正交設(shè)計(jì)優(yōu)化芒果SRA—CR反應(yīng)體系及引物篩選

趙英　付海天　周俊岸　李日旺　莫永龍　張宇　黃國(guó)弟

摘要：以芒果基因組DNA為模板，采用正交試驗(yàn)對(duì)模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行3因素5水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明，相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性CR（sequence related amplified polymorphism，SRA-CR）最佳反應(yīng)體系為：30 ng 模板DNA、03 μmol/L 引物、0 μL 2×Taq CR Master Mix，總體積為25 μL。運(yùn)用該體系對(duì)0份芒果種質(zhì)材料進(jìn)行驗(yàn)證，證明該體系穩(wěn)定可靠，并從00對(duì)引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的36對(duì)引物組合。

關(guān)鍵詞：芒果；SRA標(biāo)記；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化；引物篩選

中圖分類號(hào)： Q9432；S667703文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：002-302（204）2-004-03

芒果（Mangifera indica L）為漆樹科常綠果樹，是著名的熱帶亞熱帶水果，享有“熱帶果王”之美譽(yù)，為世界五大名果之一。近年來(lái)由于我國(guó)芒果種質(zhì)資源的深入挖掘利用以及芒果育種的進(jìn)步，特別是國(guó)外引進(jìn)品種的增多，芒果種質(zhì)資源日益豐富，為芒果的品種創(chuàng)新奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)芒果遺傳多樣性鑒定和新品種測(cè)試與保護(hù)工作提出了新的挑戰(zhàn)。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence related amplified polymorphism，SRA）是Li等于200年發(fā)明的一種新的標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)集隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAD）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFL）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一體，具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、在基因組中分布均勻等優(yōu)點(diǎn)。目前已應(yīng)用于蘋果、柑橘類果樹、櫻桃、大蒜、棉花、水稻、澳洲堅(jiān)果[2]、菠蘿、桃、花生[3]、番木瓜[4]等，但至今尚未見SRA分子標(biāo)記應(yīng)用于我國(guó)芒果遺傳多樣性分析、分類鑒定等方面的報(bào)道。[3]筆者在開展芒果遺傳多樣性及其親緣關(guān)系研究的過程中發(fā)現(xiàn)，SRA-CR條件的變化會(huì)得到不同的結(jié)果，影響芒果的遺傳多樣性評(píng)價(jià)，因此構(gòu)建適用于芒果的SRA-CR體系至關(guān)重要。

[3]本試驗(yàn)以0份芒果種質(zhì)為材料，借鑒其他作物的研究成果，就影響芒果SRA-CR反應(yīng)的因素進(jìn)行探索，建立了適合芒果SRA分析的反應(yīng)條件及體系，旨在為芒果種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新、分子標(biāo)記輔助育種等提供技術(shù)幫助，為近一步開展芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

試驗(yàn)材料

參試芒果種質(zhì)共0份，均采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃。選取芒果健康植株上的無(wú)病蟲嫩葉，采摘洗凈后于-70 ℃保存，反應(yīng)體系的優(yōu)化以金煌芒DNA為模板完成，供試品種見表。

2試驗(yàn)方法

2DNA的提取和檢測(cè)芒果基因組DNA的提取參照何新華等的CTAB法[5]，并稍加改良，利用0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，根據(jù)樣品D260 nm/D280 nm計(jì)算DNA純度，根據(jù)D260 nm值計(jì)算樣品DNA的濃度，并稀釋至0 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

22SRA-CR反應(yīng)條件參考Li等所用引物[，6]，設(shè)計(jì)0條正向引物和0條反向引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。選用引物Me9與Em9進(jìn)行體系優(yōu)化，試驗(yàn)重復(fù)2次。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 min，35 ℃退火 min，72 ℃延伸5 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃預(yù)變性 min，50 ℃ 退火 min，72 ℃ 延伸 5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸0 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩R產(chǎn)物用20%瓊脂糖凝膠在 05×TBE 電泳緩沖液中、85 W條件下電泳5 h，采用核酸染料染色法進(jìn)行條帶檢測(cè)。電泳結(jié)束后，于凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)并拍照，依照擴(kuò)增條帶的敏感性與特異性，即條帶的強(qiáng)弱及雜帶的多少來(lái)判斷各體系的優(yōu)劣。

24優(yōu)化體系的穩(wěn)定性檢測(cè)及引物篩選隨機(jī)選擇6對(duì)SRA引物組合對(duì)優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證，確定芒果SRA-CR的最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件，并對(duì)00條引物組合進(jìn)行CR擴(kuò)增，篩選多態(tài)性引物。

2結(jié)果與分析

2芒果基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

DNA的提取質(zhì)量是決定SRA-CR擴(kuò)增效果的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)以芒果嫩葉為材料，對(duì)0份芒果種質(zhì)材料的基因組DNA 進(jìn)行提取，最后得到的DNA呈透明絮狀，電泳后條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象（圖）。經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，所用DNA樣品的D260 nm/D230 nm值均在20～25之間，D260 nm/D280 nm 值均在7～9之間，表明所提取的DNA質(zhì)量較高，符合試驗(yàn)要求。

[FK（W0][TZYtif][FK）]

22正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果分析

由圖2可見，25個(gè)芒果正交試驗(yàn)處理的SRA-CR擴(kuò)增結(jié)果存在著一定的差異。從2次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，、6、0、4、5、22號(hào)處理譜帶少且不清晰，4、5、8、9、2、3與7號(hào)組合的譜[2]帶清晰，亮度、重復(fù)性好。綜合擴(kuò)增條帶的數(shù)目、強(qiáng)弱、清晰度、可分辯率與節(jié)約成本等指標(biāo)，確定組合8號(hào)是比較理想的擴(kuò)增模式體系，即25 μL反應(yīng)體系中含30 ng DNA，03 μmol/L 引物，25 μL 2×Taq CR Master Mix。

23引物篩選

以隨機(jī)選取的芒果DNA作模板，用00對(duì)引物進(jìn)行CR擴(kuò)增，從中選擇擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性高的適合芒果種質(zhì)鑒定的引物進(jìn)行正式擴(kuò)增。根據(jù)擴(kuò)增條帶的多少、清晰度、穩(wěn)定性和多態(tài)性高低，最終從所合成的00對(duì)引物中篩選出36對(duì)引物用于SRA擴(kuò)增（表5）。

24SRA 優(yōu)化體系在不同芒果種間的擴(kuò)增

根據(jù)上述試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果，隨機(jī)選取Me6與Em引物組合來(lái)對(duì)0份芒果種質(zhì)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以進(jìn)一步驗(yàn)證該擴(kuò)增反應(yīng)體系的效果。由圖3可以看出，引物Me6與Em不

但對(duì)0份芒果種質(zhì)均能擴(kuò)增出較好的條帶，而且也存在著很明顯[CM（25]的多態(tài)性條帶，由此說(shuō)明所優(yōu)化的擴(kuò)增體系比較可靠，適合芒果種質(zhì)的SRA分析研究。

3結(jié)論與討論

CR反應(yīng)體系的優(yōu)化方法主要有3種：?jiǎn)我蛩卦囼?yàn)、均勻試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相對(duì)單因素試驗(yàn)而言具有試驗(yàn)次數(shù)較少、效用明確且能較快地獲得極佳的試驗(yàn)結(jié)果的特點(diǎn)，避免了單一因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。目前，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)已成功應(yīng)用于棗、價(jià)廉草、花生、番石榴等植物的 SRA-CR 反應(yīng)體系優(yōu)化[7]，但在芒果上還未曾見報(bào)道。本試驗(yàn)通過正交設(shè)計(jì)，對(duì)影響芒果SRA 反應(yīng)體系的模板DNA含量、引物濃度、2×Taq CR Master Mix含量進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適用于芒果的最優(yōu)SRA反應(yīng)體系，即25μL反應(yīng)體系中包含30 ng 模板DNA、03μmol/L 引物、0μL 2×Taq CR Master Mix。同時(shí)，在00個(gè)引物組合中，共得到多態(tài)性引物組合36個(gè)。該反應(yīng)體系及36個(gè)多態(tài)性引物組合可用于芒果種質(zhì)遺傳多樣性分析、系統(tǒng)發(fā)育和育種應(yīng)用等方面，同時(shí)也為芒果品種鑒定、親緣關(guān)系分析及優(yōu)良新品種的選育等提供技術(shù)參考。

影響SRA-CR反應(yīng)的因素相對(duì)復(fù)雜，不同植物適應(yīng)的SRA 反應(yīng)體系不同，且各因素之間存在著相互效應(yīng)，只有各因子之間的濃度配比達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)才能得到穩(wěn)定、可重復(fù)的擴(kuò)增結(jié)果。因此，SRA標(biāo)記應(yīng)用到不同物種上時(shí)需要優(yōu)化反應(yīng)體系和條件。在芒果SRA 體系優(yōu)化的過程中，發(fā)現(xiàn)DNA模板含量、2×Taq CR Master Mix含量及引物濃度等均會(huì)影響SRA擴(kuò)增效果，但模板DNA含量對(duì)擴(kuò)增無(wú)明顯影響（20～60 ng 之間均有穩(wěn)定的擴(kuò)增），這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[2，8-0]。可見，對(duì)芒果SRA 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化是非常必要的。

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