IL-17在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎患兒血清中的表達水平及意義

孟景紅 杜向一 陳海英 王俊祥 謝建麗 王倩倩 姚林虎 魏平

幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)是2001年由國際風(fēng)濕學(xué)會聯(lián)盟正式命名的，它是指兒童時期(＜16歲)不明原因的持續(xù)6周以上的關(guān)節(jié)腫脹，取代了原來幼年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(JRA)或幼年慢性關(guān)節(jié)炎(JCA)的病名。JIA是兒童時期常見的自身免疫性疾病，發(fā)病率約為113/10萬，共分為7種類型，常見的有全身型、多關(guān)節(jié)型和少關(guān)節(jié)型，致殘率高，嚴(yán)重危害兒童的身體健康。目前JIA的病因和發(fā)病機制尚未完全明了，研究表明，細(xì)胞因子IL-1、IL-6、IL-17失衡參與了JIA的發(fā)?。?］。有文獻報道JIA患兒血清中IL-1和IL-6的表達增加，且IL-6與疾病活動度及血小板計數(shù)呈正相關(guān)［1－3］。但IL-17變化與JIA疾病活動情況的關(guān)系尚不明確。本研究擬檢測JIA患兒血清中IL-17表達水平的變化，分析JIA患兒血清中IL-17變化的特點和與疾病活動之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年10月至2013年4月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院免疫風(fēng)濕科確診為JIA患兒54例(3～15歲)作為病例組，按照國際風(fēng)濕學(xué)會聯(lián)盟2001關(guān)于JIA的分類標(biāo)準(zhǔn)［4］進行分類，17例全身型JIA為病例1組(4～13歲)，20例多關(guān)節(jié)型JIA為病例2組(3～15歲)，17例少關(guān)節(jié)型JIA為病例3組(3～14歲)。同時收集同期在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院健康查體兒童32例(3～15歲)作為對照組，病例1組、病例2組、病例3組、對照組在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 2組一般情況比較

1.2 試劑與儀器 人IL-17的ELISA試劑盒均購于RD生物科學(xué)公司。主要儀器:全自動定量酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS 352型)、臺式離心機(北京離心機廠LDZ5-2)、電熱恒溫水溫箱(成都賽可隆機械設(shè)備有限公司HH-501)、加樣器槍頭、加樣器、計時器、紙巾、蒸餾水等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集:于清晨空腹采集JIA患兒及健康對照兒童靜脈血約3 ml，室溫靜置20 min后離心分離血清(3 000 r/min離心大約20 min)，收集上清液，放置于－40℃冰箱內(nèi)凍存待測(ESR、CRP的檢測方法)。

1.3.2 ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子:取上述凍存待測樣本放置于室溫下復(fù)融，通過ELISA雙抗體夾心法檢測IL-17的水平。具體操作步驟嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)說明書操作。

1.4 觀察指標(biāo) 記錄所有JIA患兒檢測的ESR、CRP值及關(guān)節(jié)腫痛數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，多組計量資料比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學(xué)差異后，進一步用SNK法做兩兩比較;IL-17與ESR、CRP、腫痛關(guān)節(jié)數(shù)相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清IL-17濃度比較 4組血清IL-17水平對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，多關(guān)節(jié)型JIA組血清IL-17濃度均高于其他3組(P＜0.05)，對照組血清IL-17濃度均低于其他3組(P＜0.05)。見表2。

表2 4組IL-17濃度比較ng/L，±s

表2 4組IL-17濃度比較ng/L，±s

注:與病例1組比較，*P ＜0.05;與病例2組比較，#P ＜0.05;與病例3組比較，△P ＜0.05

組別IL-17病例1組(n=17)20.76 ±3.62病例2 組(n=20) 33.00 ±7.51*病例3 組(n=17) 29.63 ±5.64*#對照組(n=32) 16.16 ±3.39*#△F值54.680 P值 ＜0.001

2.2 JIA患兒IL-17水平與ESR、CRP、腫痛關(guān)節(jié)數(shù)相關(guān)性 通過Pearson相關(guān)性分析顯示，JIA患兒血清中IL-17的水平與ESR、CRP無相關(guān)性(r=0.050，P=0.721;r=0.263，P=0.055)。JIA 患兒血清中 IL-17與受累腫痛關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.433，P=0.001)。

3 討論

IL-17是近年來發(fā)現(xiàn)的前炎性細(xì)胞因子家族成員，由Th17細(xì)胞分泌，可誘發(fā)涉及炎性反應(yīng)的多種細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，具有強大的促炎作用，與多種自身免疫性疾病及炎性反應(yīng)性疾病有關(guān)［5］。有文獻報道在自身免疫性關(guān)節(jié)炎中IL-17可以作用于固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)器細(xì)胞，直接參與軟骨及骨的破壞［6］。IL-17還可以刺激于滑膜成纖維細(xì)胞釋放金屬基質(zhì)蛋白酶而促進軟骨的降解［7］。研究發(fā)現(xiàn)在JIA患兒發(fā)炎的關(guān)節(jié)中，表達IL-17的T細(xì)胞增多，且其數(shù)量與JIA的臨床分型有關(guān)，一般在擴展性少關(guān)節(jié)型JIA(較嚴(yán)重的JIA亞型)關(guān)節(jié)滑液中的數(shù)量多于持續(xù)性少關(guān)節(jié)型(較輕的JIA 亞型)［8，9］。本研究發(fā)現(xiàn) JIA 患兒血清中的IL-17水平明顯高于正常對照組，且無論是全身型，還是多關(guān)節(jié)型及少關(guān)節(jié)型其患兒血清中IL-17水平均高于正常對照組。然而，DeJager等［9］報道在多關(guān)節(jié)型及少關(guān)節(jié)型JIA患兒血清中，IL-17表達增加，而在全身型患兒血清中不增加。李瑞娟等［10］報道全身型JIA患兒血清中IL-17顯著增加，多關(guān)節(jié)型JIA患兒中IL-17水平與對照組無顯著差異。造成這種結(jié)果的原因:(1)在幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的分類診斷上把握標(biāo)準(zhǔn)不太一致。(2)留取樣本時患兒所處疾病活動度的狀態(tài)不同;且未考慮患兒的用藥情況。(3)患兒的腫痛關(guān)節(jié)數(shù)有差異。但三者均提示IL-17參與了幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)JIA患兒血清中IL-17水平顯著增高，并且與腫痛關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)，即血清中IL-17水平越高，患兒腫痛關(guān)節(jié)數(shù)越多。表明IL-17與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生關(guān)系密切，這與之前的研究發(fā)現(xiàn)在自身免疫性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)有大量IL-17［11］及在JIA患兒關(guān)節(jié)液中IL-17的表達增加［12］的結(jié)果相一致。并且在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射IL-17可以誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生［13］，而IL-17缺乏的小鼠不再發(fā)生關(guān)節(jié)炎［14］，說明IL-17的主要作用是啟動關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，與本研究結(jié)果一致，均證實IL-17在致關(guān)節(jié)炎性中起關(guān)鍵作用。其過程可能是IL-17激活滑膜細(xì)胞和炎性細(xì)胞的抗凋亡途徑，使滑膜炎性反應(yīng)進行性加重;同時IL-17還可以啟動正反饋機制，促使IL-17的產(chǎn)生增加。最終，高水平的IL-17上調(diào)或協(xié)同IL-6、TNF-α、IL-1和NO等促炎因子，通過破骨細(xì)胞活化因子促進破骨細(xì)胞增生，共同造成關(guān)節(jié)骨吸收、基質(zhì)退化、滑膜增生與炎癥及免疫細(xì)胞的浸潤［10，15］，并可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞增加血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致血管增生，滑膜增厚、血管翳形成，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞，功能受限。故我們可以推論IL-17水平越高，預(yù)示關(guān)節(jié)病變數(shù)目越多，發(fā)生功能障礙的可能性越大，致殘率越高。因此，早期阻斷IL-17的作用鏈條，有可能防止不可逆的炎性反應(yīng)及功能障礙的發(fā)生，將會顯著減少患兒關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，阻止關(guān)節(jié)炎的進展，降低致殘率，提高患兒生活水平。

JIA患兒血清中IL-17水平與CRP及ESR無明顯相關(guān)性，這與李瑞娟等［10］在JIA中的研究結(jié)果是一致的;提示ESR及CRP并不能充分反映JIA的疾病活動度，即臨床上單靠ESR及CRP來判斷疾病活動度是有一定缺陷的。而IL-17水平與JIA患兒腫痛關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)。提示IL-17可用于評價JIA病情的活動度，且較ESR護CRP更能反映疾病的嚴(yán)重程度，有助于臨床醫(yī)生判斷預(yù)后，并根據(jù)IL-17的水平制定干預(yù)方案。甚至，將來有可能根據(jù)IL-17的水平來預(yù)測JIA的發(fā)生，從而進行預(yù)防性的治療，阻止其發(fā)生。

本研究仍有一些不足之處，(1)樣本數(shù)量較少，而其入組時未考慮患兒之前的用藥情況;(2)未對治療后血清IL-17的變化做進一步研究;(3)未檢測Th17細(xì)胞及其他相關(guān)因子。這些均可能對結(jié)果造成一定的影響。

綜上所述，IL-17貫穿JIA病程的所有階段，是關(guān)節(jié)炎啟動及進行性進展的促進因素，在JIA的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。因此，IL-17是將來治療、甚至是預(yù)防JIA的新靶點。目前已有抑制IL-17的相關(guān)藥物用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的臨床藥理試驗之中，但卻未獲得一致的結(jié)果［16］，因此對于IL-17的研究還需要進一步深入。

1 Pascual V，Allantaz F，Arce E，et al.Role of interleukin-1(IL-1)in the pathogenesis of systemic onset juvenile idiopathic arthritis and clinical response to IL-1 blockade.J Experiment Med，2005，201:1479-1486.

2 Rooney M，David J，Symons J，et al.Inflammatory cytokine responses in juvenile chronic arthritis.British J Rheumatol，1995，34:454-460.

3 de Benedetti F，Massa M，Robbioni P，et al.Correlation of serum interleukin-6 levels with joint involvement and thrombocytosis in systemic juvenile rheumatoid arthritis.Arthritis Rheumatism，1991，34:1158-1163.

4 何曉琥.幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎——國際風(fēng)濕病學(xué)會聯(lián)盟新分類標(biāo)準(zhǔn)討論稿.中華兒科雜志，2002，40:154-255.

5 Yao Z，Painter SL，Macduff BM，et al.Human IL-17:a novel cytokine derived from T cells.J Immunol，1995，155:5483-5486.

6 Chabaud M，Lubberts E，Joosten L，et al.IL-17 derived from juxta-articular bone and synovium contributes to joint degradation in rheumatoid arthritis.Arthritis Research，2001，3:168-177.

7 Koshy PJ，Henderson N，Logan C，et al.Interleukin 17 induces cartilage collagen breakdown:novel synergistic effects in combination with proinflammatory cytokines.Annals Rheumatic Diseases，2002，61:704-713.

8 Kurts C.Th17 cells:a third subset of CD4+T effector cells involved in organ-specific autoimmunity.Nephrology，dialysis，transplantation:official publication of the European Dialysis and Transplant Association-European Renal Association，2008，23:816-819.

9 de Jager W，Hoppenreijs E，Wulffraat N，et al.Blood and synovial fluid cytokine signatures in patients with juvenile idiopathic arthritis:a crosssectional study.Annals Rheumatic Diseases，2007，66:589-598.

10 李瑞娟，唐雪梅，劉瑋，等.幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎白介素6、γ干擾素誘導(dǎo)蛋白10和白介素17的表達及意義.中華兒科雜志，2013，51:472-476.

11 Nistala K，Newton K，Varsani H，et al.Interleukin-17-producing T cells are enriched in the joints of children with arthritis，but have a reciprocal relationship to regulatory T cell numbers.Arthritis Rheumatism，2008，58:875-887.

12 Agarwal S，Misra R，Aggarwal A.Interleukin 17 levels are increased in juvenile idiopathic arthritis synovial fluid and induce synovial fibroblasts to produce proinflammatory cytokines and matrix metalloproteinases.J Rheumatol，2008，35:515-519.

13 Lubberts E，Joosten LAB，van de Loo FAJ，et al.Overexpression of IL-17 in the knee joint of collagen type II immunized mice promotes collagen arthritis and aggravates joint destruction.Inflammation research:official journal of the European Histamine Research Society，2002，51:102-104.

14 Nakae S，Nambu ASK，Iwakura Y.Suppression of immune induction of collagen-induced arthritis in IL-17-deficient mice.The Journal of Immunology，2003，171:6173-6177.

15 Afzali B，Lombardi G，Lechler R，et al.The role of T helper 17(Th17)and regulatory T cells(Treg)in human organ transplantation and autoimmune disease.Clinical Experiment Immunol，2007，148:32-46.

16 Kellner H.Targeting interleukin-17 in patients with active rheumatoid arthritis:rationale and clinical potential.Therapeutic Advances Musculoskeletal Disease，2013，5:141-152.