瓊脂糖—纖維蛋白平板法測(cè)定納豆凍干粉中納豆激酶活性

楊祖?zhèn)ァ∴囋滦?/p>

摘要：用瓊脂糖-纖維蛋白平板法對(duì)納豆凍干粉中納豆激酶活性進(jìn)行測(cè)定，在檢測(cè)酶濃度單位在2000～10000U/ml時(shí)呈現(xiàn)很好的2次曲線關(guān)系，蚓激酶濃度單位-兩垂直直徑的乘積回歸方程為y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相關(guān)系數(shù)r2=0.9993。本法回收率范圍在89.53%～100.75%，平均回收率為94.7%，RSD為4.2%。

關(guān)鍵詞：瓊脂糖；纖維蛋白；納豆激酶；蚓激酶；平板法。

Activities of Nattokinase（NK）in Natto Freeze-dried Powder was Assessed by Agar-fibrin Plate Assay

YANG Zu-wei，DENG Yue-xin

（By-Health Co.Ltd，Zhuhai 519040，Guangdong 519040，China）

Abstract：The activities of Nattokinase（NK）in natto freeze-dried powder was assessed by agar-fibrin plate assay，it displays a good quadratic relations under the enzyme concentration of 0.30%～0.40%.The product of the regression equation between concentration of vermis kinase and two vertical diameter was y=-0.0000004839x2+0.02203-12.2715，The correlation coefficient was 0.9993.The recovery of the method was found to be in the range of 89.53%-100.75%，the average recovery was 94.7%，RSD=4.2%。

Key words：Agarose； Fibrin； Nattokinase； Lumbrokinase； Plate method

納豆（Natto）是，以大豆為原料由納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilis var.natto）發(fā)酵而成。納豆激酶（Nattokinase，NK）是納豆中的一種絲氨酸蛋白酶，具有強(qiáng)烈溶栓功效，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)該酶，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，藥效時(shí)間長(zhǎng)，而且安全性好，無(wú)任何毒副作用，成為新一代理想的預(yù)防和治療栓塞的生化藥物[1，2]。測(cè)定納豆激酶活力的方法主要有瓊脂糖-纖維蛋白平板法[3]、纖維蛋白塊溶解時(shí)間法[4]、四肽底物法[5]、血清板法[6]和酶聯(lián)反應(yīng)吸附法[7]等。目前瓊脂糖-纖維蛋白平板法是目前用的比較多的一種方法，是將瓊脂糖、血纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。其原理是以凝血酶和纖維蛋白原作用生成的交聯(lián)纖維蛋白為底物，酶活與溶解圈面積成線性關(guān)系，故可用溶解面積來(lái)表示納豆激酶的溶纖維活性。

本文用瓊脂糖-纖維蛋白平板法對(duì)納豆凍干粉中納豆激酶活性進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)該法的線性關(guān)系，重現(xiàn)性，回收率進(jìn)行了考察。

1資料與方法

1.1一般資料 生化培養(yǎng)箱，分析天平，打孔器（2mm），游標(biāo)卡尺，pH計(jì)，恒溫水浴鍋，瓊脂糖，塑料培養(yǎng)皿（直徑14cm），牛纖維蛋白原（牛血）、取凝血酶（牛血）、蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定所。

1.2試劑配制 工作溶液：取十二水磷酸氫二鈉0.716g和氯化鈉1.8g，加水溶解并稀釋至200ml，此為A液；取二水磷酸二氫鈉0.156g，加水溶解并稀釋至100ml，此為B液，將A、B兩液混合至pH7.8。1.5%瓊脂糖溶液：取瓊脂糖0.6g，加工作溶液40ml，加熱溶解，置55℃水浴中保溫。纖維蛋白原液：取牛纖維蛋白原（牛血）60mg，加工作溶液40ml溶解，在37℃水浴中保溫。凝血酶溶液：取凝血酶（牛血），加適量工作溶液制成每1ml中含6 BP單位的溶液。蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品分別制成為每1ml中含2000、4000、6000、8000、10000U蚓激酶的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將在55℃保溫的1.5%瓊脂糖溶液40ml加入在37℃水浴中保溫的纖維蛋白原液40ml中，邊搖勻邊加入，再立即加入凝血酶溶液1ml，立即混勻，快速倒入直徑14cm的塑料培養(yǎng)皿中（盡量不產(chǎn)生氣泡），室溫水平放置1h，打孔，吸干加樣孔里滲出的水，精密吸取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μl，點(diǎn)在同一平皿中，加蓋，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中，反應(yīng)18h后取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)量溶圈兩垂直直徑。以蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品的單位數(shù)為橫坐標(biāo)，蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶圈兩垂直直徑的乘積為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)2次曲線回歸方程。

2.2樣品納豆激酶含量測(cè)定 測(cè)定6批納豆凍干粉，分別稱取0.5g，加工作溶液定容至10ml，混勻。精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混勻，即為供試品溶液。取10μl供試品溶液按2.1項(xiàng)的方法測(cè)定，將供試品溶圈兩垂直直徑的乘積代入標(biāo)準(zhǔn)2次曲線回歸方程，計(jì)算供試品效價(jià)單位數(shù)。

2.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次的納豆凍干粉5份，按照2.1項(xiàng)和2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行操作，考察操作方法的重現(xiàn)性。

2.4回收率測(cè)定 稱取納豆凍干粉1g，共9份，分三組，每組三份，分別加工作溶液定容至10ml，混勻。分別精密吸取0.5ml上清液，加0.5ml工作溶液，混勻，即為供試品溶液。對(duì)每組分別進(jìn)行80%、100%、120%做加標(biāo)回收。按2.1項(xiàng)的方法進(jìn)行測(cè)定。

3結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及回歸方程的建立 蚓激酶濃度單位-兩垂直直徑的乘積回歸方程為y=-0.0000004839 x2+0.02203 x-12.2715，相關(guān)系數(shù)r2=0.9993，所以用該方法測(cè)定納豆提取物中納豆激酶的活性，在檢測(cè)酶濃度單位在2000～10000U/ml呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程

3.2樣品含量測(cè)定 見(jiàn)表1。

3.3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 為考擦上述方法的可行性，設(shè)計(jì)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表2，RSD為3.4%，說(shuō)明用此方法具有較好的精密性。

3.4加標(biāo)回收測(cè)定 按2.5所述的方法測(cè)得納豆激酶加標(biāo)回收率的結(jié)果見(jiàn)表3，分析表中數(shù)據(jù)可得，回收率范圍在89.53%～100.75%，平均回收率為94.7%，RSD為4.2%，說(shuō)明該方法具有較高的回收水平。

4結(jié)論

瓊脂糖-纖維蛋白平板法直接以引激酶活性表示其測(cè)定值，簡(jiǎn)便直觀，2次曲線關(guān)系關(guān)系良好，回收率在89.53%～100.75%。由以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明該法準(zhǔn)確度也比較高，適用于納豆激酶的活性測(cè)定。在處理數(shù)據(jù)中筆者發(fā)現(xiàn)酶活力與溶圈面積、酶活力的對(duì)數(shù)與溶圈面積、酶活力的對(duì)數(shù)與溶圈面積的對(duì)數(shù)均不呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確度降低，而在一定濃度范圍內(nèi)，酶活力與溶圈兩垂直直徑的乘積呈現(xiàn)很好的2次曲線關(guān)系，因此采用2次曲線方程可以很好的提高結(jié)果的準(zhǔn)確度。

參考文獻(xiàn)：

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編輯/許言