液相色譜法同時(shí)測(cè)定維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素和山柰酚

木合塔爾5吐爾洪, 熱薩萊提5伊敏, 楚剛輝,尹學(xué)博, 木尼熱5阿不都克里木

(1. 喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 新疆 喀什 844006;2. 新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 喀什 844006)

研究論文

液相色譜法同時(shí)測(cè)定維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素和山柰酚

木合塔爾5吐爾洪1,2, 熱薩萊提5伊敏1, 楚剛輝1,2,尹學(xué)博1,2, 木尼熱5阿不都克里木2*

(1. 喀什大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 新疆 喀什 844006;2. 新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 新疆 喀什 844006)

維藥是祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)不可分割的組成部分。維藥現(xiàn)代化,即利用現(xiàn)代技術(shù)研究維藥的有效成分,是維藥科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、商品化和產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路。本文建立了維藥蜀葵花中有效成分蘆丁、槲皮素和山柰酚的選擇性提取方法,優(yōu)化了高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定這3種有效成分的分析條件。采用HC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和甲醇-0.4%磷酸(50∶50, v/v)流動(dòng)相,在柱溫30 ℃和流速1.00 mL/min的條件下實(shí)現(xiàn)了3種物質(zhì)之間以及和干擾物之間的基線分離。維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素及山柰酚的線性范圍分別為12.5～150 μg/mL (r=0.999 8), 12.5～125 μg/mL (r=0.999 9)及12.5～125 μg/mL (r=0.998 8),加標(biāo)回收率(n=5)分別為100.3%(RSD=1.1%)、97.60%(RSD=0.47%)、97.75%(RSD=0.71%)。該方法實(shí)現(xiàn)了同時(shí)測(cè)定維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素及山柰酚,為其他黃酮類物質(zhì)的開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù),同時(shí)也可為其他維藥分析提供借鑒。

高效液相色譜法;蘆丁;槲皮素;山柰酚;蜀葵花

維藥是祖國(guó)醫(yī)藥學(xué)不可分割的組成部分,也是維吾爾族人民防病治病的物質(zhì)基礎(chǔ)。維吾爾族地區(qū)豐富的天然資源是維吾爾藥材的豐富來(lái)源,而獨(dú)特的氣候條件和地域特點(diǎn)造就了獨(dú)特的維藥特點(diǎn)和品質(zhì)。蜀葵(Althaearosea(L) Gavan)為錦葵科蜀葵屬的植物,別名熟季花、戎葵、吳葵、衛(wèi)足葵、胡葵、斗蓬花等,全草可入藥[1-3]。蜀葵花為蜀葵的干花,是維吾爾族常用藥材,《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊(cè)》和《維吾爾醫(yī)常用藥材》記載蜀葵花性質(zhì)二級(jí)濕寒,能潤(rùn)肺止咳、發(fā)汗平喘、消腫透疹、安神益心,用于咳喘不止、小兒麻疹、便秘痔瘡、汗出不暢[4,5]。蜀葵一次播種多年開花,在新疆廣泛種植。蜀葵花資源豐富、在維吾爾族民間自古就有用蜀葵花外敷消腫的習(xí)慣。臨床上蜀葵花的用途更為廣泛,已用于眼皮炎腫、耳底炎、乳腺炎等各種炎癥[6]。但目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于維吾爾藥材蜀葵花的研究甚少。

維藥現(xiàn)代化,即利用現(xiàn)代技術(shù)研究維藥的有效成分,是維藥科學(xué)化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、商品化和產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路,對(duì)維藥的開發(fā)應(yīng)用有重要的推動(dòng)作用。蜀葵花中的主要有效化學(xué)成分為黃酮類化合物。馮育林等[7]從蜀葵花中分離得到蘆丁等9個(gè)黃酮類化合物,張祎等[8]從蜀葵花中分離得到14種單體成分,勉強(qiáng)輝等[9,10]用高效液相色譜法測(cè)定維藥蜀葵花中蘆丁和紫云英苷的含量。本文報(bào)道了同時(shí)測(cè)定維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素、山柰酚的高效液相色譜方法,優(yōu)化了選擇性提取和含量測(cè)定的方法,希望為維藥蜀葵花的質(zhì)量控制、開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)為其他維藥分析提供可供借鑒的分析技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、DGU-20A5在線脫氣機(jī)、LC-solution工作站); KQ3200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); XA-1型多功能粉碎機(jī)(江蘇姜堰市分析儀器廠); ZK-82B真空干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);賽多利斯BS224S型電子天平(德國(guó))。

1.2 試劑

蘆丁(批號(hào):0080-9705,中國(guó)食品藥品檢定研究院);槲皮素(批號(hào):100081,中國(guó)藥品生物制品檢定所);山柰酚對(duì)照品(批號(hào):29029,中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇、乙腈為色譜純;水為高純水;其他試劑均為分析純。維吾爾藥材蜀葵花是2013年7月購(gòu)自喀什地區(qū)莎車縣維吾爾醫(yī)院生藥庫(kù)房的干燥花,經(jīng)本學(xué)院生物與地理系司馬義教授鑒定為錦葵科蜀葵屬植物蜀葵(Althaearosea(L) Gavan)的干燥花。用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)60目篩,裝試劑瓶，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 對(duì)照品溶液的制備

分別準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重的蘆丁、槲皮素及山柰酚對(duì)照品各5.0 mg于25 mL容量瓶中,用甲醇完全溶解,稀釋并定容至刻度,搖勻,得200 μg/mL蘆丁、槲皮素及山柰酚對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液,在4 ℃冰箱里保存。使用時(shí)可以根據(jù)所需要的濃度混合并稀釋。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別準(zhǔn)確吸取不同體積蘆丁、槲皮素及山柰酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于7個(gè)10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,在4 ℃冰箱里保存。7組混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度范圍分別為:蘆丁(12.5～200 μg/mL)、槲皮素(12.5～150 μg/mL)、山柰酚(12.5～150 μg/mL)。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取干燥、粉碎、過(guò)篩(60目)的蜀葵花粉末1.0 g,置于50 mL錐形瓶中,加75%(v/v)甲醇(25 mL)浸泡1 h,超聲提取30 min,浸泡1 h,再超聲30 min,抽濾除渣,50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,放置至室溫,用甲醇定容至25 mL,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

1.5 色譜條件

色譜柱:Agilent HC-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相:甲醇/0.4%(v/v)磷酸(50∶50, v/v);流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.6 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試溶液,按2.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣10 μL,記錄色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法及溶液的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-16]考察了75%(v/v)甲醇(或乙醇)索氏提取法、75%(v/v)甲醇(或乙醇)超聲提取法、75%(v/v)甲醇(或乙醇)浸泡法(24 h)。結(jié)果表明,用75%(v/v)甲醇超聲提取30 min,浸泡1 h,再超聲提取30 min的方法,蘆丁、槲皮素及山柰酚的提取率達(dá)到最高,而且超聲提取操作簡(jiǎn)單易行，能耗較低,快速高效提取有助于保持3種目標(biāo)物穩(wěn)定。故選擇這種方法提取蜀葵花中蘆丁、槲皮素及山柰酚等有效成分。

2.2 色譜峰的確定

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品和提取液的色譜圖。標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中蘆丁、槲皮素及山柰酚的保留時(shí)間分別為5.923、13.314、22.592 min,提取溶液中蘆丁、槲皮素及山柰酚的保留時(shí)間分別為5.949、13.374、22.703 min。通過(guò)保留時(shí)間初步確定3個(gè)色譜峰的歸屬。為進(jìn)一步驗(yàn)證色譜峰的歸屬,用二極管陣列檢測(cè)器采集分析物的吸收光譜圖。我們將3個(gè)物質(zhì)對(duì)應(yīng)色譜峰的光譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品的光譜圖進(jìn)行對(duì)比,各物質(zhì)的特征吸收光譜峰的峰位基本吻合,兩種光譜圖的差異可能是由于溶劑及雜質(zhì)的干擾以及二極管陣列檢測(cè)器采樣精度不足造成的(見圖2)。因此,根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中3個(gè)峰的保留時(shí)間,以及3個(gè)組分光譜峰位的吻合程度,可以證明色譜圖中3個(gè)物質(zhì)的歸屬。

圖 2 (a)提取色譜峰和(b)對(duì)照品的紫外-可見吸收光譜圖Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of (a) chromatographic peaks and (b) standard samples

圖 1 (a)混合對(duì)照品和(b)供試品的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of (a) mixed reference substances and (b) sample

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

二極管陣列檢測(cè)器能夠在一次運(yùn)行中同時(shí)采集分析物的吸收光譜圖和色譜圖,為分析物的直接定性以及選擇最佳波長(zhǎng)奠定基礎(chǔ)。采集200～400 nm的吸收光譜圖,發(fā)現(xiàn)蘆丁在255 nm和350 nm處、槲皮素在254 nm和370 nm處、山柰酚266 nm和366 nm處有最大吸收。兼顧蘆丁、槲皮素、山柰酚的最大吸收波長(zhǎng),最終確定360 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)[17,18],保證每種分析物都有較高的靈敏度和較少的干擾,滿足定量分析的要求。

2.4 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)參考文獻(xiàn)[19-24],我們考察了不同體積比的甲醇-乙酸、甲醇-0.1%(v/v)磷酸、甲醇-0.4%(v/v)磷酸、乙腈-磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí),樣品中各個(gè)有效成分的分離情況。如圖1a所示,當(dāng)體積比為50∶50的甲醇-0.4%(v/v)磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí),蘆丁、槲皮素及山柰酚峰形良好,且達(dá)到基線分離。圖1b是在優(yōu)化的提取條件下提取液的色譜圖,在此流動(dòng)相條件下,3種分析物與其他雜質(zhì)峰很好地分離。蘆丁、槲皮素、山柰酚與相鄰雜峰之間的分離度可分別達(dá)到1.438、1.244、4.11。因此,確定甲醇-0.4%磷酸(50∶50, v/v)為流動(dòng)相。二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)到的吸收光譜信號(hào)也與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本一致,確認(rèn)圖1b中3種物質(zhì)的出峰時(shí)間。同時(shí),我們也根據(jù)保留時(shí)間判定提取液中是否含有3種分析物。圖3為提取液的加標(biāo)色譜圖,進(jìn)一步證明了3種物質(zhì)的存在,并確認(rèn)了它們的保留時(shí)間。

圖 3 蜀葵花樣品加標(biāo)色譜圖Fig. 3 Chromatogram of the spiked Althaea rosea (L) Gavan sample

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取12.5、25、50、100、125、150 μg/mL的對(duì)照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣(n=6),記錄優(yōu)化的色譜條件下的峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到蘆丁、槲皮素、山柰酚的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(見表1)。

2.6 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液,在優(yōu)化的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次,蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為1.2%、1.4%、1.3% (n=5)。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取蜀葵花樣品5份,每份約1.0 g,按優(yōu)化的條件提取和測(cè)定,計(jì)算樣品中蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積RSD的平均值,分別為1.2%、2.2%、2.0%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重現(xiàn)性良好。

表 1 3種分析物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients and linear ranges of the three analytes

y: peak area;x: mass concentration, μg/mL.

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液,分別放置0、3、6、9、12 h后,在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行分析。蘆丁、槲皮素、山柰酚峰面積的RSD分別為2.2%、1.9%、1.8%,表明蜀葵花提取液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知蘆丁、槲皮素和山柰酚含量的蜀葵花樣品3份,每份約0.5 g,分別添加不同量的蘆丁、槲皮素和山柰酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.2節(jié)方法制備加標(biāo)樣品溶液,按1.5節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表2。

表 2 樣品的加標(biāo)回收率(n=5)Table 2 Recoveries of the spiked samples (n=5)

2.10 樣品含量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取蜀葵花樣品提取液,進(jìn)樣10 μL,在優(yōu)化的色譜條件下平行測(cè)定5次。樣品中蘆丁、槲皮素、山柰酚的含量分別為595.7 μg/g(RSD=1.1%)、77.60 μg/g(RSD=0.53%)、88.69 μg/g(RSD=0.69%)。

3 結(jié)論

本文建立了維藥蜀葵花中蘆丁、槲皮素及山柰酚3種物質(zhì)的優(yōu)化提取方法。以75%(v/v)甲醇為提取劑,通過(guò)超聲實(shí)現(xiàn)高效提取。同時(shí)優(yōu)化了液相色譜分析3種物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)條件,3種物質(zhì)在25 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。該方法簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確可靠、精密度較高,可以用于同時(shí)測(cè)定蜀葵花中蘆丁、槲皮素及山柰酚的含量。本文不但可以為蜀葵花資源的深度開發(fā)利用、藥用價(jià)值研究以及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù),樣品提取和分析過(guò)程也可為其他維藥的分析提供借鑒。

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Determination of rutin, quercetin and kaempferol inalthaearosea(L) Gavan for Uyghur medicine by high performance liquid chromatography

MUHETAER5Tu’erhong1,2, RESALAT5Yimin1, CHU Ganghui1,2,YIN Xuebo1,2, MUNIRA5Abudukeremu2*

(1.CollegeofChemistryandEnvironmentalSciences,KashgarUniversity,Kashgar844006,China;2.XinjiangLaboratoryofNativeMedicinalandEdiblePlantResourcesChemistry,Kashgar844006,China)

Uyghur medicine is one important part of the national medicine system. Uyghur medicine modernization, namely the study of effective components with modern technologies, is the only way for the scientification, standardization, and industrialization of Uyghur medicine. Here we developed a selective extraction method for rutin, quercetin and kaempferol inAlthaearosea(L) Gavan. The three active species were determined by high performance liquid chromatography (HPLC) with HC-C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) and the mobile phase of CH3OH-0.4% H3PO4(50∶50, v/v). Rutin, quercetin and kaempferol were baseline separated with each other and the interference species with flow rate of 1.0 mL/min and column temperature of 30 ℃. Under the optimal conditions, linear correlation were obtained in the mass concentration range of 12.5-150 μg/mL (r=0.999 8) for rutin, 12.5-125 μg/mL (r=0.999 9) for quercetin, and 12.5-125 μg/mL (r=0.998 8) for kaempferol. The recoveries (n=5) of rutin, quercetin and kaempferol were 100.25% (RSD=1.1%), 97.60% (RSD=0.47%) and 97.75% (RSD=0.71%), respectively. The method can be used to determine the contents of rutin, quercetin and kaempferol inAlthaearosea(L) Gavan and provide the guidance for the analysis of the flavonoids in other Uyghur medicines.

high performance liquid chromatography (HPLC); rutin; quercetin; kaempferol;Althaearosea(L) Gavan

10.3724/SP.J.1123.2015.05008

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏?jì)劃重點(diǎn)課題項(xiàng)目(XJEDU2011147).

2015-05-08

O658

A

1000-8713(2015)12-1269-05

* 通訊聯(lián)系人.E-mail:munira818@163.com.