多發(fā)性骨髓瘤患者 DAPK的表達(dá)及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的研究

游崇登 何勤 劉琳 朱鴻斌 湯宏宇 張利娟 賀振新

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞的惡性腫瘤。是多發(fā)于老年患者的一種血液系統(tǒng)惡性疾病，其自然病程具有高度異質(zhì)性，中位生存期為3～4年。隨著硼替佐米等蛋白酶體抑制劑及沙利度胺、雷利度胺等免疫調(diào)節(jié)劑的臨床應(yīng)用，MM的完全緩解率(complete remission，CR)及總生存期(overall survival，OS)有了顯著提高，但復(fù)發(fā)、難治仍是臨床面臨的巨大難題，至今MM仍是一種無法治愈的疾病。DNA甲基化是血液腫瘤抑癌基因失活的常見機(jī)制。死亡相關(guān)蛋白激酶(death-associated protein kinase，DAPK)是Deiss等［1］在功能性基因克隆中首先發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其位于人類第9號染色體的q34.1，編碼序列全長4 293 bp，廣泛參與多種途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。DAPK具有參與細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移等生物學(xué)功能。DAPK基因啟動子區(qū)甲基化對疾病的進(jìn)展及預(yù)后影響不一。本文采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)技術(shù)，從DNA甲基化和基因表達(dá)的方面研究MM患者及對照組的骨髓單個核細(xì)胞中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率及其mRNA的表達(dá)水平，探討它們之間可能存在的關(guān)系及與臨床特征的相關(guān)性，并研究DAPK基因在MM發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年1月至2011年6月確診的54例多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)組，標(biāo)本來自昆明醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科和附屬第二醫(yī)院血液科，其中男35例，女19例;年齡38～79歲，平均年齡(63±9)歲，中位年齡64歲。包括初診患者27例，復(fù)發(fā)患者27例。Druie-Salmon分期:Ⅰ期A組2例，Ⅱ期A組16例，Ⅱ期B組4例，Ⅲ期A組19例，Ⅲ期B組13例。分型:lgG型26例，lgA型14例，未分泌型9例，輕鏈型5例。所有病例診斷均符合標(biāo)準(zhǔn)［2］。對照組為非血液腫瘤患者骨髓標(biāo)本(主要為營養(yǎng)不良性性貧血和免疫性血小板減少癥患者)40例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器:DNA提取試劑盒，RNA提取試劑盒為杭州Axygen Bioscigens公司產(chǎn)品。EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，Zymo Taq PreMix TM Kit為美國ZYMO Research公司產(chǎn)品。TRIzol Reagent抽提液，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Kit等購自美國Invitrogen公司。PCR擴(kuò)增儀，qPCR擴(kuò)增儀和全自動凝膠圖像分析儀均為美國Bio-rad公司的產(chǎn)品。

引物設(shè)計(jì)目前通常選擇“MethPrimer”程序，對目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp內(nèi)CpG島位進(jìn)行引物設(shè)計(jì)?！癕ethPrimer”設(shè)計(jì)程序默認(rèn)的 CpG島跨度至少為200 bp，GC含量＞50%，CpG出現(xiàn)頻率＞0.6。因此，符合這些參數(shù)的區(qū)域都默認(rèn)為 CpG島。我們可以根據(jù)任意1個CpG島設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。本文的DAPK基因甲基化引物來自文獻(xiàn)［3］，由上海invitrogen公司合成引物，用去離子水溶解為25 μmol/L，－20℃保存?zhèn)溆?。見?。

表1 MSP引物信息

1.2.2 標(biāo)本的收集及處理:采集實(shí)驗(yàn)組及對照組的骨髓標(biāo)本，并進(jìn)行骨髓單個核細(xì)胞(MNC)的分離，用PBS緩沖液稀釋細(xì)胞數(shù)至1×108/ml，分別分裝到去RNA酶的 Eppendorf管中，－80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MSP法檢測DAPK基因甲基化的狀態(tài):提取基因組DNA:基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。MSP擴(kuò)增:DAPK甲基化上游引物:5＇-GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC-3＇，下游引物:5＇-CCCTCCCAAACGCCGA-3＇，擴(kuò)增片段長度為98bp;非甲基化上游引物:5＇-GGAGGATAGTTGGATTGAGTTAATGTT-3 ＇，下 游 引 物:5 ＇-CAAATCCCTCCCAAACACCAA-3’，擴(kuò)增片段長度為106 bp。引物參考外文文獻(xiàn)和引物設(shè)計(jì)軟件分析設(shè)計(jì)。PCR擴(kuò)增反應(yīng):瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)全自動凝膠圖像分析儀在紫外燈下顯影照相，根據(jù)特異性條帶的有無，分別記為陽性和陰性。

1.2.4 RT-PCR檢測 DAPK mRNA 的表達(dá)情況:①RT-qPCR反應(yīng)體系。將提取的RNA用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis SuperMix Kit將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA保存。取 cDNA 4 μl，加入上下游引物各1 μl，Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG 25 μl，加入 RNase-Free ＆DNase-Free ddH2O 19 μl，構(gòu)成總體積50 μl的反應(yīng)體系。在反應(yīng)條件是50℃、95℃預(yù)變性各2 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40 個循環(huán)，65～95℃溶解曲線1 min下進(jìn)行PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中以GAPDH作為內(nèi)標(biāo)基因，以標(biāo)準(zhǔn)化各個標(biāo)本中DAPK基因相對表達(dá)量，以Hela及HEPG2為質(zhì)控，以DAPK基因作為目的基因。②結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):反應(yīng)的數(shù)據(jù)由Bio-Rad CFX軟件進(jìn)行收集及分析。通過目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)行樣本間相對定量的比較。所有數(shù)值以相對于GAPDH基因升高或減少的倍數(shù)(Fold)表示。所有標(biāo)本的基因復(fù)制的數(shù)值均以閾值循環(huán)(Cycle threshold Ct)表達(dá)。具體如下:目的基因的表達(dá)量=2－△△Ct，△△Ct=(Ct目的基因 －Ct內(nèi)標(biāo)基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因 －Ct內(nèi)標(biāo)基因)對照組，表示的是實(shí)驗(yàn)組目的基因相對于對照組的變化倍數(shù)，使用這一方法可直接得到目的基因相對于內(nèi)參基因組的定量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，基因表達(dá)分析首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，如果符合正態(tài)分布以±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn);如果計(jì)量資料不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)±四分位數(shù)間距進(jìn)行描述，采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)一步做組間的兩兩比較，為了減少I類誤差，將原來的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05調(diào)整為α=α/比較次數(shù)，即P≤α?xí)r差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組及對照組DAPK甲基化的表達(dá)情況 實(shí)驗(yàn)中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為18.52%(10/54);對照組DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率為0(0/40)。采用校正χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.500，P＜0.05)。見圖1、2。

圖1 部分實(shí)驗(yàn)組樣本DAPK基因啟動子區(qū)甲基化電泳圖

圖2 部分對照組樣本DAPK基因啟動子區(qū)甲基化電泳圖

2.2 MM患者DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與部分臨床特征的相關(guān)性 (1)性別:男性患者陽性率14.29%(5/35)，女性患者陽性率 26.32%(5/19)，χ2=0.518，P＞0.05。(2)年齡:≥65 歲者陽性率23.08%(6/26)，＜65 歲者陽性率 14.29%(4/28)，χ2=0.231，P＞0.05。(3)分期:Ⅰ + Ⅱ期者陽性率31.82%(7/22)，Ⅲ期者陽性率 9.38%(3/32)，χ2=2.992，P＞0.05。(4)分組:A 組者陽性率 21.62%(8/37)，B 組者陽性率13.33%(2/15)，χ2=0.089，P＞0.05。(5)是否初治:初治組者陽性率18.52%(5/27)，復(fù)發(fā)組陽性率18.52%(5/27)，χ2=0.000，P＞0.05。差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(注:①～④校正χ2檢驗(yàn)，⑤χ2檢驗(yàn))。

2.3 DAPK mRNA表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)分析(目的與內(nèi)參基因溶解曲線，溶解曲線為單一峰值，說明引物設(shè)計(jì)合理，可進(jìn)行相對表達(dá)量的計(jì)算。見圖3、4。

圖3 DAPK mRNA溶解曲線

圖4 GADPH mRNA溶解曲線

2.3.1 M組和對照組DAPK基因mRNA比較:在MM組為(1.09 ±1.35)Fold，對照組為(1.26 ±1.38)Fold，采用 Wilcoxon 兩樣本比較法，Z= －1.579，P＞0.05。

2.3.2 甲基化組、非甲基化組、對照組3組間兩兩比較:①甲基化組與非甲基化組:(0.76±1.09)Fold VS(1.18 ±1.28)Fold，Z= －1.414，P＞0.0167。②甲基化組與對照組:(0.76 ±1.09)Fold VS(1.26 ±1.38)Fold，Z= －2.292，P＞0.0167。③非甲基化組與對照組:(1.18 ±1.28)Fold VS(1.26 ±1.38)Fold，Z=－1.003，P＞0.0167。

2.3.3 初診組、復(fù)發(fā)組、對照組3組間兩兩比較:①初診組與復(fù)發(fā)組:(0.98 ±1.19)Fold VS(1.17 ±1.72)Fold，Z= －0.978，P＞0.0167。②初診組與對照組(0.98 ± 1.19)Fold VS(1.26 ± 1.38)Fold，Z=－2.045，P＞0.0167。③復(fù)發(fā)組與對照組:(1.17 ±1.72)FoldVS(1.26 ± 1.38)Fold，Z= － 0.588，P＞0.0167。

2.4 DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性標(biāo)本測序結(jié)果分析 將本實(shí)驗(yàn)表達(dá)DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性的標(biāo)本送上海Invitrogen公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果運(yùn)用DNAstar軟件進(jìn)行拼接，再用BIQ analyzer軟件進(jìn)行分析，如果甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果與非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果對比見C→T，則證明該樣本確實(shí)存在DAPK基因啟動子區(qū)甲基化。經(jīng)測序證實(shí)10例DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性標(biāo)本確實(shí)存在甲基化。這兩者比較從圖中可見有10處基因位點(diǎn)從C→T，提示該標(biāo)本確實(shí)存在DAPK基因啟動子區(qū)的甲基化。見圖5。

圖5 1例送檢MM樣本中DAPK基因甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物(橙色標(biāo)記)與非甲基化擴(kuò)增產(chǎn)物(紫色標(biāo)記)序列對比圖

2.5 DAPK基因mRNA在實(shí)驗(yàn)組和對照組中的表達(dá)情況 采用Wilcoxon兩樣本比較法，對所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得 Z值 －1.579，P=0.114;DAPK 基因 mRNA 在 MM 組為(1.09 ±1.35)Fold，對照組為(1.26 ±1.38)Fold，實(shí)驗(yàn)組與對照組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明DAPK基因mRNA的表達(dá)水平在MM組和對照組無差異。

54例MM患者中，根據(jù)DAPK基因啟動子區(qū)甲基化情況，可分為甲基化組、非甲基化組。采用Kruskal-Wallis法對 3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得，χ2=0.859，P=0.088，P＞0.05，表明3組之間 DAPK 基因 mRNA 表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對這3組進(jìn)行組間兩兩比較時，應(yīng)調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)(0.5/3≈0.0167)，即P＜0.0167時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示三者的P值均＞0.0167，表明在甲基化組、非甲基化組及對照組中DAPK基因mRNA表達(dá)水平無差異。

54例MM患者中，根據(jù)是否接受治療，可分為初診組和復(fù)發(fā)組。采用Kruskal-Wallis法對3組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得 χ2=3.764，P=0.152，表明 3 組之間 DAPK基因mRNA表達(dá)水平相比較，無顯著性差異。對這3組進(jìn)行組間兩兩比較時，應(yīng)調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)(0.5/3≈0.0167)，即P＜0.0167時，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果顯示三者的P值均＞0.0167，即初診組、復(fù)發(fā)組及對照組中DAPK基因mRNA表達(dá)水平無差異。

3 討論

DAPK基因是一種鈣離子與鈣調(diào)素依賴的絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，是IFN-γ介導(dǎo)的正性細(xì)胞凋亡促進(jìn)因子，廣泛參與多種途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。近年來，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化與腫瘤的關(guān)系倍受關(guān)注，已在宮頸癌、結(jié)腸癌組、肝細(xì)胞癌等多種實(shí)體腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)DAPK基因啟動子區(qū)域CpG島高頻率甲基化。有研究發(fā)現(xiàn)，DAPK表達(dá)缺失的垂體腺瘤往往更具有侵襲性，乳腺癌中DAPK表達(dá)減少與患者的生存期成負(fù)相關(guān)，與腫瘤的復(fù)發(fā)成正相關(guān)［3］。DAPK啟動子區(qū)高甲基化致DAPK缺失已證實(shí)在B細(xì)胞惡性腫瘤如濾泡性淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤中為常見現(xiàn)象［4］。研究發(fā)現(xiàn)在MM中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率在 5.9% ～30%［5－7］，本研究中MM患者DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率為18.52%(10/54)，與報(bào)道的陽性率較接近;而40例對照組中甲基化陽性率為0(0/40)，提示DAPK基因啟動子區(qū)甲基化在MM的發(fā)病中具有一定的作用。

Eleftheria等［8］研究發(fā)現(xiàn)，DAPK基因在 MM 中甲基化的陽性率雖不高(4/68)，但與預(yù)后不良的指標(biāo)如高肌酐水平、高鈣、分期為Ⅲ期等顯著相關(guān)，總生存期明顯低于陰性患者。本研究發(fā)現(xiàn)，DAPK基因啟動子區(qū)在MM中的高甲基化與MM患者的某些臨床特征存在一定的相關(guān)性:(1)與分期的關(guān)系:Ⅰ期和Ⅱ期的甲基化陽性率為31.82%(7/22)、Ⅲ期的甲基化陽性率為9.38%(3/32)，Ⅰ期、Ⅱ期與Ⅲ期相比，DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率差異無統(tǒng)計(jì)意義，提示DAPK基因啟動子區(qū)甲基化可能是MM發(fā)病的早期事件，這與Ng等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。(2)與分型的關(guān)系:IgG型MM的DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率明顯高于對照組(P＜0.01)，這進(jìn)一步表明DAPK基因啟動子區(qū)甲基化參與了MM的發(fā)生發(fā)展。(3)與性別和年齡的關(guān)系:DAPK基因啟動子區(qū)甲基化的陽性率與性別和年齡無關(guān)。(4)與治療的關(guān)系:在初診組和復(fù)發(fā)組中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率都為18.52%(5/27)，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步表明DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性狀態(tài)與治療無關(guān)，但亦可能是因?yàn)闃颖玖枯^少、患者接受治療的不均一性和傳統(tǒng)治療藥物很少具有逆轉(zhuǎn)甲基化作用等有關(guān)，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。

同時MM患者的DAPK基因mRNA表達(dá)量低于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，考慮與樣本量不足有關(guān);DAPK基因mRNA表達(dá)量甲基化組低于非甲基化組及對照組，與基因甲基化使基因表達(dá)沉默理論相符，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0167)，考慮其原因與樣本較少有關(guān)。初診組和復(fù)發(fā)組中DAPK基因啟動子區(qū)甲基化陽性率相同，而初診組的DAPK基因mRNA表達(dá)量低于復(fù)診組和對照組，雖然差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.01)，但考慮到基因甲基化并非是基因表達(dá)沉默的唯一機(jī)制，國外Raveh等［10－12］研究也提示除啟動子高度甲基化是DAPK基因在人類腫瘤中失活的主要機(jī)制外，可能還同時存在其他機(jī)制導(dǎo)致該基因表達(dá)沉默，如基因雜合缺失［10］、基因純合缺失［11，12］。需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究證實(shí)。

綜上所述，DAPK基因作為與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的重要抑癌基因，其甲基化的異常在多發(fā)性骨髓瘤中確實(shí)存在，MSP方法靈敏性高，因此使用MSP方法檢測DAPK基因的甲基化狀態(tài)將有可能成為檢測MM微小殘留病的一個指標(biāo)［13］，去甲基化的藥物可能是一種有效的治療方法［14］。

1 Deiss LP，F(xiàn)einstein E，Berissi H，et al.Identification of a novel serine/threonine kinase and a novel 15-kD protein as potential mediators of the gamma interferon-induced cell death.Genes Dev，1995，9:15-30.

2 張之南，沈悌主編.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn).第3版.北京:科學(xué)出版社，2007.232-235.

3 Dawson MA，Kouzarides T.Cancer epigenetics:from mechanism to therapy.Cell，2012，150:12-27.

4 Rossi D，Capello D，Gloghini A，et al.Aberrant promoter methylation of multiple genes throughout the clinico-pathologic spectrum of B-cell neoplasia.Haematologica，2004，89:154-164.

5 Braggio E，Maiolino A，Gouveia ME，et al.Methylation status of nine tumor suppressor genes in multiple myeloma.Int J Hematol，2010，91:87-96.

6 Yuregir OO，Yurtcu E，Kizilkilic E，et al.Detecting methylation patterns of p16，MGMT，DAPK and E-cadherin genes in multiple myeloma patients.Int J Lab Hematol，2010，32:142-149.

7 Martin P，Garcia-Cosio M，Santon A，et al.Aberrant gene promoter methylation in plasma cell dyscrasias.Exp Mol Pathol，2008，84:256-261.

8 Eleftheria H，Aggeliki D，Leonidas B，et al.Study of specific genetic and epigenetic variables in multiple myeloma.Leukemia Lymphoma，2010，51:2270-2274.

9 Ng MH，To KW，Lo KW，et al.Frequent death-associated protein kinase promoter hypermethylation in multiple myeloma.Clin Cancer Res，2001，7:1724-1729.

10 Raveh T，Kimchi A.DAP kinase-a proapoptotic gene that functions as a tumor suppressor.Exp Cell Res，2001，264:185-192.

11 Kawaguchi K，Oda Y，Saito T，et al.Death-associated protein kinase(DAP kinase)alteration in soft tissue leiomyosarcoma:Promoter methylation or homozygous deletion is associated with a loss of DAP kinase expression.Hum Pathol，2004，35:1266-1271.

13 Brian AW，Gareth JM.Could DNA methylation become a useful measure for multiple myeloma prognoses.Expert Rev Hematol，2011，4:125-127.

14 N Shenker，JM Flanagan.Intragenic DNA methylation:implications of this epigenetic mechanism for cancer research.Brit J of Cancer，2012，106:248-253.