部分景天屬植物DNA條形碼引物的篩選

張洋，郝海葉，那冬晨

(山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004)

景天屬(Sedum)植物多為一年生或多年生草本，大多為肉質(zhì)植物，莖葉多汁液，耐旱性極強(qiáng)，花朵美麗，花色豐富。植株矮小，株高20～50 cm。景天屬在我國(guó)共有124種，1亞種，14變種以及1變型，大多數(shù)產(chǎn)于熱帶干旱地區(qū)，主要野生于巖石地帶、山坡石縫、林下石質(zhì)坡地、山谷石崖等處。喜光照，適生溫度為15～18℃，部分種耐陰，對(duì)土質(zhì)要求不嚴(yán)［1］。喜濕潤(rùn)，但忌澇［2］，性耐寒，宜于砂壤土生長(zhǎng)。

DNA條形碼(DNAbarcoding)是利用DNA片段快速鑒別物種的基因工具，可通過(guò)比對(duì)一段較短的DNA序列進(jìn)行物種鑒定。在理論上，這段短序列可以區(qū)分并鑒定地球上所有物種。構(gòu)建DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用該項(xiàng)技術(shù)鑒別己知物種和發(fā)現(xiàn)新物種，是目前分子生物學(xué)和分類學(xué)發(fā)展的最新方向［3］。筆者以部分景天屬植物為材料，尋找該屬植物DNA條形碼的適宜引物，為確定該屬植物的DNA條形碼序列、快捷有效地鑒別該屬植物奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可促進(jìn)該屬植物親緣學(xué)和化學(xué)分類學(xué)等的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 佛甲草、八寶景天、華北景天、費(fèi)菜、垂盆草。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取。分別采摘上述5種植物生長(zhǎng)良好的嫩葉，進(jìn)行葉綠體DNA和核DNA的分步提?。?－6］。所得DNA于－20℃冰箱保存。

1.2.2 引物篩選。參考相關(guān)的DNA條形碼通用序列研究資料，結(jié)合景天屬植物的形態(tài)特征和生理特征，初步選取psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS2、matK 作為候選序列(表1)。

表1 候選引物序列

對(duì)上述6對(duì)候選序列引物進(jìn)行篩選，并進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化。各對(duì)引物相應(yīng)的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)條件見(jiàn)表3。其中matK序列需要進(jìn)行2次PCR擴(kuò)增，第2次擴(kuò)增以第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用同樣的反應(yīng)條件進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

表2 PCR反應(yīng)體系 μl

表3 PCR反應(yīng)條件

1.2.3 電泳檢測(cè)。提取的核DNA和葉綠體DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè);PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體DNA序列引物的篩選

2.1.1 psbA-trnH、ropB、rpoC1。研究表明，psbA-trnH、ropB、rpoC1 3對(duì)引物均可作為景天屬植物的DNA條形碼引物。3對(duì)引物的擴(kuò)增率都達(dá)到100%，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為250～450 bp、500 bp 左右、500 ～650 bp，且種間差異明顯，種內(nèi)差異較小(圖1～3)。

2.1.2 rbcL、matK。研究表明，rbcL、matK 2 對(duì)引物不適合作為景天屬植物DNA條形碼的引物。其中rbcL序列的擴(kuò)增率僅為40%，擴(kuò)增出來(lái)的片段大小在750 bp左右。matK序列經(jīng)過(guò)2次擴(kuò)增未能檢測(cè)到相關(guān)產(chǎn)物。

2.2 核DNA序列引物的篩選 ITS2序列PCR擴(kuò)增率也達(dá)到100%，擴(kuò)增片段大小為700～750 bp(圖4)。

3 結(jié)論與討論

(1)該試驗(yàn)最終在 psbA-trnH、ropB、rbcL、rpoC1、ITS 2、matK 6對(duì)引物中成功篩選出3對(duì)葉綠體DNA引物對(duì)(psbA－trnH、ropB、rpoC1)和1對(duì)總DNA引物對(duì)(ITS 2)。這4對(duì)引物可以進(jìn)行相互組合，從而能更好地對(duì)景天屬植物進(jìn)行分類。

(2)據(jù)文獻(xiàn)記載，ITS2序列大小一般在400～500 bp，而該試驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，結(jié)果顯示ITS 2序列大小為700～750 bp;另有文獻(xiàn)顯示一些景天科植物中rbcL的擴(kuò)增率達(dá)100%，該試驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù)，擴(kuò)增率均不超過(guò)40%。以上差異之處還有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］那冬晨，任彩琴，柴婷婷，等.華北景天葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)水分脅迫的響應(yīng)［J］.北方園藝，2011(17):96 －98.

［2］那冬晨，王文斗，楊麗靜，等.水分脅迫對(duì)華北景天葉片結(jié)構(gòu)和葉綠素含量的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(26):15902 －15903，15912.

［3］王歡歡，郭春景，張興，等.輻射八寶景天ISSR遺傳多樣性分析［J］.北方園藝，2010(9):149－151.

［4］李春霞，李宏飛.CTAB法高效提取蘋果葉片DNA的研究［J］.北方園藝，2009(2):49－52.

［5］郝海葉，張洋，那冬晨.景天屬植物葉綠體DNA與核DNA分步提取方法研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(25):10230 －10231.

［6］王文斗，段英俊，那冬晨.植物總 DNA提取方法的改進(jìn)［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(24):9913，9923.