保快速且準(zhǔn)確地完成APL的診斷，為臨床救治APL的提供重要依據(jù)，為進(jìn)一步降低APL早期死亡率(EDR)創(chuàng)造條件。RT-PCR方法檢測PML-RARa融合基因，能較短時(shí)間出報(bào)告為后續(xù)治療(如蒽環(huán)類化療藥物的使用)提供依據(jù)，是臨床上確診APL最常用的方法。而血象分析是患者就診后接受的第一項(xiàng)檢查，大多患者發(fā)病時(shí)血象會改變，且絕大多數(shù)患者的外周血中能發(fā)現(xiàn)APL特征性早幼粒細(xì)胞如梁建英報(bào)道檢出率為85.8%[19]，故對符合APL血象改變的標(biāo)本進(jìn)行涂片篩查是簡單有效的方法，能為臨床診斷APL提供重要的導(dǎo)向,尤其對出血癥狀或凝血檢查項(xiàng)目改變不明顯，或就診于非血液科的患者能提供重要的診斷方向作用。但目前狀況不容樂觀，因?yàn)閺氖卵治龅墓ぷ魅藛T大多為年輕執(zhí)業(yè)者，他們對形態(tài)學(xué)檢查普遍經(jīng)驗(yàn)缺乏[30,31]，對APL的危急程度亦認(rèn)知不夠，使外周血形態(tài)在APL篩查中的作用力下降，應(yīng)當(dāng)引起行業(yè)的警惕。

總之，APL屬急癥，其救治要求多科室、多學(xué)科的互相協(xié)作，而早發(fā)現(xiàn)早診斷的過程中臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)揮積極的作用，是APL救治中的重要參與者。

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