基于DNA條形碼—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的巴西草藥PIC?O(鬼針草)的鑒定及生藥學(xué)研究

顧選 張曉芹 宋曉娜 李妍芃 韓麗 趙百孝 劉春生 馬長華 哈略

鬼針草類藥材均來源于菊科管狀花亞科鬼針屬Bidens L.植物，為一年生草本植物。鬼針草類藥材藥用歷史悠久，為許多國家使用。中國的鬼針草藥材來源有鬼針草B．pilosa、金盞銀盤B．biternata、小花鬼針草B．parviflora等植物的干燥全草［1］，其具清熱解毒、活血散瘀功能，主治上呼吸道感染、咽喉腫痛、急性黃疸型傳染性肝炎等［2］。巴西號稱“植物王國”，境內(nèi)植物資源居世界首位。在巴西的部落里，鬼針草藥材(PIC?O)的應(yīng)用也十分廣泛。通過調(diào)查，巴西鬼針草具有利尿，凈化血液，消炎，保護(hù)肝臟，抗病菌，抗原生動物，退燒解熱作用，用于治療黃疸病、泌尿感染，陰道感染以及皮膚病的輔助治療等。比較中巴鬼針草的治療作用和臨床應(yīng)用情況，有利于促進(jìn)中國和巴西的醫(yī)學(xué)交流，擴(kuò)大草藥的用藥范圍。但是，巴西鬼針草來源尚不明確，限制了草藥的開發(fā)利用。

DNA條形碼技術(shù)具有鑒別無背景信息中藥材的優(yōu)勢，能夠準(zhǔn)確鑒別到屬、種水平，產(chǎn)地和形態(tài)特征能進(jìn)一步驗(yàn)證DNA條形碼鑒定結(jié)果［3］。本研究通過DNA條形碼技術(shù)—產(chǎn)地—形態(tài)分析聯(lián)用的方法對巴西鬼針草進(jìn)行基原鑒定研究，明確藥材的來源。通過性狀鑒別和顯微鑒別法對巴西鬼針草進(jìn)行生藥學(xué)研究，從器官、組織和細(xì)胞三個層次為藥材鑒別提供依據(jù)，對藥材的開發(fā)利用和質(zhì)量控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2012年4月采購巴西藥用鬼針草3批，購自巴西隆城市場。樣品的憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)標(biāo)本室。

1.2 試劑

廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德生物有限公司，批號:69632855)、Taq酶等PCR試劑(上海生工生物工程有限公司，批號:695673BE)、乙醇、瓊脂糖、ddH2O 等。

1.3 儀器

SIGMA3K-15低溫高速離心機(jī)(SIGMA公司)，TECHNE TC-3000PCR擴(kuò)增儀，Bio-Rad電泳儀，水平電泳槽(北京六一儀器廠)，JS-680B全自動凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)，GRANT制冰機(jī)，超純水制備系統(tǒng)，KQ5200E型超聲波清洗器，SANYO-80℃超低溫冰箱(SANYO公司)，DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 DNA提取及PCR擴(kuò)增

取樣品，觀察形態(tài)，形態(tài)結(jié)果一致。取葉片進(jìn)行DNA提取。各份樣本分別用液氮冷凍后研磨成細(xì)粉，采用植物DNA提取試劑盒提取總DNA。采用ITS序列通用引物在熱循環(huán)擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件:50μL體系含2×Taq PCR MasterMix 25μL，引物P1和P4各加2.5μL(5μmol/L)，DNA模板4μL，ddH2O 16μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸 1分鐘，40個循環(huán)后，72℃延伸 10分鐘［3］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下檢視，均由上海生工生物工程有限公司測序部測序。各樣品均采用正向和反向測序，以保證測序的準(zhǔn)確性。

1.5 序列分析方法

利用ContigExpress軟件對測序獲得的正、反向序列進(jìn)行拼接，根據(jù)相似度搜索法(BLAST法)所獲相似度最高物種的同屬ITS序列邊界，截取待鑒定物種的ITS序列，分析樣品序列特征。

1.6 基于DNA條形碼的鑒定方法

根據(jù)相似度法鑒別物種:以90%作為屬水平鑒定的閾值，以97%作為種水平的鑒定閾值。當(dāng)物種相似度在97%以上，最高相似度物種為鑒定結(jié)果;當(dāng)最高相似度物種相似度低于97%時，認(rèn)為數(shù)據(jù)未注冊該序列，鑒定到屬水平。

1.7 基于產(chǎn)地分析的鑒定方法

根據(jù)“基于DNA條形碼鑒定方法”項下獲得的科、屬和種的鑒定結(jié)果，依據(jù)巴西植物志記載的巴西分布的該屬植物物種信息，依次分析最高相似度物種的產(chǎn)地是否相符合。

1.8 基于形態(tài)分析的鑒定方法

根據(jù)“基于產(chǎn)地分析的鑒定方法”項下獲得的鑒定結(jié)果，查詢巴西植物志的形態(tài)信息，核對形態(tài)特征，進(jìn)一步證實(shí)鑒定物種結(jié)果和入藥部位。

1.9 巴西鬼針草的性狀和顯微特征研究

根據(jù)2010版《中華人民共和國藥典》(一部)中方法分析樣品性狀特征、顯微橫切特征、顯微粉末特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DNA條形碼的鑒定

樣品的測序峰圖良好，3份平行樣測序結(jié)果一致，各選擇一條序列用于后續(xù)分析。截取ITS片段，ITS序列長度為646 bp。經(jīng)BLAST功能檢索，樣品與菊科鬼針草屬植物相似度最高，均大于97%;與植物鬼針草B．pilosa序列(U67106.1)相似度最高，相似度為99%。因此，通過DNA條形碼技術(shù)鑒別該藥材基原為菊科植物鬼針草B．pilosa。

2.2 基于產(chǎn)地分析的驗(yàn)證

根據(jù)調(diào)查，巴西部落有鬼針草植物分布，DNA條形碼鑒定結(jié)果符合植物地理分布特征。因此，根據(jù)DNA條形碼與產(chǎn)地核對結(jié)果鑒定巴西鬼針草來源于菊科植物鬼針草。

2.3 基于形態(tài)分析的驗(yàn)證

莖鈍四棱形，如圖1，葉為三出羽狀復(fù)葉，小葉基部近圓形或闊楔形，有時偏斜，不對稱，具短柄，邊緣有鋸齒、頂生小葉較大，長橢圓形或卵狀長圓形。葉面具柔毛。根據(jù)形態(tài)分析，巴西鬼針草與植物志中鬼針草特征相符合，因此，根據(jù)DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)分析的研究結(jié)果，鑒定巴西鬼針草的來源為菊科植物鬼針草B．pilosa的地上部分。

圖1 巴西鬼針草PIC?O樣品的性狀

2.4 巴西鬼針草的性狀和顯微研究

2.4.1 性狀特征 從性狀上看，樣品經(jīng)過切制加工，莖呈方形或近圓柱形，多切成段，長短不一，一般老莖較短，嫩莖較長。表面紫紅色或紫棕色，少量或灰綠色或棕黃色，有縱向棱槽，莖上微附茸毛，節(jié)間明顯，節(jié)膨大。質(zhì)輕，易折斷。斷面白色，髓部海綿狀，近節(jié)處或有中空。葉片皺縮卷曲，完整者展平后呈卵形或菱狀卵形，灰綠色。葉對生，為羽狀三出復(fù)葉，葉端漸尖，葉緣具均勻鋸齒狀，葉基漸狹，頂生小葉較大，葉基延展近翅狀。葉柄較長，葉柄及葉面均具明顯柔毛。質(zhì)輕脆。氣微特異，味微苦。

2.4.2 顯微橫切鑒定 采用石蠟切片制法制片，從顯微橫切面特征上觀察莖葉特征。

莖呈類方形。表皮細(xì)胞1列，長方形，沿切向延長，有時可見少數(shù)非腺毛。皮層窄，由5～6列細(xì)胞組成，角隅處有乳汁管，四個角中每個角隅處有三個，四邊中每個維管束上方有一個。維管束大小不等為外韌型，多個環(huán)列。韌皮部外側(cè)分布有中柱鞘纖維，多半月形，斷續(xù)呈環(huán)狀排列。木質(zhì)部導(dǎo)管大小不等，多被木質(zhì)部纖維分隔斷續(xù)徑向排列。髓部發(fā)達(dá)，約為莖橫切面的2/3以上，薄壁細(xì)胞向內(nèi)逐漸增大，排列較疏松，如圖2-3。

圖2 巴西鬼針草PIC?O樣品莖的顯微橫切面

圖3 巴西鬼針草PIC?O樣品的莖(部分)橫切面

葉上表皮細(xì)胞1列，長方形，較大。下表皮細(xì)胞較小，類方形，氣孔類型為不定式。表皮細(xì)胞上有非腺毛分布。柵欄組織由1列短圓柱形細(xì)胞組成，海綿組織較發(fā)達(dá)，細(xì)胞形狀類圓形或不規(guī)則形。葉肉組織中含有分泌道。主脈處維管束3個，外韌型，木質(zhì)部導(dǎo)管2～4個徑向排列成行。韌皮部呈半月形，如圖4。

圖4 巴西鬼針草PIC?O樣品的主脈橫切面圖

2.4.3 顯微粉末鑒定 粉末綠灰色或灰棕色。(1)非腺毛呈錐形，由多個細(xì)胞組成，頂端銳尖或漸尖。(2)導(dǎo)管多為具緣紋孔導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管，少見環(huán)紋和梯紋導(dǎo)管。(3)木纖維 多成束，細(xì)胞為長梭形，末端尖，多破碎，胞腔較窄，內(nèi)可見紋孔。(4)葉表皮細(xì)胞不規(guī)則形，大小不等，葉下表皮氣孔為不定式。(5)花粉粒 球形，外壁具細(xì)刺狀突起。(6)莖表皮細(xì)胞排列整齊，近長方形。(7)髓薄壁細(xì)胞為大型細(xì)胞，近長方形，壁較厚。(8)韌皮纖維呈梭形，常成群存在，胞腔呈線狀。(9)棕色塊略透明，具光澤，如圖5。

3 討論

3.1 鬼針草的鑒定

研究人員對鬼針草鑒別做了大量研究。夏至等［4］通過分子鑒定方法對中國鬼針草7個近緣種進(jìn)行分析，結(jié)果表明，鬼針草能與其他近緣物種鑒別開，表明了DNA條形碼對鬼針草藥材的鑒別能力。劉圓等［5］通過原植物、性狀、顯微和薄層鑒別的方法對民族藥鬼針草進(jìn)行生藥學(xué)鑒定研究，表明生藥學(xué)特征能夠作為鬼針草的鑒別依據(jù)。本研究通過DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)分析聯(lián)用的方法鑒定巴西鬼針草來源于菊科植物鬼針草的地上部分。生藥學(xué)研究為巴西鬼針草的品種鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖5 巴西鬼針草PIC?O樣品的粉末圖

3.2 中巴用藥經(jīng)驗(yàn)交流的意義

通過比較中國和巴西鬼針草藥材的用藥經(jīng)驗(yàn)，為中藥擴(kuò)大藥用資源和新藥開發(fā)提供依據(jù)，中國可以從巴西進(jìn)口資源緊缺的品種;巴西植物藥研究處于初級階段，本研究為促進(jìn)巴西草藥的臨床應(yīng)用和化學(xué)、藥理研究提供品種鑒定基礎(chǔ)，巴西可以借鑒中國中藥的研究基礎(chǔ)和研究方法提高巴西草藥的現(xiàn)代化水平;本研究為挖掘中國和巴西草藥新資源提供參考，為中巴的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)交流奠定基礎(chǔ)。

［1］ 張延昌，張永明.鬼針草的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景［J］.山東教育學(xué)院學(xué)報，2004，19(4):79-83.

［2］ 吳婷妮，余長柱，李榮，等.鬼針草的研究進(jìn)展［J］.安徽醫(yī)藥，2014，(9):1614-1616.

［3］ 顧選，張曉芹，宋曉娜，等.基于DNA條形碼-產(chǎn)地-形態(tài)聯(lián)用的藥材溯源新方法研究——以黑果枸杞1種偽品為例［J］.中國中藥雜志，2014，39(24):4759-4762.

［4］ 夏至，高致明，李賀敏，等.鬼針草及其近緣種的分子鑒定和親緣關(guān)系研究［J］.中草藥，2014，45(6):828-834.

［5］ 劉圓，王杰，彭鐮心，等.民族藥鬼針草的生藥學(xué)鑒定［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2006，32(3):568-571.

［6］ 胡偉，陳飛虎，吳繁榮，等.鬼針草藥材的生藥學(xué)鑒定［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(2):329-330.