保護(hù)劑在微生物真空冷凍干燥中的應(yīng)用

牛曉影,鄧麗莉,曾凱芳,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),重慶 400715)

保護(hù)劑在微生物真空冷凍干燥中的應(yīng)用

牛曉影1,鄧麗莉1,曾凱芳1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),重慶 400715)

真空冷凍干燥后微生物較低的存活率在一定程度上限制了諸如采后果蔬生防試劑、益生菌、發(fā)酵劑等的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用,而保護(hù)劑的加入可以較大幅度的彌補(bǔ)這一劣勢(shì)。本文綜述了保護(hù)劑在微生物真空冷凍干燥中的應(yīng)用狀況,將目前使用的保護(hù)劑按照化學(xué)結(jié)構(gòu)、來(lái)源、穿透能力、保護(hù)階段等不同方法進(jìn)行了分類(lèi);對(duì)常用的幾種保護(hù)劑脫脂奶粉、海藻糖以及谷氨酸鈉的保護(hù)機(jī)理及應(yīng)用進(jìn)行了介紹;并闡述了保護(hù)劑的增效途徑,微生物冷凍干燥使用單一保護(hù)劑不足以得到理想的存活率,只有在合適的條件下對(duì)保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配增效才能夠使生防試劑、發(fā)酵劑等的商業(yè)化應(yīng)用成為可能。

真空冷凍干燥,保護(hù)劑,保護(hù)機(jī)理,增效途徑

在食品領(lǐng)域,微生物真空冷凍干燥技術(shù)主要應(yīng)用在采后果蔬生防試劑、益生菌、發(fā)酵劑等的研究上,與其他保種技術(shù)相比,真空冷凍干燥技術(shù)可使菌懸液形成干粉方便運(yùn)輸、銷(xiāo)售及使用[1],且形成干粉后微生物的生化反應(yīng)降到最低可使貯藏期內(nèi)干粉的生物、化學(xué)、物理性能保持相對(duì)穩(wěn)定[2],再者凍干粉使用真空包裝技術(shù)可使微生物免受貯藏過(guò)程中的污染[3]。然而真空冷凍干燥的微生物在經(jīng)歷了冷凍、干燥、貯藏三個(gè)階段后,它的存活率受到嚴(yán)重影響,這也是目前限制真空冷凍干燥微生物商業(yè)化應(yīng)用最重要的原因。

事實(shí)上,影響微生物真空冷凍干燥后存活率的原因主要有兩方面,一方面是微生物自身,另一方面是冷凍、干燥、貯藏微生物的環(huán)境條件。其中對(duì)微生物自身來(lái)說(shuō),它的培養(yǎng)條件、微生物收獲期、冷凍干燥前微生物的濃度均會(huì)影響凍干后微生物的存活率[4-6]。另一方面有研究表明,真空冷凍干燥后微生物存活率下降的最主要原因是冷凍干燥過(guò)程中冰晶的形成、高濃度胞內(nèi)溶質(zhì)引起的高滲透壓導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜破壞,此外脫水影響了親水性大分子性能,蛋白質(zhì)降解等最終影響了微生物的存活率[7]。

針對(duì)冷凍、干燥、貯藏等外部環(huán)境對(duì)微生物存活率造成的影響,可在菌懸液中加入合適的保護(hù)劑,減少或避免外部惡劣環(huán)境條件對(duì)微生物造成破壞,進(jìn)而提高微生物的存活率,為其商業(yè)化應(yīng)用提供可能。

1 保護(hù)劑的幾種分類(lèi)方法

1.1 按保護(hù)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)

按保護(hù)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)大體可將保護(hù)劑分為三類(lèi):糖類(lèi)保護(hù)劑、蛋白類(lèi)保護(hù)劑、其他。糖類(lèi)和蛋白質(zhì)是相關(guān)研究中應(yīng)用最廣泛的兩類(lèi)保護(hù)劑,是研究人員選擇保護(hù)劑首要考慮的對(duì)象[8]。

糖類(lèi)保護(hù)劑主要包括單糖、二糖、三糖。單糖中最常用的保護(hù)劑有:葡萄糖、果糖、半乳糖。二糖中最常用的保護(hù)劑有:海藻糖、蔗糖、乳糖。三糖中最常用的保護(hù)劑是棉籽糖。有研究表明單糖中半乳糖保護(hù)效果最好,三糖中棉籽糖對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用較好[9-10],二糖的保護(hù)效果普遍較好[11-13],Costa等對(duì)成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)進(jìn)行研究,得出最佳的保護(hù)劑是海藻糖和蔗糖,當(dāng)使用5g/100mL的海藻糖時(shí),其存活率達(dá)到83%左右,當(dāng)使用10g/100mL的蔗糖時(shí),存活率達(dá)到75%左右[14]。糖類(lèi)保護(hù)性能的不同源于它們與水結(jié)合能力和抑制細(xì)胞內(nèi)外冰晶形成的差異[15],與是否能夠參與代謝沒(méi)有多大關(guān)系[16]。有研究表明二糖比三糖應(yīng)用廣泛是因?yàn)槎潜热菍?duì)磷脂膜有更強(qiáng)的結(jié)合力[17]。

蛋白類(lèi)保護(hù)劑主要包括牛乳蛋白、血清、大豆蛋白、膠原蛋白等,有研究表明蛋白質(zhì)比糖類(lèi)有更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,在冷凍干燥形成玻璃態(tài)方面,蛋白質(zhì)比糖類(lèi)扮演更重要的角色[1],此外蛋白質(zhì)可在微生物細(xì)胞壁外形成保護(hù)性外膜[9]。0.1～4g/100mL的血清白蛋白很長(zhǎng)時(shí)間被作為病毒和立克次體的凍干保護(hù)劑[18]。有研究表明,2g/100mL的類(lèi)人膠原蛋白可使長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)存活率達(dá)到39.09%±1.27%[19]。Wang等以發(fā)酵豆奶作為保護(hù)劑可使長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longumB6)的存活率達(dá)到43%～52%[20]。

1.2 按保護(hù)劑的來(lái)源進(jìn)行分類(lèi)

按保護(hù)劑的來(lái)源可將保護(hù)劑分為:內(nèi)源性保護(hù)劑、外源性保護(hù)劑。前者是指微生物本身存在的或培養(yǎng)條件、周?chē)h(huán)境改變使其自身合成的具有保護(hù)性的物質(zhì),后者是指冷凍前另加入菌懸液中以保護(hù)為目的的物質(zhì)。此種分類(lèi)研究方法主要針對(duì)的是海藻糖。有研究表明在冷凍干燥過(guò)程中,只有細(xì)胞膜兩側(cè)都存在海藻糖才能有效的保護(hù)酵母菌[21],酵母菌有特殊的海藻糖載體[22],但是Zayed等的研究證明冷凍前的時(shí)間不足以使細(xì)胞運(yùn)輸足夠的海藻糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以提高酵母菌的存活率[23]。

最早研究發(fā)現(xiàn)很多酵母菌細(xì)胞內(nèi)都存在一定量的海藻糖,它可使酵母菌在很多惡劣的環(huán)境中生存,例如高溫、冷凍、干燥、高滲透壓等。為了提高細(xì)胞質(zhì)中海藻糖的含量,可在培養(yǎng)微生物過(guò)程中,用海藻糖[24]或檸檬酸[25]取代葡萄糖作為碳源以增加細(xì)胞中海藻糖的含量。也有研究表明冷凍前溫和的熱處理可使酵母菌菌體內(nèi)海藻糖含量增加,而當(dāng)酵母菌處于厭氧環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí),它的海藻糖含量和抗凍能力降低[26]。Li等研究,使用5g/100mL或10g/100mL的海藻糖作為保護(hù)劑,與高含量的細(xì)胞內(nèi)海藻糖相互作用,可使羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)和粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)兩類(lèi)拮抗酵母菌的存活率分別達(dá)到90%和97%左右[24]。

1.3 按保護(hù)劑的穿透能力進(jìn)行分類(lèi)

按保護(hù)劑的穿透能力可將保護(hù)劑分為三類(lèi):能夠穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的保護(hù)劑、能夠穿透細(xì)胞壁而無(wú)法穿透細(xì)胞膜的保護(hù)劑、既不能穿透細(xì)胞壁又不能穿透細(xì)胞膜的保護(hù)劑。穿透能力的不同反過(guò)來(lái)會(huì)影響它們對(duì)微生物的保護(hù)機(jī)制,保護(hù)作用大致可分為細(xì)胞內(nèi)保護(hù)和細(xì)胞外保護(hù)[18]。此種分類(lèi)方法最初是用來(lái)分類(lèi)冷凍保護(hù)劑的。

能夠穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的保護(hù)劑主要有二甲基亞砜、甘油等。二甲基亞砜和甘油是常見(jiàn)的冷凍保護(hù)劑,在微生物冷凍保種中發(fā)揮著重要作用。二甲基亞砜對(duì)一些生物系統(tǒng)具有毒性作用,毒性因微生物類(lèi)別而異,在使用時(shí),應(yīng)該避免二甲基亞砜的濃度超過(guò)15%,且需要在解凍后對(duì)懸浮液進(jìn)行離心或稀釋。Tan等研究表明,5g/100mL的葡聚糖+7g/100mL的海藻糖+1%的二甲基亞砜可以使多孢節(jié)叢孢(Arthrobotryssuperba)的存活率達(dá)到35%左右[17]。對(duì)于加有甘油的懸浮液很大程度上會(huì)延長(zhǎng)干燥時(shí)間,若干燥不完全,甘油對(duì)凍干菌有負(fù)面作用[27],但也有研究得出乳酸菌在中性環(huán)境的存活率要高于酸性環(huán)境的存活率,甘油有助于克服酸性環(huán)境給乳酸菌帶來(lái)的不良影響[28]。南君勇等研究表明5%的甘油可以使熱帶假絲酵母(Candidatropical)的存活率達(dá)到28%左右[29]。此類(lèi)保護(hù)劑可以在冷凍時(shí)形成玻璃態(tài),抑制冰晶的形成,防止高滲透壓引起的鹽類(lèi)毒性對(duì)細(xì)胞膜造成破壞。

能夠穿透細(xì)胞壁而無(wú)法穿透細(xì)胞膜的保護(hù)劑主要有氨基酸、分子量較小的聚合物例如PEG-1000。此類(lèi)保護(hù)劑可以在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間形成緩沖層,抑制冰晶的形成,保護(hù)細(xì)胞膜。有研究表明1g/100mL的PEG可以使熱帶假絲酵母(C.tropical)的存活率達(dá)到28%左右[30]。常見(jiàn)的氨基酸保護(hù)劑有谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等。有熒光探針檢測(cè)到當(dāng)菌懸液中加入谷氨酸或天冬氨酸會(huì)使細(xì)胞磷脂膜變得無(wú)序,促使細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng),干燥后存活率上升[31],Yang等研究表明0.1g/100mL的L-半胱氨酸可以使長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)的存活率達(dá)到25.54%±0.52%[19],也有研究表明天冬氨酸、脯氨酸對(duì)乳酸菌沒(méi)有保護(hù)作用[28]。

既不能穿透細(xì)胞壁又不能穿透細(xì)胞膜的保護(hù)劑主要指較高分子量的聚合物,例如蛋白質(zhì)、多糖、葡聚糖等。此類(lèi)保護(hù)劑可在細(xì)胞表面形成粘性層,保護(hù)細(xì)胞。Ashwood-Smith等研究認(rèn)為PVP能夠與過(guò)氧化氫酶連接起到保護(hù)作用[32]。而Lodato等研究PVP對(duì)酵母菌的保護(hù)效果不佳[21]。羧甲基纖維素和羥甲基纖維素作為保護(hù)劑可為干粉提供一個(gè)較輕的多孔結(jié)構(gòu),但是不容易復(fù)水[10]。

1.4 按保護(hù)劑的保護(hù)階段進(jìn)行分類(lèi)

按保護(hù)劑的保護(hù)階段可將保護(hù)劑分為:冷凍保護(hù)劑、干燥保護(hù)劑、貯藏保護(hù)劑。此種分類(lèi)方法是由保護(hù)劑在某個(gè)階段所起主要作用而分類(lèi)的,事實(shí)上有些保護(hù)劑的保護(hù)作用是交叉的,可能在三個(gè)階段都起作用,例如海藻糖等[11]。甘油和二甲基亞砜是優(yōu)良的冷凍保護(hù)劑,在微生物冷凍保種中的作用不可忽視,但隨著真空冷凍干燥技術(shù)的發(fā)展,一些冷凍保護(hù)劑被廣泛應(yīng)用到凍干領(lǐng)域。但也有研究人員證明添加一定量的冷凍保護(hù)劑到凍干保護(hù)劑中并沒(méi)有提高真菌的存活率[17]。

一般認(rèn)為冷凍保護(hù)劑和干燥保護(hù)劑在冷凍干燥的不同階段發(fā)揮主要作用,添加冷凍保護(hù)劑的作用是減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,冷凍保護(hù)劑能夠促進(jìn)微生物懸浮液玻璃態(tài)的形成、抑制冰晶的形成,防止形成的冰晶破壞細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)[33]。同時(shí)研究表明,干燥過(guò)程中干燥保護(hù)劑能夠取代水分子吸附在磷脂、蛋白質(zhì)表面,與磷脂雙分子層相互作用,降低它從液晶相到剛性凝膠相的溫度[34]。

有些物質(zhì)可阻止或降低冷凍干燥過(guò)程對(duì)微生物的不良影響,而無(wú)法在貯藏過(guò)程發(fā)揮保護(hù)作用。有研究表明,在貯藏期中,有可能因?yàn)檠趸饔枚鴮?duì)微生物存活率造成影響,因此一些抗氧化劑被用作貯藏保護(hù)劑,例如抗壞血酸鈉[22]、硫代硫酸鈉[34]等,甚至一些糖類(lèi)在貯藏過(guò)程中也可起到抗氧化的作用,Benaroudj等研究海藻糖可作為自由基清除劑消除氧自由基對(duì)微生物的影響[35],此外有研究證明谷氨酸鈉在凍干酵母菌貯藏過(guò)程中發(fā)揮重要作用[36]。除氧化作用對(duì)微生物存活率有影響外,高水分含量的干粉對(duì)微生物貯藏穩(wěn)定性也有負(fù)面作用,相反玻璃態(tài)的形成可減弱微生物貯藏過(guò)程中生化反應(yīng)的發(fā)生,而糖類(lèi)可以促進(jìn)干粉玻璃態(tài)的形成,這也是糖類(lèi)成為貯藏保護(hù)劑的原因之一[37]。

綜合以上幾種分類(lèi)方法,一個(gè)優(yōu)良的保護(hù)劑首先要能夠使凍干的菌種達(dá)到一定的存活率,同時(shí)要保證凍干后菌種的功能性不會(huì)減弱,例如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶的能力、發(fā)酵劑的發(fā)酵能力、益生菌分泌抗菌物質(zhì)的能力[24,38]等,其次還要求加入保護(hù)劑后懸浮液能夠在一定的時(shí)間內(nèi)凍干,并且容易復(fù)水[27],再者應(yīng)確保保護(hù)劑本身不具有毒性、不易分解,此外對(duì)于要進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用的凍干制劑,還應(yīng)該考慮保護(hù)劑的成本問(wèn)題。

2 常用的幾種保護(hù)劑及保護(hù)機(jī)理

保護(hù)劑的選擇很大程度上取決于微生物的種類(lèi),但也有一些保護(hù)劑是適用于很多種微生物的,這其中包括脫脂奶粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、谷氨酸鈉等。

2.1 脫脂奶粉的保護(hù)機(jī)理及應(yīng)用

脫脂奶粉是一個(gè)混合物,它包括乳糖、蛋白質(zhì)、鹽類(lèi)、維生素等。脫脂奶粉中的蛋白質(zhì)為細(xì)胞提供了一個(gè)保護(hù)性外膜[9],經(jīng)研究證明其中的Ca2+可以提高微生物冷凍干燥后的存活率,此外脫脂奶粉中的磷酸鹽和檸檬酸鹽可以起到緩沖作用,穩(wěn)定pH[23]。

但其實(shí)也有研究表明,單獨(dú)使用脫脂奶粉作為保護(hù)劑微生物的存活率并不是很高,Berny等研究使用脫脂奶粉作為保護(hù)劑,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)存活率是30%左右,酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)的存活率較低,而對(duì)葡萄串狀節(jié)叢孢(Arthrobotrysarthrobotryoides)沒(méi)有起保護(hù)作用[10]。所以很多研究者認(rèn)為脫脂奶粉能被廣泛應(yīng)用,是因?yàn)樗勺鳛橐环N賦形劑,為干粉提供較輕的多孔無(wú)定型結(jié)構(gòu),容易復(fù)水[7]。在很多研究中,采用高濃度的脫脂奶粉和其他物質(zhì)復(fù)合來(lái)提高微生物的存活率。Polomska等研究?jī)龈山湍妇?單獨(dú)使用10g/100mL的脫脂奶粉,球形假絲酵母(Candidasphaerica)的存活率是20%左右,當(dāng)10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的谷氨酸鈉作為保護(hù)劑,它的存活率達(dá)到50%左右,當(dāng)10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的海藻糖或10g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的海藻糖+10g/100mL的谷氨酸鈉作為保護(hù)劑,它的存活率達(dá)到80%左右[38]。

2.2 海藻糖的保護(hù)機(jī)理及應(yīng)用

海藻糖能夠有效提高微生物凍干后的存活率,曾在很長(zhǎng)一段時(shí)間被認(rèn)為是為微生物提供碳源[35],然而更多的研究結(jié)果表明,海藻糖在穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面起著重要作用,而細(xì)胞膜物理狀態(tài)的改變以及蛋白質(zhì)的變性是造成微生物死亡的直接原因[39]。

海藻糖的保護(hù)機(jī)理主要體現(xiàn)在兩方面,首先在凍干過(guò)程中,細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成破壞細(xì)胞膜、造成胞內(nèi)滲透壓上升、胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高產(chǎn)生毒副作用,海藻糖的加入可提高菌懸液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,使菌懸液形成玻璃態(tài)[37],敏感性物質(zhì)嵌入到玻璃態(tài)中[21],同時(shí)分子移動(dòng)性降低,對(duì)酶也有很好的保護(hù)作用[34]。此外根據(jù)水代替假說(shuō)[11],在凍干過(guò)程中,海藻糖能夠代替水分子與細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)上的親水基團(tuán)形成水合鍵,保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,避免細(xì)胞膜失水后,烷基鏈聚合,使細(xì)胞膜從片狀轉(zhuǎn)為凝膠狀或六角狀,造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄露[33]。Cerrutti等研究表明內(nèi)源性海藻糖的保護(hù)原理也與細(xì)胞膜穩(wěn)定性、酶活力的保存有關(guān),而對(duì)酵母菌來(lái)說(shuō)干燥后其存活率在很大程度上取決于細(xì)胞內(nèi)的海藻糖含量[40]。

Yang等對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)研究,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用保護(hù)劑時(shí),10g/100mL的海藻糖的保護(hù)效果最好,其存活率達(dá)到53.22%±2.21%[19]。很多研究認(rèn)為海藻糖的保護(hù)性能優(yōu)于蔗糖[41],這主要也是由于海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于蔗糖,海藻糖還可以形成二水化合物,因此懸浮液中少量水可以被析出,使得剩余的物質(zhì)形成玻璃態(tài)[12],Patist等還表示,與蔗糖和麥芽糖相比,海藻糖兩個(gè)單體之間的伸縮性、柔韌性更好,因而與大分子的極性基團(tuán)相互作用也更強(qiáng),再者海藻糖能夠瓦解水的四面體結(jié)構(gòu),減少結(jié)晶水的形成[33],但是海藻糖的成本在一定程度上限制了它的使用。

2.3 谷氨酸鈉的保護(hù)機(jī)理及應(yīng)用

谷氨酸鈉作為凍干保護(hù)劑其應(yīng)用遠(yuǎn)沒(méi)有脫脂奶粉和海藻糖廣泛,然而谷氨酸鈉獨(dú)特的保護(hù)機(jī)理也受到很多研究者的青睞。曾有研究人員對(duì)氨基酸進(jìn)行大量研究,認(rèn)為谷氨酸中的-NH2、α-COOH和γ-COOH對(duì)微生物起到保護(hù)作用,在干燥過(guò)程中,谷氨酸鈉與水的密切作用使干粉保留了適量的水分,滿(mǎn)足了微生物維持生命的最低需求[42]。此外研究表明谷氨酸鈉還具有抗氧化作用,抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成,以防止對(duì)細(xì)胞膜造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞[38]。

有研究表明,以2.5%的谷氨酸鈉作為保護(hù)劑凍干酒類(lèi)酒球菌(Oenococcusoeni),貯藏6個(gè)月后的存活率與凍干后直接測(cè)得的存活率分別是71.3%和72.4%,表現(xiàn)出較好的貯藏穩(wěn)定性[15]。但也有研究表明,單獨(dú)使用谷氨酸鈉對(duì)微生物保護(hù)作用不大,王華等研究熱帶假絲酵母(C.tropical)發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用7g/100mL的谷氨酸鈉作為保護(hù)劑,該菌的存活率為27.92%,采用響應(yīng)面法得出14.15g/100mL的蔗糖+7.07g/100mL的谷氨酸鈉+1.1g/100mL的聚乙二醇為保護(hù)劑,它的菌體存活率可達(dá)到81.46%[30]。

3 保護(hù)劑的增效途徑

對(duì)于單個(gè)保護(hù)劑的增效途徑,首先可通過(guò)大分子保護(hù)劑與小分子保護(hù)劑結(jié)合、滲透性保護(hù)劑與非滲透性保護(hù)劑結(jié)合、糖類(lèi)保護(hù)劑與蛋白類(lèi)保護(hù)劑結(jié)合等理論復(fù)合保護(hù)劑使其達(dá)到增效、協(xié)同的作用[1,18]。南君勇研究熱帶假絲酵母(C.tropical),通過(guò)單因素、正交實(shí)驗(yàn),當(dāng)使用5%的甘油+5g/100mL的脫脂奶粉+10g/100mL的蔗糖+15g/100mL的β-環(huán)狀糊精可使該菌的存活率達(dá)到82.86%左右[29]。Li等研究表示,用檸檬酸取代葡萄糖培養(yǎng)酵母菌可使酵母菌體內(nèi)產(chǎn)生大量的海藻糖,再另加10g/100mL半乳糖和5g/100mL脫脂奶粉作為保護(hù)劑,其存活率可達(dá)到96.1%±2.5%[25]。Huang等通過(guò)響應(yīng)面法,得出德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)的最佳保護(hù)劑是6.64g/100mL的蔗糖+10.12%的甘油+11.3g/100mL的山梨糖醇+13g/100mL的脫脂奶粉,它的存活率可達(dá)到86.53%[7]。

此外保護(hù)劑還可以與無(wú)機(jī)鹽類(lèi)混合,以提高微生物的存活率。研究表明對(duì)于某些病毒、嗜鹽微生物,添加Mg2+和Ca2+等可以顯著提高存活率,然而對(duì)于某些真核微生物通常會(huì)造成滲透壓傷害[18]。Conrad等研究表明,添加硼酸鹽到海藻糖中能夠有效提高嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的存活率,硼酸鹽分子與海藻糖分子相互纏結(jié),形成類(lèi)似多聚物的分子,提高海藻糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,與小分子結(jié)合,在冷凍和干燥過(guò)程中保護(hù)酶[34]。而Tan等研究人員表示添加CaCl2、MgSO4到葡聚糖和海藻糖中,沒(méi)有提高多孢節(jié)叢孢(A.superba)的存活率[17]。

大量研究表明,預(yù)先將微生物暴露在較溫和的惡劣環(huán)境中可以增強(qiáng)它在后續(xù)相同極端環(huán)境或另一類(lèi)極端環(huán)境中的抗逆能力,這種現(xiàn)象稱(chēng)為獲得性抗逆能力或交叉保護(hù)能力,微生物常見(jiàn)的抗逆能力主要體現(xiàn)在它對(duì)冷、熱、酸的應(yīng)激反應(yīng)[26]。Diniz-Mendes等研究,釀酒酵母(S.cerevisiae)冷凍前在40℃的條件下熱浴60min,貯藏7d后與對(duì)照組相比,其存活率提高了7倍,究其原因可能是冷凍前的熱處理使酵母菌菌體內(nèi)產(chǎn)生抗熱蛋白和海藻糖,此外該菌冷凍前在10℃條件下放置3h也可提高凍干存活率,但其原因與熱處理不同,具體保護(hù)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究[43]。Benaroudj等也得出類(lèi)似結(jié)論,釀酒酵母(S.cerevisiae)冷凍前,38℃熱處理或蛋白酶體抑制劑的誘導(dǎo)可以使酵母菌菌體內(nèi)積累大量的海藻糖[35],提高其存活率。Son等表明,釀酒酵母(S.cerevisiae)分別在pH=3.5和pH=5.2的環(huán)境中培養(yǎng),凍干后前者的存活率大于后者的存活率,主要原因是在低pH條件下,菌體糖原增多、飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例上升,能夠使細(xì)胞膜保持最佳的膜質(zhì)秩序[26]。

4 展望

保護(hù)劑的選擇是微生物真空冷凍干燥過(guò)程中極其重要的環(huán)節(jié),它的保護(hù)效力因微生物而異,這種差異不僅表現(xiàn)在細(xì)菌和酵母菌之間,甚至酵母菌的不同種間也存在區(qū)別,同時(shí)在研究過(guò)程中,也應(yīng)關(guān)注微生物的初始濃度、保護(hù)劑的濃度、干粉的貯藏溫度、干粉的復(fù)水等才能較好的維持它的保護(hù)效力。未來(lái)保護(hù)劑的發(fā)展趨勢(shì)主要有如下幾方面:應(yīng)用差示量熱掃描儀、近紅外光譜儀、掃描電鏡等儀器測(cè)定保護(hù)劑的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、觀(guān)察保護(hù)劑玻璃態(tài)的形成,輔助判斷它們的保護(hù)能力[2,13,21,44];保護(hù)劑可以不僅僅局限在菌懸液凍干前添加,已有較少的研究證明,在培養(yǎng)基或干粉復(fù)水時(shí)添加保護(hù)劑,可以分別增強(qiáng)菌種的抗逆能力和修復(fù)能力[8,11,25];使用細(xì)胞固定技術(shù)、微膠囊技術(shù),將海藻酸鈉、果膠等保護(hù)劑應(yīng)用到凍干制劑中,增強(qiáng)菌種的穩(wěn)定性[45-46];篩選特殊的保護(hù)劑,使其既能夠保護(hù)菌種,又能夠發(fā)揮與菌種相似的作用,例如可以選擇一種生物保鮮劑作為凍干拮抗酵母菌的保護(hù)劑,一舉兩得。

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Application of protectants in freeze-dried microorganism

NIU Xiao-ying1,DENG Li-li1,ZENG Kai-fang1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation(Chongqing)Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China)

The lower viability of freeze-dried microorganism restricts the development and application of fruits and vegetables biocontrol agents,probiotics and starter cultures in some extent,but adding the appropriate protectants can compensate such deficiency widely. This paper summarized the application of protectants in lyophilization,and classifies the protectants from different angles,such as chemical structure,source,permeability,protective phase,and selects some common protectants,such as skimmed milk powder,trehalose,sodium glutamate,to illustrate their protective mechanism and applications. Besides,the paper introduced symergistic methods of protectants to show that using only one protectant during freeze-drying can not achieve ideal viability and the synergism of different protectants will make the commercialization of biocontrol agents and starter cultures possible.

freeze-drying;protectant;protective mechanism;synergistic methods

2014-05-28

牛曉影(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

*通訊作者:曾凱芳(1972-)，女，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271958)；重慶市科技攻關(guān)(應(yīng)用技術(shù)研發(fā)類(lèi)/重點(diǎn))項(xiàng)目(cstc2012gg-yyjsB80003)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(45批)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0390-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.074