水溶性富勒烯衍生物抗氧化特性的研究進(jìn)展

竇 曉，馬瑩瑩，王成端，馬冬梅，楊建剛

（1．四川理工學(xué)院，四川 自貢643000；2．四川文理學(xué)院，四川 達(dá)州635000）

富勒烯是完全由碳組成的中空的球形、橢球形、柱形或管狀分子的總稱。富勒烯因其表面有大量易與自由基反應(yīng)的共價(jià)雙鍵而被譽(yù)為“吸收自由基的海綿”［1－2］。因此，它可以作為體內(nèi)自由基的清除劑和抗氧化劑，在生物醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出極高的潛在價(jià)值。在體內(nèi)，含有活性氧的羥基自由基、過(guò)氧化物自由基和超氧化物陰離子被公認(rèn)為是造成細(xì)胞死亡的重要原因，同時(shí)也是引起慢性神經(jīng)變性疾?。ㄈ缂∥s側(cè)索硬化癥、慢性阿爾茨海默病和帕金森?。┑闹饕蛩?。利用富勒烯可消除體內(nèi)的含活性氧的自由基［3］。一般來(lái)說(shuō)，富勒烯在消除活性氧時(shí)存在兩種不同的作用機(jī)制：一種是富勒烯分子表面吸附一定量的活性氧，經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)使得表面的活性氧催化分解，從而重新得到富勒烯；第二種是通過(guò)富勒烯和自由基團(tuán)之間進(jìn)行電子傳遞過(guò)程中發(fā)生氧化還原作用來(lái)進(jìn)行的。

然而富勒烯本身不溶于水，為了使其能被人體所利用，必須對(duì)富勒烯分子進(jìn)行改造使其具有水溶性。科學(xué)家為此做了大量研究并得到了多種水溶性富勒烯衍生物，有很多在細(xì)胞抗氧化和保護(hù)機(jī)制中起到了理想效果。作者概述了水溶性富勒烯衍生物的最新研究進(jìn)展及其作為抗氧化和細(xì)胞保護(hù)藥物的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 水溶性富勒烯衍生物的合成

一般來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)以下4種方法得到水溶性富勒烯：（1）將富勒烯封閉在親水性寄主物質(zhì)（如環(huán)糊精、杯芳烴等）的內(nèi)部疏水空間中［4－7］；（2）將富勒烯及其衍生物的超分子結(jié)構(gòu)或共價(jià)基團(tuán)加入到水溶性高分子聚合物或者生物大分子蛋白質(zhì)中［8］；（3）用適宜的表面活性劑使富勒烯懸浮在水溶液中；（4）直接通過(guò)加成反應(yīng)使富勒烯獲得親水活性。

從藥理角度來(lái)看，前兩種方法存在一些問(wèn)題：（1）基于富勒烯構(gòu)造成的高分子體系在溶劑中的確切結(jié)構(gòu)還不清楚；（2）很難獲得這些高分子材料的均勻樣品；（3）在許多情況下成功嵌合上的富勒烯分子的數(shù)量無(wú)法計(jì)算。而第3種方法是將富勒烯溶于它的良溶劑四氫呋喃、甲苯中，然后與水混合，除去有機(jī)溶劑得到5～200nm的納米顆粒水懸液。第4種方法是目前研究最多的，人們通過(guò)加成反應(yīng)合成了大量的能溶于非芳香族溶劑和水的功能性富勒烯。其中兩種最為常用的方法是丙二酸酯環(huán)丙烷的親核加成和富勒烯吡咯烷的構(gòu)成反應(yīng)［9－10］。丙二酸酯環(huán)丙烷的親核加成是利用丙二酸酯與1，3－二羰基相關(guān)的化合物的加成使富勒烯環(huán)丙烷化，這個(gè)過(guò)程稱為賓格爾反應(yīng)，是富勒烯環(huán)丙烷化的主要途徑。馬冬梅等［11］概述了［60］富勒烯的三元環(huán)化衍生物的功能化和其三元環(huán)化反應(yīng)的發(fā)生機(jī)理。利用這種方法得到的三重加合物具有很好的水溶性和生物活性，但多重加成功能化的一個(gè)缺點(diǎn)就是隨著加合物數(shù)量的增加，對(duì)富勒烯球體系統(tǒng)的破壞也會(huì)增大。因?yàn)殡S著加合物數(shù)量的不斷增加，富勒烯分子的電荷量和親核能力會(huì)變得越來(lái)越低，直接導(dǎo)致其抗氧化和細(xì)胞保護(hù)活性的不斷降低［3］。富勒烯吡咯烷的構(gòu)成反應(yīng)是將原位生成的甲亞胺葉立德的1，3－偶極環(huán)加成到C60上，從而得到吡咯烷富勒烯。進(jìn)一步的官能化反應(yīng)是通過(guò)適當(dāng)醛的甲亞胺葉立德形成或者吡咯烷氮原子的季胺化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。康峰等［12］利用這種方法合成了2種富勒烯吡咯烷中間體。

近年來(lái)，除丙二酸酯加合物和富勒烯吡咯烷之外，還合成了許多不同的水溶性富勒烯衍生物，它們的合成方式和上述兩種方法完全不同。這些研究很大程度上豐富了潛在有效抗氧化物的數(shù)量，也加強(qiáng)了富勒烯的電子結(jié)構(gòu)對(duì)其生物醫(yī)學(xué)和藥理活性的影響的認(rèn)識(shí)。

2 水溶性富勒烯對(duì)活性氧的淬滅活性

普遍認(rèn)為，超氧化物陰離子是神經(jīng)元變性的罪魁禍?zhǔn)祝瑫r(shí)也是活性氧毒性的主要物質(zhì)［13－15］。另外，一些含有羥基和一氧化碳自由基的小分子也是觸發(fā)人和動(dòng)物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要角色。為了確定富勒烯是否可以淬滅活性氧以及獲得其可能存在的構(gòu)效關(guān)系，科學(xué)家們對(duì)一些水溶性的富勒烯衍生物進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)，以此評(píng)估它們對(duì)活性氧物質(zhì)的自由基的淬滅活性。

2．1 對(duì)超氧化物的淬滅活性

氧化性損傷是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的主要原因，人們很想得到一種可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷的藥物。為了篩選可能的細(xì)胞保護(hù)藥物，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種各樣的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試系統(tǒng)，這些系統(tǒng)大多數(shù)是基于體內(nèi)的由黃嘌呤或者黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生的超氧化物來(lái)設(shè)計(jì)的。McCord等［16］發(fā)現(xiàn)超氧化物的分解也許可以通過(guò)光度法測(cè)量細(xì)胞色素C的減少來(lái)完成。

富勒醇和六磺丁基富勒烯是最早進(jìn)行超氧化物清除活性檢測(cè)的水溶性富勒烯衍生物［17－20］，它們有很好的清除活性，50μmol·L－1和100μmol·L－1濃度的六磺丁基富勒烯對(duì)超氧化物的抑制效率分別達(dá)到60%和90%，而含有羥基官能團(tuán)的富勒醇在1mmol·L－1濃度下卻只有40%的抑制效率。這可能是由于，富勒醇對(duì)富勒烯球體結(jié)構(gòu)破壞得更嚴(yán)重，致使富勒烯表面官能化程度更大。因此，可以推測(cè)衍生物對(duì)富勒烯結(jié)構(gòu)影響越小，其抗氧化活性就越強(qiáng)。與此同時(shí)，由丙二酸與富勒烯核心相連接形成的羧基富勒烯也被檢測(cè)到具有抗氧化活性。這類羧基富勒烯的出現(xiàn)使得對(duì)丙二酸的數(shù)量和在富勒烯分子上的球體布局的控制成為可能。孫濤等［21］合成了一種C60－低聚殼聚糖衍生物，具有良好的超氧陰離子清除能力、羥基自由基清除能力、還原能力和金屬螯合能力。楊新林等［22］制備了一種二加成亞甲基［60］富勒烯膦酸酯衍生物的納米顆粒水懸液，它對(duì)超氧陰離子的清除率達(dá)到91．96%。

關(guān)于富勒烯的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)，帶有負(fù)電荷的單加合物是最好的抗氧化物質(zhì)，這是因?yàn)樗鼈儞碛懈暾那蝮w結(jié)構(gòu)、更低的還原電位、更高的親和性。而富勒烯的聚集會(huì)降低活性富勒烯在溶液中的濃度，與單體相比其淬滅活性也會(huì)減弱。比較未經(jīng)改造的和經(jīng)過(guò)改造的衍生物發(fā)現(xiàn)，前者的親水性基團(tuán)和親脂性部分體積更小，所帶的靜電荷也更少。在極性溶劑二甲基亞砜中，擁有不同本質(zhì)特征結(jié)構(gòu)的未經(jīng)改造的單體可能會(huì)形成更大的超分子結(jié)構(gòu)，富勒烯的有效利用率會(huì)更低［3］。這些或許可以解釋兩者的超氧化物淬滅活性的差異。在富勒烯表面添加疏水的加合物基團(tuán)，它的球體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得其內(nèi)在電子和淬滅活性都會(huì)減弱。

以上間接實(shí)驗(yàn)的多變量是很難控制的，結(jié)果分析也有一定的局限性：人工合成的生物化合物（如酶、細(xì)胞色素C）在實(shí)驗(yàn)中可能造成數(shù)據(jù)并不準(zhǔn)確，另外富勒烯分子間的聚集造成的基質(zhì)效應(yīng)和別的一些因素等。尤其是利用細(xì)胞色素C來(lái)構(gòu)建負(fù)離子富勒烯分子復(fù)體時(shí)，它的測(cè)量活性會(huì)被不利的副產(chǎn)物嚴(yán)重干擾。為了掌握富勒烯衍生物更多的動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)以及更深入地對(duì)其淬滅機(jī)制進(jìn)行研究，人們必須對(duì)富勒烯衍生物的抗氧化特性及其對(duì)超氧化物陰離子的反應(yīng)進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

2．2 對(duì)其它活性氧的淬滅活性

在哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)，除了超氧化物外還有其它小的氧自由基（如羥基自由基或者含氮的氧化自由基）也可能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究者指出，在生理?xiàng)l件下富勒烯對(duì)羥基自由基有非常好的清除作用，并且在大多數(shù)情況下比清除超氧化物陰離子的活性高出兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這可能歸功于聚羥基化加合物的有效構(gòu)建［23－29］。富勒醇和一些丙二酸加合物也被報(bào)道可以清除含氮的氧化自由基［30］，這表明以富勒烯為基礎(chǔ)的材料通過(guò)不同的作用機(jī)制來(lái)影響自身的抗氧化和神經(jīng)保護(hù)活性，也極大地提高了這類物質(zhì)的潛在醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

3 水溶性富勒烯衍生物對(duì)體內(nèi)細(xì)胞的保護(hù)作用

人們最先是在體外研究中發(fā)現(xiàn)許多對(duì)活性氧有著較高淬滅活性的富勒烯衍生物，然后選用適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物進(jìn)行體內(nèi)研究，從而評(píng)估以富勒烯為基礎(chǔ)的藥物體系在活的組織中的潛在活性氧淬滅作用。已有富勒醇在一些動(dòng)物模型中清除自由基活性的報(bào)道，其中六磺丁基富勒烯在抵抗大腦缺血病灶時(shí)展現(xiàn)出良好的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。一種樹枝狀富勒烯衍生物在斑馬魚胚胎中的抗輻射作用與FDA認(rèn)證的抗輻射藥物氨磷汀的效果相當(dāng)。另外，具有肝臟保護(hù)作用的C60原液的懸浮液對(duì)四氯化碳毒性很敏感。周強(qiáng)等［31］研究表明，C60－氮芥較氮芥對(duì)動(dòng)物正常器官的氧化損傷和輻射損傷具有保護(hù)作用；劉清［32］用0．7mg·mL－1富勒醇作用于10g·L－1D－半乳糖衰老脾細(xì)胞模型，證明了富勒醇可以降低衰老脾細(xì)胞的死亡率，并通過(guò)微量丙二醛試劑盒檢測(cè)出富勒醇能夠減少脾細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)的生成從而保護(hù)脾細(xì)胞；陳田［33］合成了一種富勒烯－蛋氨酸衍生物FMD，研究表明其具有很好的自由基清除能力以及對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

Dugan等［34］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)系統(tǒng)施用一種富勒烯衍生物可延緩患有家族性肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥小鼠的神經(jīng)元的衰退和死亡以及延長(zhǎng)SOD2基因剔除的、缺乏線粒體錳超氧化物歧化酶的小鼠的壽命；Beuerle等［3］對(duì)富勒烯的一系列衍生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比較，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)具有保護(hù)斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)、延緩胚胎細(xì)胞凋亡等作用；胡凱騫等［35］研究了功能化富勒烯衍生物在抗氧化應(yīng)激條件下延長(zhǎng)線蟲壽命的生物學(xué)效應(yīng)，并推測(cè)出Daf－16等應(yīng)激相關(guān)的基因可能是功能化富勒烯衍生物潛在的分子靶點(diǎn)；另外，Lin等［36］對(duì)于阻止小鼠大腦中由鐵誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)也做了研究。

4 水溶性富勒烯衍生物的毒性

為了檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的富勒烯的生物相容性，Beuerle等［3］對(duì)斑馬魚胚胎中的一切毒性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行身體形態(tài)學(xué)檢查，還通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)它的內(nèi)部器官進(jìn)行檢查，并獲得了這些實(shí)驗(yàn)的富勒烯的半數(shù)致死濃度（LC50）。發(fā)現(xiàn)在少數(shù)情況下，高劑量的水溶性富勒烯會(huì)引起身體的反常變化，比如體長(zhǎng)的縮短和不正常的身體彎曲；在某些情況下還會(huì)出現(xiàn)心臟的微變、肝臟和腸道的變大或未發(fā)育健全，而水溶性富勒烯在其中的濃度都接近LC50。這些結(jié)果表明，陰離子富勒烯衍生物一般是沒(méi)有毒性的，但是高濃度可能會(huì)產(chǎn)生畸變效應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)，適宜濃度的水溶性富勒烯在動(dòng)物體內(nèi)幾乎沒(méi)有毒性［3］。沈方臻等［37］研究表明，富勒醇對(duì)小鼠移植性肝癌生長(zhǎng)的抑制作用明顯；朱小山等［38］研究發(fā)現(xiàn)，C60、nC60的制備過(guò)程以及nC60本身的結(jié)構(gòu)均能影響其潛在生物毒性。因此，若制備和設(shè)計(jì)富勒烯衍生物的方法得當(dāng)，它們對(duì)人體幾乎是沒(méi)有毒性的。

5 展望

近些年，為了讓富勒烯及其衍生物從單純的學(xué)術(shù)研究發(fā)展到商業(yè)應(yīng)用，對(duì)富勒烯的研究更多地轉(zhuǎn)入設(shè)計(jì)和優(yōu)化它的分子結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。目前，已經(jīng)合成出大量的水溶性富勒烯衍生物，它們結(jié)構(gòu)多樣，特點(diǎn)迥異；并且可以通過(guò)結(jié)構(gòu)的微調(diào)實(shí)現(xiàn)不同屬性，比如帶電性、聚集行為、親水親脂平衡性、電子結(jié)構(gòu)、氧化還原活性等。通過(guò)對(duì)這些內(nèi)在屬性的特殊調(diào)整可以得到專業(yè)應(yīng)用的新材料和新化合物。

人們對(duì)許多以富勒烯為基礎(chǔ)的水溶性富勒烯衍生物的體內(nèi)外的抗氧化活性和在藥理學(xué)應(yīng)用中作為潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物進(jìn)行了研究和評(píng)估。這些新型的富勒烯衍生物在抵御人類和哺乳動(dòng)物體內(nèi)最主要的氧化激發(fā)物質(zhì)活性氧時(shí)，大多都表現(xiàn)出很好的淬滅活性。富勒烯衍生物是通過(guò)多種作用途徑來(lái)保護(hù)活體系統(tǒng)抵御氧化激發(fā)反應(yīng)的。盡管大量的證據(jù)顯示富勒烯衍生物的抗氧化性與其相關(guān)結(jié)構(gòu)有著密切聯(lián)系，但其淬滅自由基和神經(jīng)保護(hù)的確切機(jī)制仍不明了，還需用更精確的模型系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估。

在不久的將來(lái)，對(duì)新的水溶性富勒烯衍生物的設(shè)計(jì)和合成可能會(huì)更集中在它特殊的抗氧化性和細(xì)胞保護(hù)活性方面。而各種富勒烯的抗氧化性和它們的細(xì)胞保護(hù)活性之間的聯(lián)系還不清楚。因此，對(duì)其化學(xué)特性的研究仍然是一項(xiàng)十分艱巨的任務(wù)。

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