灰飛虱2種熱激蛋白基因Hsp70的克隆、分析

張 青， 陸明星， 祝樹(shù)德

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 蘇州 215155)

灰飛虱［Laodelphax striatellus(Fallén)］屬半翅目飛虱科，是水稻等糧食作物的重要害蟲(chóng)，既能直接刺吸危害，又能通過(guò)傳播水稻條紋葉枯病毒(Rice stripe virus，RSV)等引起間接危害，造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失［1-4］。熱激蛋白(Heat shock proteins，Hsp)作為細(xì)胞的重要組成成分幾乎在所有的生物體都有存在，Hsps有的還受到多種脅迫的誘導(dǎo)，如高溫、低溫、干燥、缺氧、殺蟲(chóng)劑、重金屬、饑餓等［5］。Hsp的主要功能是參與蛋白質(zhì)合成、折疊、裝配及轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動(dòng)［6］。根據(jù)同源性與分子量大小，昆蟲(chóng)熱激蛋白一般分為Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和小分子量熱激蛋白(sHsp)［7-8］。其中Hsp70家族是最保守，也是研究最為廣泛的家族［9］。熱激蛋白Hsp70包含了脅迫誘導(dǎo)型和細(xì)胞組成型(Heat shock cognate，Hsc70)二種類(lèi)型［10］。Hsp70主要結(jié)構(gòu)包括氨基端的大小約為45 000的ATP結(jié)合域和羧基端的大約為25 000的結(jié)合結(jié)構(gòu)域［11］。盡管在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上具有許多共同的特征，但是它們的表達(dá)模式完全不同。大量的研究結(jié)果表明:熱激蛋白Hsp70在生物體的生理功能、各種抗性、環(huán)境監(jiān)測(cè)中具有重要的作用［12-14］。溫度是決定昆蟲(chóng)種群分布和豐度的最重要因子之一［15-16］。在自然條件下，昆蟲(chóng)經(jīng)常要面對(duì)不利的溫度，但是由于其個(gè)體較小，調(diào)節(jié)自身溫度的能力較差，因而在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，昆蟲(chóng)形成了多種補(bǔ)充的方法應(yīng)對(duì)不利溫度，如昆蟲(chóng)可通過(guò)調(diào)節(jié)熱激蛋白Hsp70的表達(dá)來(lái)維持其體內(nèi)各種蛋白質(zhì)的平衡以抵抗不良溫度［11，17-18］?；绎w虱具有較強(qiáng)的耐高溫、抗低溫能力，它能在中國(guó)長(zhǎng)江中下游水稻主產(chǎn)區(qū)以3～5齡若蟲(chóng)越冬越夏［19-22］。研究結(jié)果表明，灰飛虱4～5齡若蟲(chóng)的過(guò)冷卻點(diǎn)均在-10℃以下，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒力［22］。在18～30℃下卵的發(fā)育速率直線(xiàn)加快，且高溫不能抑制灰飛虱卵的發(fā)育［23］。目前灰飛虱對(duì)不良溫度適應(yīng)的分子機(jī)制仍然不清楚。本研究從熱激蛋白角度出發(fā)，探索了灰飛虱對(duì)溫度脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。為進(jìn)一步科學(xué)合理地制定該蟲(chóng)的綜合防治策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)的不攜帶條紋葉枯病毒的灰飛虱種群，用武育粳7號(hào)稻苗飼養(yǎng)10代以上。飼養(yǎng)條件為(26±1)℃，相對(duì)濕度70%，光周期16 L/8 D。

1.2 灰飛虱Hsp70基因的克隆

灰飛虱總RNA提取，Hsp70基因中間片段克隆，Hsp70基因RACE擴(kuò)增，Hsp70基因序列拼接與分析，Hsp70結(jié)構(gòu)分析等方法參照張青等對(duì)灰飛虱HSP90基因的克隆與分析方法［23］，并略有改動(dòng)。根據(jù)已有半翅目昆蟲(chóng)Hsp70基因序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)簡(jiǎn)并引物，分別為 LsHsp70F1、LsHsp70R1和 LsH-sc70F1、LsHsc70R1(表1)。

1.3 不同發(fā)育階段及不同溫度脅迫下灰飛虱Hsp70基因表達(dá)差異分析

1.3.1 cDNA第一鏈的合成 參照張青等研究HSP90的相關(guān)方法［23］。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)灰飛虱Hsp70基因全長(zhǎng)設(shè)計(jì)用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物，并根據(jù)已擴(kuò)增的灰飛虱β-actin部分序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物(表1)，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成引物。1.3.3 實(shí)時(shí)定量分析 運(yùn)用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real-time PCR分析，詳細(xì)方法參照HSP90的分析方法［24］，并略有改動(dòng)。其中退火溫度(Tm)分別為 Hsp70:58.5℃，Hsc70:60.8℃，β-actin: 58.5℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰飛虱Hsc70和Hsp70基因全長(zhǎng)擴(kuò)增與序列分析

以灰飛虱的cDNA為模板，采用簡(jiǎn)并引物L(fēng)sH-sc70F1、LsHsc70R1和LsHsp70F1、LsHsp70R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得約1 000 bp和400 bp的特異性條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、克隆、測(cè)序后，經(jīng)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列分別與其他昆蟲(chóng)的 Hsc70和Hsp70核苷酸序列具有高度相似性，推測(cè)其為灰飛虱Hsc70和Hsp70的中間片段，長(zhǎng)度分別為1 047 bp和421 bp。根據(jù)這2個(gè)片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增灰飛虱Hsc70和Hsp70基因cDNA全長(zhǎng)的3′和5′引物，并進(jìn)行RACE擴(kuò)增。根據(jù)Hsc70的中間序列，分別擴(kuò)增得到980 bp 3′端序列和1 823 bp的5′端序列。經(jīng)DNAMAN拼接獲得一個(gè)2 399 bp的灰飛虱Hsc70基因cDNA序列全長(zhǎng)，命名為L(zhǎng)sHsc70(GenBank登錄號(hào):KF660252)。其3′UTR末端具有典型的ploy A結(jié)構(gòu)，在ploy A上游12 bp處具有1個(gè)多聚腺苷酸結(jié)構(gòu) AATAAA。它的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1 974 bp，編碼657個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量73 000，等電點(diǎn)5.3。LsHsc70蛋白質(zhì)具有Hsp70蛋白質(zhì)家族特征簽名序列:IDLGTTYS(第34～41位殘基)、VFDLGGGTFDVSLL(第222～235位殘基)、LVLVGGSTRIPKVQQ(第359～373位殘基)。除此之外，在157～164位殘基處有1個(gè)ATP～GTP結(jié)合位點(diǎn);C-末端(第654～657位殘基)具有4個(gè)保守的氨基酸KDEL，表明LsHsc70是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型熱激蛋白家族成員(圖1A)。根據(jù)Hsp70的中間序列，分別擴(kuò)增得到1 805 bp 3′端序列和1 485 bp的5′端序列。經(jīng)DNAMAN拼接獲得1個(gè)2 468 bp的灰飛虱Hsp70基因cDNA序列全長(zhǎng)，命名為L(zhǎng)sHsp70(GenBank登錄號(hào):KF660251)。其3′UTR末端具有典型的ploy A結(jié)構(gòu)，但在ploy A上游未發(fā)現(xiàn)AATAAA結(jié)構(gòu)。它的開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)2 073 bp，編碼690個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量74 900，等電點(diǎn)5.8。LsH-sp70具有Hsp70蛋白質(zhì)家族特征簽名序列:IDLGTTNS(第62～69位殘基)、VYDLGGGTFDISIL(第247～260位殘基)、VILVGGMTRMPKVQS(第388～402位殘基)。除此之外，在183～190位殘基處有1個(gè)ATP-GTP結(jié)合位點(diǎn)(圖1B)。

表1 本研究所使用引物Table 1 Primer sequences used in this study

2.2 LsHsc70和LsHsp70蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

以人類(lèi)Homo sapiens Hsp70蛋白質(zhì)(PDB ID: c3d2fC)為模型，使用Phyre預(yù)測(cè)灰飛虱Hsc70和Hsp70蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，它們與人類(lèi)Hsp70蛋白質(zhì)的相似性分別為27%和25%。盡管它們之間的相似性不高，但它們結(jié)構(gòu)之間的比對(duì)都是基于600個(gè)以上的氨基酸殘基。結(jié)構(gòu)模型顯示灰飛虱LsHsc70和LsHsp70蛋白質(zhì)都具有熱激蛋白質(zhì)家族70的結(jié)構(gòu)特征(圖2)。

2.3 LsHsc70和LsHsp70系統(tǒng)分析

圖1 灰飛虱LsHsc70(A)和LsHsp70(B)基因的堿基序列和編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of LsHsc70(A)and LsHsp70(B)genes from Laodelphax striatellus

序列相似性分析結(jié)果顯示:灰飛虱LsHsc70和LsHsp70都與內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsis nevadensis Hsc70(KDR08641)的氨基酸序列的一致性最高，分別達(dá) 91%和 84%。以不同生物體的 Hsc70和 Hsp70為外群，對(duì)21種昆蟲(chóng)的Hsc70和Hsp70氨基酸序列進(jìn)行完全比對(duì)，基于Meg5.0采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明灰飛虱 Hsc70與西花薊馬Frankliniella occidentalis Hsc70(AGI36553)單獨(dú)聚為一支;但灰飛虱Hsp70與赤擬谷盜Tribolium castaneum Hsc70(XP_975386)聚為一支。所有的鱗翅目昆蟲(chóng)Hsc70和Hsp70都聚集在一起。同時(shí)，熱激蛋白質(zhì)70所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)也反應(yīng)了這些生物體的系統(tǒng)關(guān)系(圖3)。

圖2 灰飛虱Hsc70(A)和Hsp70(B)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Structure of Hsc70(A)and Hsp70(B)from L.striatellus

2.4 不同發(fā)育階段灰飛虱體內(nèi)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)變化

LsHsc70和LsHsp70在不同發(fā)育階段的灰飛虱體內(nèi)呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。隨著灰飛虱齡期不斷的增加，LsHsc70的表達(dá)量逐漸增多，在雄成蟲(chóng)時(shí)達(dá)到最大值，并顯著高于雌成蟲(chóng)(F6，14=7.509，P ＜0.001)。1齡若蟲(chóng)體內(nèi)LsHsp70基因表達(dá)量最高，顯著高于其他齡期(F6，14=3.377，P=0.028)。但是，LsHsp70基因表達(dá)量在雌雄成蟲(chóng)之間無(wú)顯著差異(圖4)。

2.5 不同溫度脅迫下灰飛虱4齡若蟲(chóng)體內(nèi)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)

高溫和低溫都可以誘導(dǎo)灰飛虱體內(nèi)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)，但是，低溫對(duì)這2種熱激蛋白的誘導(dǎo)作用要強(qiáng)于高溫。例如，在低溫條件下，LsHsc70和LsHsp70分別在-4℃和-9℃達(dá)到最大值，分別是26℃時(shí)表達(dá)量的10.06和13.70倍。在高溫條件下，LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)量與26℃時(shí)相比增加，分別在42℃和38℃達(dá)到最大值，分別是26℃時(shí)的4.97和3.20倍(圖5)。

圖4 不同發(fā)育階段的灰飛虱LsHsc70和LsHsp70 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of LsHsc70 and LsHsp70 mRNA in different developmental stages of L.striatellus

圖5 不同溫度處理1 h后灰飛虱4齡若蟲(chóng)LsHsc70和LsHsp70 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of LsHsc70 and LsHsp70 mRNA in the 4th instar nymphs of L.striatellus exposed to different temperatures for 1 h

2.6 不同持續(xù)時(shí)間高、低溫脅迫下灰飛虱4齡若蟲(chóng)體內(nèi)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)變化

灰飛虱4齡若蟲(chóng)在40℃條件下，經(jīng)過(guò)不同持續(xù)時(shí)間處理后發(fā)現(xiàn)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)趨勢(shì)一致。分別在處理后0.5 h時(shí)達(dá)到最大值，分別是對(duì)照的12.29和9.35倍，并且均顯著高于其他處理(P＜0.001)。在-4℃下不同持續(xù)時(shí)間處理后，LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)模式與40℃條件下不同。LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)量均在處理后1 h時(shí)達(dá)到最大值，分別是對(duì)照的10.06和8.22倍，且它們均顯著高于處理后0.25 h時(shí)的表達(dá)量(P＜0.001)(圖6)。

圖6 40℃(A)和－4℃(B)下處理不同時(shí)間灰飛虱4齡若蟲(chóng)LsHsc70和LsHsp70 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative expression levels of LsHsc70 and LsHsp70 mRNA in the 4th instar nymphs of L.striatellus exposed to 40℃(A)and-4℃(B)for different time

3 討論

本研究通過(guò)RACE法克隆得到灰飛虱體內(nèi)2種Hsp70家族基因LsHsc70和LsHsp70。氨基酸序列分析結(jié)果表明2個(gè)基因均具有Hsp70家族3個(gè)簽名序列和1個(gè) ATP～GTP結(jié)合位點(diǎn)［25］。LsHsc70在3′UTR端的poly(A)上方有加尾信號(hào)“AATAAA”，但LsHsp70不具有加尾信號(hào)。同源性比較顯示不同生物體Hsp70家族基因具有較高的保守性。但是，通過(guò)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)半翅目同翅亞目昆蟲(chóng)的Hsp70基因序列之間的相似性較低。例如，LsHsc70和LsH-sp70都與內(nèi)華達(dá)古白蟻Z.nevadensis Hsc70最為相似;褐飛虱 Nilaparvata lugens Hsp70與蘋(píng)果蠹蛾Cydia pomonella Hsp70同源性最高。由于Hsp70屬于多基因家族，推測(cè)可能與這類(lèi)昆蟲(chóng)中存在親源關(guān)系較近的Hsp70未被鑒定有關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)熱激蛋白質(zhì)70在調(diào)控昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育方面起到重要的作用［26-28］。隨著灰飛虱的生長(zhǎng)發(fā)育，LsHsc70表達(dá)量逐漸增多，在雄成蟲(chóng)時(shí)達(dá)到最大值，類(lèi)似的現(xiàn)象也在小菜蛾(Plutella xylostella)和斜紋夜蛾(Spodoptera litura)中發(fā)現(xiàn)［29-30］。同時(shí)，雄蟲(chóng)體內(nèi)的LsHsc70顯著高于雌成蟲(chóng)。LsHsc70可能還參與昆蟲(chóng)的生殖調(diào)控，其在灰飛虱中的這類(lèi)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。但是，LsHsp70在1齡若蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量最高，類(lèi)似的現(xiàn)象也在水稻二化螟(Chilo suppressalis)中被發(fā)現(xiàn)［31］。在灰飛虱整個(gè)發(fā)育過(guò)程中，LsHsp70表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。

Hsp70是與生物體溫度耐受性最為相關(guān)的一類(lèi)蛋白質(zhì)，一些研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了他們?cè)诶ハx(chóng)抵抗冷熱脅迫中起到重要的作用［31-35］。高溫和低溫都可以誘導(dǎo)灰飛虱體內(nèi)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)，但是，低溫對(duì)這2種熱激蛋白的誘導(dǎo)作用要強(qiáng)于高溫。但是，Kim等人研究發(fā)現(xiàn)低溫不可以誘導(dǎo)L.striatellus體內(nèi)的另外二種熱激蛋白質(zhì)70基因的表達(dá)［36］。低溫對(duì)大螟(Sesamia inferens)的Sihsc70的誘導(dǎo)不顯著［37］。低溫可以誘導(dǎo)黑腹果蠅(D.melanogaster Hsp70Aa，但是不能誘導(dǎo)Hsc70-1［38］。這說(shuō)明不同昆蟲(chóng)的不同Hsp70作用不盡相同?；绎w虱以3～5齡若蟲(chóng)越冬越夏，熱激蛋白70的調(diào)控有助于其渡過(guò)不良環(huán)境溫度。溫和的溫度也可以誘導(dǎo)灰飛虱LsH-sc70和LsHsp70表達(dá)。較低溫度的鍛煉同樣也引起了南美斑潛蠅(Liriomyza huidobrensis)Hsp70的增加［39］。LsHsc70和LsHsp70在42℃和38℃的表達(dá)量分別是26℃的4.97和3.20倍。王海鴻等研究結(jié)果表明高溫可以誘導(dǎo)在煙粉虱(Bemisia tabaci B biotype)和溫室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum) Hsp70的表達(dá)［40］。高低溫處理不同時(shí)間均能誘導(dǎo)LsHsc70和LsHsp70表達(dá)，這與美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa zea)體內(nèi)的Hsp70表達(dá)模式相似［41］。在40℃條件下，灰飛虱4齡若蟲(chóng)體內(nèi)的LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)量都在0.5 h時(shí)達(dá)到最大值。然而，在-4℃下LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)量均在處理后1 h時(shí)達(dá)到最大值。這表明熱激蛋白70對(duì)高溫和低溫有不同的響應(yīng)時(shí)間。因此，我們初步推斷調(diào)節(jié)LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)是灰飛虱渡過(guò)不良環(huán)境溫度的重要生理手段。

為了探討灰飛虱對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，本研究成功克隆了其Hsc70和Hsp70基因全長(zhǎng)序列，分析了不同發(fā)育階段LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)變化規(guī)律，檢測(cè)了冷熱條件下LsHsc70和LsHsp70的表達(dá)水平，初步闡明了Hsp70與灰飛虱溫度適應(yīng)能力有著密切的聯(lián)系。本研究?jī)H僅是從基因水平研究了灰飛虱的Hsp70，有必要從蛋白質(zhì)水平研究其功能。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)灰飛虱體內(nèi)還有其他熱激蛋白質(zhì)70家族基因，為了進(jìn)一步深入探討它的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，有必要結(jié)合其他熱激蛋白70進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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