基于電遷移的蛋白質(zhì)制備技術(shù)和方法新進(jìn)展

郝斐然, 付 斌, 張養(yǎng)軍, 錢(qián)小紅

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

專論與綜述

基于電遷移的蛋白質(zhì)制備技術(shù)和方法新進(jìn)展

郝斐然, 付 斌, 張養(yǎng)軍*, 錢(qián)小紅*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所, 北京蛋白質(zhì)組研究中心, 蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 102206)

基于電遷移的蛋白質(zhì)制備技術(shù)是對(duì)一類分離和制備技術(shù)的統(tǒng)稱,其特征是在電場(chǎng)的作用下對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離和純化制備,這種技術(shù)在生物大分子和蛋白質(zhì)組的研究中應(yīng)用廣泛?；陔娺w移的制備技術(shù)主要包括制備型電泳、制備型電色譜、制備型等電聚焦和自由流電泳等。本文對(duì)每種制備型電遷移裝置的設(shè)計(jì)、特點(diǎn)和基于該種裝置的各種應(yīng)用方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)闡述,并列舉了一些實(shí)例。另外,微量級(jí)制備型電泳因分離度高、回收率高以及高效快速的優(yōu)點(diǎn),在微量級(jí)生物樣本分析中發(fā)揮著日益重要的作用,近年來(lái)備受關(guān)注,本文也著重關(guān)注了這方面的進(jìn)展,并對(duì)基于電遷移的制備技術(shù)做了展望。

電遷移制備技術(shù);制備型電泳;制備型電色譜;制備型等電聚焦;自由流電泳;微量級(jí)制備型電泳;蛋白質(zhì);綜述

蛋白質(zhì)的分離純化對(duì)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)組的研究和應(yīng)用具有重要意義,但由于蛋白質(zhì)種類多,動(dòng)態(tài)范圍寬,其分離和制備面臨巨大挑戰(zhàn)[1]。目前常用的蛋白質(zhì)分離制備技術(shù)主要包括高效液相色譜和電遷移技術(shù)。隨著蛋白質(zhì)特別是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入,這兩種技術(shù)都取得了很大進(jìn)展。本文主要對(duì)基于電遷移的蛋白質(zhì)分離制備技術(shù)的新進(jìn)展進(jìn)行評(píng)述。基于電遷移的蛋白質(zhì)制備技術(shù)是對(duì)一類蛋白質(zhì)制備技術(shù)的統(tǒng)稱,其特征是在電場(chǎng)的作用下對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行分離和純化制備[2]?；陔娺w移的分離技術(shù)的原理是利用樣品相對(duì)分子質(zhì)量大小不同和所帶電荷差異等,使其在電場(chǎng)中遷移的速度不同,從而實(shí)現(xiàn)彼此分離。被分離的樣品再經(jīng)過(guò)諸如制備型洗脫裝置、餾分收集器等收集裝置收集后即可實(shí)現(xiàn)樣品的制備。按照樣品在電遷移分離過(guò)程中受力的差異,可將其分為制備型電泳、制備型電色譜、制備型等電聚焦以及自由流電泳等。按照所用的分離介質(zhì)的不同,又可將基于電遷移的制備技術(shù)分為固相介質(zhì)制備技術(shù)和無(wú)介質(zhì)制備技術(shù)。而依據(jù)制備量級(jí)的不同,還可分為大量級(jí)制備技術(shù)和微量級(jí)制備技術(shù)[3-6]。本文針對(duì)以上不同類別的制備型電遷移裝置設(shè)計(jì)及其應(yīng)用進(jìn)行評(píng)述和展望。

1 制備型電泳裝置及應(yīng)用

制備電泳是依據(jù)分離對(duì)象帶電性質(zhì)差異,進(jìn)而產(chǎn)生電遷移速率不同來(lái)進(jìn)行分離,并以此純化和制備生物樣品的一種方法[7]。與常規(guī)的分析型電泳相比,制備電泳上樣量大、可在線收集制備所需的目標(biāo)物質(zhì),以便進(jìn)一步深入分析。制備電泳技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)在核酸、多肽及蛋白質(zhì)等生物物質(zhì)的制備中得到了廣泛的應(yīng)用[8-10]。

傳統(tǒng)的制備型電泳均為制備型凝膠電泳,以變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠作為分離介質(zhì),將兩個(gè)緩沖液槽安裝在垂直電泳系統(tǒng)凝膠的上下兩端,以電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力實(shí)現(xiàn)樣品的分離。收集樣品時(shí),傳統(tǒng)的制備電泳一般將半透膜放置在凝膠底部,用于截留脫離凝膠的大分子樣品并減少電解時(shí)產(chǎn)生的氣泡干擾,起到穩(wěn)定電流的作用。另外,在凝膠底部不斷有緩沖液流過(guò)與半透膜之間較微小的空間,通過(guò)凝膠下端的管道,帶出這些從分離凝膠中遷移出的生物大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)等,實(shí)現(xiàn)這些生物大分子的分離制備。

制備電泳的典型裝置可追溯于1964年Ornstein[11]提出的圓盤(pán)電泳原理。其中具有代表性的應(yīng)用是1968年Lewis等[12]利用制備電泳純化牛生長(zhǎng)激素和催乳素。但在這些實(shí)例中,制備電泳并非專門(mén)的分離制備儀器而只是利用圓盤(pán)電泳的簡(jiǎn)單裝置。Lewis等在實(shí)驗(yàn)中使用了兩種不同長(zhǎng)度的分離介質(zhì)凝膠柱,凝膠柱的截面積均為15.8 cm2,長(zhǎng)度分別為3.4 和6.8 cm,周?chē)捎美鋮s水保持凝膠柱外側(cè)溫度在5 ℃以下。凝膠柱下方用流速為1 mL/min的0.05 mmol/L NH4HCO3緩沖液作為流動(dòng)相,從凝膠柱遷移出的蛋白質(zhì)被攜帶至餾分收集器,每個(gè)餾分為2 mL。同時(shí)他們的裝置還附加有流動(dòng)池,采用紫外吸收方法進(jìn)行檢測(cè),對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行在線紫外吸收分析。

Lewis等[12]將50 mg牛腦垂體提取物上樣到直徑為4.5 cm的圓盤(pán)電泳裝置上,經(jīng)過(guò)5 h的電泳,收集其中紫外吸收峰最強(qiáng)的餾分,并在相同條件下再次進(jìn)行制備電泳,收集同樣時(shí)間的餾分。類似于采用分析型液相色譜方法多次上樣多次收集同一餾分的蛋白質(zhì)制備方法,借此實(shí)現(xiàn)較大規(guī)模的目標(biāo)物質(zhì)的制備。

此后,日本科學(xué)家Akaiwa[13]也設(shè)計(jì)了多套制備電泳裝置。其中一套裝置如圖1所示,使用的是圓柱形的凝膠,凝膠外部配置有大體積的正極電極液槽,同時(shí)起到冷卻作用。凝膠下部有收集通道,與正極電極液槽中的電極液以半透膜相隔,以收集從凝膠中遷移出的蛋白質(zhì)。采用這種裝置,Akaiwa分離并制備了人血紅蛋白、結(jié)合珠蛋白的混合物以及雙白蛋白。雖然Akaiwa的裝置在設(shè)計(jì)上比前人的制備裝置前進(jìn)了一步,如設(shè)有專門(mén)用于蛋白質(zhì)制備的收集通道、專門(mén)的連接部件和循環(huán)冷卻水散熱部件,但由于整個(gè)裝置仍然與圓盤(pán)電泳原理相同,因此分離與制備效果并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的提升。在這種模式下,要提高分辨率就必然要增加凝膠長(zhǎng)度,導(dǎo)致電泳時(shí)間的增長(zhǎng)。例如,Akaiwa在分離與制備蛋白質(zhì)時(shí),收集了100個(gè)餾分,用時(shí)約9 h。

圖 1 Akaiwa設(shè)計(jì)的制備電泳裝置原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the preparative electrophoresis apparatus designed by Akaiwa

1986年,Carpenter等[14]設(shè)計(jì)了一套平板制備電泳系統(tǒng),用于分離制備蛋白質(zhì)樣品。這套系統(tǒng)使用3 mm厚的聚丙烯酰胺凝膠作為固相介質(zhì),在凝膠中插入相距0.5 mm的兩張半透膜,上游的半透膜所接觸的凝膠濃度為4%,下游的半透膜接觸的凝膠濃度為35%,這樣就能使相對(duì)分子質(zhì)量在10至1 000 kDa的蛋白質(zhì)滯留在兩張膜之間,并被流過(guò)的電極液所洗脫,從而實(shí)現(xiàn)分離和收集的目的。洗脫過(guò)程可以是連續(xù)的,流速為0.25 mL/min；也可以是有間斷的,平均流速為0.025 mL/min,每600 s進(jìn)行一次收集,收集時(shí)放空整個(gè)收集腔,放空時(shí)間為40 s。整個(gè)過(guò)程中要隨時(shí)防止氣泡產(chǎn)生,以免干擾電泳正常進(jìn)行。Lim等[15]進(jìn)一步設(shè)計(jì)了如圖2所示的一套新型制備電泳系統(tǒng)。這套裝置有兩個(gè)電泳槽,較大的電泳槽用于進(jìn)行制備電泳分離,較小的則用于進(jìn)行Bio-Marker對(duì)比實(shí)驗(yàn)。制備電泳區(qū)底部有半透膜,凝膠底部有收集通道,通過(guò)外部的輸液泵不斷地將電極緩沖液輸送至此收集通道,帶走從凝膠底部遷移出的蛋白質(zhì),完成蛋白質(zhì)的分離制備。這套裝置的凝膠厚度不到2 mm,較小的制備電泳膠厚度提供了很好的散熱效率,因而能使電泳在高電壓下連續(xù)進(jìn)行,從而提高分辨率,并減少分離制備的時(shí)間。

圖 2 Lim等設(shè)計(jì)的制備電泳裝置原理示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the preparative electrophoresis apparatus designed by Lim et al

此后出現(xiàn)了商品化的圓盤(pán)形制備型電泳儀。2006年,Zerefos等[16]利用BioRad公司的制備電泳儀(Preparative LDS-PAGE PrepCell)處理了人尿樣本,分離制備了80個(gè)尿蛋白餾分,并采用1D SDS-PAGE (one dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)和2-DE (two dimensional gel electrophoresis)與MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry)聯(lián)用分析方法對(duì)收集的餾分進(jìn)行表征。結(jié)果表明,制備電泳可顯著提高后續(xù)2-DE的分辨率,并有助于低相對(duì)分子質(zhì)量和低豐度的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜檢出。Fountoulakis等[17]利用同樣的裝置對(duì)小鼠肝臟蛋白質(zhì)進(jìn)行了預(yù)分離。上樣量為50 mg蛋白質(zhì)提取液,收集了80個(gè)餾分,每個(gè)餾分為10 mL,經(jīng)超濾后每個(gè)餾分減少為0.2 mL,回收的蛋白質(zhì)總量約為12 mg。將收集到的各個(gè)餾分與原樣本的2-DE分析結(jié)果對(duì)比,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)預(yù)分離的餾分在2-DE凝膠中的蛋白質(zhì)點(diǎn)的強(qiáng)度與數(shù)量顯著多于原樣本。質(zhì)譜分析結(jié)果表明,有5個(gè)低豐度蛋白質(zhì)首次被鑒定。

李彧娜等[18]將非變性制備電泳用于微孢根霉的華根霉變種中兩個(gè)葡萄糖淀粉酶同工酶的制備,考察了電泳緩沖系統(tǒng)、凝膠濃度和凝膠長(zhǎng)度對(duì)分離制備效果的影響。使用Ornstein-Davis[11,19]系統(tǒng)分離同工酶,用0.02 mol/L pH 6.2的乙酸鈉-乙酸緩沖液洗脫,在長(zhǎng)6 cm的7%非變性凝膠中,對(duì)兩個(gè)性質(zhì)十分相近的同工酶進(jìn)行了有效的分離制備。

圓盤(pán)形制備電泳技術(shù)相較于其他制備方法,最主要的優(yōu)勢(shì)在于分辨率高。但其缺點(diǎn)是制備時(shí)間長(zhǎng),通常需要十幾個(gè)小時(shí)才能達(dá)到滿意的分離和制備,同時(shí)裝置對(duì)冷卻的要求非常高。這是由于圓盤(pán)形制備電泳裝置多用于克級(jí)蛋白質(zhì)的純化,所采用的分離介質(zhì)(通常是凝膠)的截面積較大,而截面積越大,介質(zhì)中心與邊緣的溫差就越大,從而可能導(dǎo)致分離物條帶異常。此外,圓盤(pán)形制備電泳通常需要通過(guò)緩沖液帶出并收集不同餾分,使得餾分?jǐn)?shù)量多且每個(gè)餾分中樣品濃度低,經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)同一樣品會(huì)被收集至多個(gè)餾分中,不同樣品也有可能被收集到同一餾分中(如遇到電遷移性質(zhì)相近的樣品),這都不利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。目前,隨著生物技術(shù)的發(fā)展,最初用于純化蛋白質(zhì)或者核酸的制備電泳裝置已逐漸被操作更方便、自動(dòng)化程度更高、分離純化效果更好的高效液相色譜所代替。

2 制備型電色譜裝置及應(yīng)用

制備型電色譜與制備型電泳原理類似,主要區(qū)別在于電色譜是在液相色譜系統(tǒng)中加入電場(chǎng),依據(jù)生物大分子的親水性或疏水性以及質(zhì)荷比性質(zhì)的差異進(jìn)行分離[20]。

在電色譜裝置中,影響最終分離效果的因素很多,如色譜柱填料、離子強(qiáng)度、電場(chǎng)強(qiáng)度、離子交換能力、用于冷卻的附件以及裝置大小等。電色譜裝置在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的熱量和氣泡,影響離子的遷移行為,因此散熱、驅(qū)除氣泡和減少條帶擴(kuò)散是設(shè)計(jì)電色譜裝置時(shí)需要考慮的難題之一。同樣,在對(duì)電色譜中各種分子遷移建模時(shí),也需要考慮很多重要因素諸如共離子遷移、補(bǔ)償離子遷移、熱效應(yīng)、電滲流以及對(duì)流因素等[21,22]。

最早研究制備型電色譜的是Porath等[23],利用纖維素粉末作為分離介質(zhì),填充在長(zhǎng)約150 cm、直徑約5 cm的玻璃管中,在通電的情況下以此制備柱分離了氨基酸及相關(guān)物質(zhì)。還使用此制備柱進(jìn)行了區(qū)帶電泳實(shí)驗(yàn),以85 mA的電流電泳45 h,成功分離制備了半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和亮氨酸,這幾種氨基酸的制備量各為100 μmol。隨后,又以85 mA的電流電泳41 h分離制備以上4種氨基酸各2.25 mmol。

1993年,Rudge等[21]設(shè)計(jì)了如圖3所示的一套新的制備電色譜系統(tǒng)并建立了數(shù)學(xué)模型,分析了溶質(zhì)在電色譜內(nèi)遷移的規(guī)律。使用尼龍膜將電極附近的緩沖液和通過(guò)電泳柱的緩沖液分隔開(kāi),使電極產(chǎn)生的氣泡不會(huì)干擾電流,而由電泳柱流出的大分子樣品則被尼龍膜相隔而不會(huì)進(jìn)入電極室,便于在線收集。

圖 3 Rudge等設(shè)計(jì)的制備型電色譜裝置原理示意圖Fig. 3 Schematic diagram of the preparative electrochromatography apparatus designed by Rudge et al

Cole等[24]于1997年設(shè)計(jì)了改進(jìn)的制備型電色譜裝置,將電極配件進(jìn)行了優(yōu)化,使電色譜裝置中的電場(chǎng)更接近于勻強(qiáng)電場(chǎng),裝置底部的半透膜阻止了電極液與色譜柱洗脫液的混合,同時(shí)也使電極處產(chǎn)生的氣泡和其他電解產(chǎn)物不會(huì)干擾生物大分子的制備。Tellez等[25]研究了商品化的排阻色譜和酶改性排阻色譜作為電色譜裝置在蛋白質(zhì)制備方面的差異,并通過(guò)對(duì)葡聚糖排阻色譜和瓊脂糖排阻色譜酶改性的水化處理,實(shí)現(xiàn)了對(duì)β乳白蛋白的高效分離制備,還成功制備了乳清中的四種主要蛋白質(zhì)。

Rhodes等[26]設(shè)計(jì)了更為復(fù)雜的自由流制備電泳和色譜相結(jié)合的裝置。蛋白質(zhì)樣品通過(guò)液相色譜系統(tǒng)的低壓泵系統(tǒng)加入到柱內(nèi)。這套裝置的優(yōu)點(diǎn)在于分離柱的直徑適中,既避免了因制備柱直徑過(guò)大導(dǎo)致色譜柱內(nèi)劇烈的熱對(duì)流對(duì)樣品分離的影響,又克服了因制備柱直徑過(guò)小導(dǎo)致的制備通量太小的缺點(diǎn)。此外,該裝置還配置有壓力探測(cè)器,用于監(jiān)測(cè)柱上的壓力。當(dāng)柱上壓力為零時(shí),柱內(nèi)電滲流會(huì)自動(dòng)補(bǔ)充色譜泵的流量,不會(huì)產(chǎn)生樣品的側(cè)向擴(kuò)散。

此外,馮蕾等[27]還考察了制備型電色譜分離小分子生物物質(zhì)的可行性及影響因素。其使用的電色譜更像是凝膠電泳,因?yàn)樵谏V柱內(nèi)填充的是排阻凝膠。以pH 4.6的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液為流動(dòng)相,考察分離介質(zhì)、電場(chǎng)方向、電場(chǎng)大小和斷電時(shí)間對(duì)單磷酸腺苷酸(AMP)和二磷酸腺苷酸(ADP)混合物分離度和樣品回收率的影響。結(jié)果顯示具有很大孔徑的排阻凝膠色譜有利于樣品的分離。電泳方向與流動(dòng)相流動(dòng)方向一致時(shí),電場(chǎng)越大,分離度越好,但回收率越低;電泳方向與流動(dòng)相流動(dòng)方向相反時(shí),通電時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),且分離度差,但回收率高。在樣品到達(dá)電極前停止通電,可以將AMP與ADP分離,且可減少電解對(duì)樣品的破壞。以上結(jié)果表明建立的制備電色譜系統(tǒng)可用于離子型小分子生物物質(zhì)的分離制備。

3 制備型等電聚焦裝置及應(yīng)用

等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)技術(shù)是一種利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等電點(diǎn)(pI)不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。每種蛋白質(zhì)都有與之對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)所處環(huán)境的pH值與pI值相等時(shí),蛋白質(zhì)分子呈電中性,不會(huì)在電場(chǎng)中遷移。在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì),當(dāng)通入直流電時(shí),兩性電解質(zhì)會(huì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,處于這個(gè)電場(chǎng)和pH梯度中的蛋白質(zhì)會(huì)遷移至與其pI值相等的pH值處并停止在此位置,從而使pI值不同的蛋白質(zhì)相互分離。等電聚焦電泳是十分出色的分析量級(jí)的技術(shù),但是在蛋白質(zhì)制備方面卻需要克服很多困難[28]。

Ivory[28]對(duì)基于等電聚焦的制備型等電聚焦的發(fā)展進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)述,總結(jié)了等電聚焦尤其是制備型等電聚焦存在的內(nèi)在缺陷。首先,許多被分離物質(zhì)在它們的等電點(diǎn)時(shí)溶解度非常小;其次,整個(gè)樣品幾乎不可能通過(guò)這種方法被完全聚焦,要么會(huì)在等電點(diǎn)處降解(如核酸),要么沒(méi)有一個(gè)真正意義上的等電點(diǎn);最后,與色譜技術(shù)類似,等電聚焦是批量處理技術(shù),很難成為大批量連續(xù)制備技術(shù)。

最早的制備型等電聚焦被稱作“循環(huán)等電聚焦”(recycling isoelectric focusing, RIEF),在該裝置中,采用孔徑為10～25 μm的尼龍網(wǎng)將等電聚焦區(qū)間分為10～20個(gè)隔間,其間填充有1%～2%的兩性電解質(zhì)和待聚焦蛋白質(zhì),通過(guò)一個(gè)微型蠕動(dòng)泵和聚焦電壓進(jìn)行蛋白質(zhì)的聚焦。在此基礎(chǔ)上,最大的裝置改進(jìn)是加入了外部制冷裝置,這使得高壓聚焦得以實(shí)現(xiàn)。在此之后有了諸如BioRad公司的Rotofor、Rainin公司的RF3和MinipHor等商品化的制備型等電聚焦儀。黃峙等[29]以純?cè)逅{(lán)蛋白為材料,采用Rotofor系統(tǒng)進(jìn)行液相等電聚焦純化純?cè)逅{(lán)蛋白的α、β亞基。上樣量為25 mg的純?cè)逅{(lán)蛋白經(jīng)過(guò)兩次液相等電聚焦,分別得到5.1 mgβ亞基和4.7 mgα亞基,其pI值分別為4.20和4.85,總回收率為39.2%,光譜檢測(cè)表明其活性基本不變?？梢?jiàn)基于溶液聚焦的裝置用于蛋白質(zhì)分離制備是可行的。

Ivory等[30]還介紹了動(dòng)態(tài)電場(chǎng)梯度聚焦(dynamic field gradient focusing, DFGF)。這種方法是在等電聚焦的軸向施加一個(gè)梯度電場(chǎng),并在電場(chǎng)強(qiáng)度的反方向施加一個(gè)壓力,這個(gè)壓力由輸液泵提供,帶動(dòng)緩沖液流動(dòng)。被分離的蛋白質(zhì)會(huì)因自身所帶電荷不同而在不同位置達(dá)到受力平衡,從而被分離和制備。Ivory等利用此技術(shù)對(duì)7 mg的牛血清白蛋白和7 mg的血紅蛋白進(jìn)行了分離,兩個(gè)蛋白質(zhì)在凝膠的9 cm處和19 cm處聚焦,分離度為2.64±0.503,整個(gè)過(guò)程需要15 h。

圖 5 Yan等設(shè)計(jì)的自由流電泳裝置原理示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the free flow electrophoresis apparatus designed by Yan et al

圖 4 Zilberstein等設(shè)計(jì)的制備型聚焦電泳原理示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the preparative electric focusing apparatus designed by Zilberstein et al

Zilberstein等[31,32]利用SDS-PAGE原理和等電聚焦原理,提出一種新型的“假聚焦”制備電泳,其原理如圖4所示。這種制備電泳將整個(gè)電泳區(qū)間沿負(fù)極到正極的方向分為多個(gè)隔間,每?jī)蓚€(gè)隔間之間用中性的瓊脂糖凝膠膜隔開(kāi),隔間內(nèi)充滿濃度依次升高的正電荷聚合物緩沖液。當(dāng)帶有負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)由負(fù)極向正極遷移時(shí),在某一隔間內(nèi),正負(fù)電荷會(huì)相互中和,使原來(lái)帶負(fù)電的蛋白質(zhì)變?yōu)橹行?不再向正極遷移,從而停留在此隔間內(nèi)。這種制備電泳方法從原理上與等電聚焦非常相似,但并不是真正意義上的等電聚焦,因此被稱作“假聚焦”制備電泳。Zilberstein等[31,32]據(jù)此制作了新型的液相介質(zhì)的制備電泳裝置,利用這個(gè)裝置分離并制備了多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。還研究了在這種“假聚焦”的實(shí)驗(yàn)條件下,大分子的遷移距離與相對(duì)分子質(zhì)量之間的關(guān)系,優(yōu)化了此實(shí)驗(yàn)條件下的參數(shù)。

Vykydalová等[33]基于近平滑念珠菌細(xì)胞表面性質(zhì)的不同,利用高效液相色譜結(jié)合溶液等電聚焦對(duì)近平滑念珠菌生物膜陽(yáng)性和生物膜陰性的兩種形式進(jìn)行了分離制備,其結(jié)果表明利用這種方法可以作為臨床的快速鑒定方法。

4 自由流電泳裝置及應(yīng)用

基于電遷移的制備型電泳方法還有無(wú)載體電泳,如自由流電泳(free flow electrophoresis, FFE)[2]。自由流電泳是半制備型分離技術(shù),具有可連續(xù)分離、多種模式分離、無(wú)固體支持介質(zhì)和分離條件溫和等優(yōu)勢(shì),特別適合用于生物材料的分離純化和制備[34]。FFE初期由Barrolier等[35]和Hannig[36]分別于1958年和1961年提出；此后,自由流電泳被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞和細(xì)胞器的分離[37],而20世紀(jì)90年代末生物技術(shù)的飛速發(fā)展使得自由流電泳被用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離[38,39]。

Yan等[40]設(shè)計(jì)了一套新型的自由流電泳裝置,原理如圖5所示。此套裝置的優(yōu)勢(shì)在于組裝簡(jiǎn)單、快速,有良好的散熱能力。該裝置僅需3 min即可完成組裝,比常規(guī)自由流電泳裝置(4 h)快80倍;常規(guī)裝置需要至少2 h才可將裝置中的氣泡排空,而該裝置僅需5 s,大大節(jié)約了時(shí)間。裝置的散熱性能良好,即使在63 V/cm的高場(chǎng)強(qiáng)下,裝置仍然能進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)8 h的連續(xù)工作,可將藻青蛋白、馬心肌紅蛋白和細(xì)胞色素C分離。

Shen等[41]介紹了一種基于蛋白質(zhì)質(zhì)荷比不同,利用自由流電泳分離和制備目標(biāo)蛋白質(zhì)的新方法。在不同的pH值下分離了細(xì)胞色素C、馬心肌紅蛋白和牛血清白蛋白3種蛋白質(zhì)并利用CLC Protein Workbench軟件對(duì)分離進(jìn)行了預(yù)測(cè),多組分離數(shù)據(jù)均與預(yù)測(cè)值相符。并對(duì)電泳緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化,使分辨率得到了提高。為了評(píng)價(jià)此新方法,將從豬心中粗提的細(xì)胞色素C利用自由流電泳進(jìn)行了提純,最終得到了純度為96.9%、活性為98.3%的細(xì)胞色素C,表明這種方法可用于蛋白質(zhì)的非變性提純以及下游的分析。

Eichacker等[42]利用新型的區(qū)帶電泳-自由流電泳系統(tǒng)分離了擬南芥中的類囊體膜蛋白提取物。在自由流電泳中以1 600 V電壓和85 mA電流分離并制備了300 μg的膜蛋白提取物,使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)分離制備的各個(gè)組分進(jìn)行了驗(yàn)證,表明自由流電泳系統(tǒng)的分離制備達(dá)到了預(yù)期的目的。

近年來(lái),隨著質(zhì)譜和其他方法成為蛋白質(zhì)組學(xué)中主流的分析方法,快速、連續(xù)、非變性且無(wú)固相介質(zhì)污染的自由流電泳在制備電泳領(lǐng)域發(fā)揮著日益重要的作用,自由流電泳裝置在不斷翻新,其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大[39]。

5 微量制備型電遷移裝置及應(yīng)用

傳統(tǒng)的制備型電遷移裝置的制備量級(jí)均為毫克級(jí),部分中等量級(jí)的制備電泳或電色譜,其制備量級(jí)也在數(shù)百微克級(jí)[12-14]。這種制備量級(jí)適合對(duì)某種目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化或者工業(yè)級(jí)制備,然而現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中,多數(shù)樣品總量無(wú)法達(dá)到此量級(jí)。近10年來(lái),隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入,越來(lái)越多的痕量調(diào)控蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)組學(xué)中受到廣泛關(guān)注,而微量級(jí)制備電泳也因其高分辨率及微量樣本的制備能力受到越來(lái)越多的關(guān)注。而微量級(jí)的制備勢(shì)必要求儀器的高回收率,但以上的分離制備方法中,都是通過(guò)緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的回收,在后續(xù)的處理過(guò)程中還會(huì)因脫鹽或脫SDS等操作步驟損失樣品。因此如何進(jìn)行高效的微量蛋白質(zhì)回收是微量級(jí)制備電泳的一個(gè)難題[43]。

圖 6 Gelfree 8100微量蛋白質(zhì)制備系統(tǒng)原理示意圖Fig. 6 Schematic diagram of Gelfree 8100 Fractionation System

2009年,英國(guó)Expedeon公司推出了一套新型的微量蛋白質(zhì)制備系統(tǒng)——多通道凝膠洗脫液相組分截留電泳(Gelfree 8100 Fractionation System),其原理如圖6所示。該系統(tǒng)使用凝膠洗脫液相餾分截留電泳技術(shù)(gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis, GELFREE),即基于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小的不同,把相對(duì)分子質(zhì)量在3.5～500 kDa的蛋白質(zhì)分離制備成不同組別,使用移液器在液相中回收蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)能在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)處理8個(gè)樣品。該方法相對(duì)于其他傳統(tǒng)分離制備方法具有上樣量小、重現(xiàn)性好、分辨率高、回收率高、分離速度快和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),可提高蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的可信度。

Witkowski[44]利用此套系統(tǒng)將200 μg的牛肝勻漿混合物分離成了12個(gè)組分,每個(gè)組分取4%的量重新在SDS-PAGE中上樣并銀染,得到了牛肝勻漿蛋白質(zhì)組分中3.5～150 kDa大小的蛋白質(zhì)按照相對(duì)分子質(zhì)量大小依次分布的凝膠染色圖。表明制備級(jí)的凝膠電泳的分離度接近分析型凝膠電泳的分辨率。

Yarmola等[45]還利用LabIntelligence生產(chǎn)的HPGE-1000A熒光制備電泳儀對(duì)10 μg的綠色熒光合成蛋白rGFPuv和10 μg的R-藻紅蛋白進(jìn)行了分離制備,并對(duì)收集到的蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption ionization-time of flight)質(zhì)譜分析。HPGE-1000A制備型電泳儀可對(duì)所分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行熒光分析,通過(guò)洗脫收集到被檢測(cè)的熒光蛋白質(zhì)。但由于標(biāo)記有熒光的蛋白質(zhì)與原蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量存在一定差異,故其質(zhì)譜信息通常不一致,需要通過(guò)蛋白質(zhì)洗脫時(shí)調(diào)整洗脫程序解決這一問(wèn)題,最終在質(zhì)譜的線性模式中成功檢測(cè)到了洗脫的蛋白質(zhì)。

圖 7 微量級(jí)制備型電洗脫裝置原理示意圖Fig. 7 Schematic diagram of a microscale preparative electroelution apparatus

2001年,一種新型的微量級(jí)制備型直接電洗脫裝置的應(yīng)用在Proteomics[46]和Electrophoresis[47]上發(fā)表。之所以稱這種電洗脫裝置為“直接”電洗脫裝置,是因?yàn)樗煌诘鞍踪|(zhì)的1D或者2D分離,不需要將凝膠進(jìn)行切割之后再提取其中的蛋白質(zhì)。其原理如圖7所示,該裝置正、負(fù)極端均裝有截面為矩形的中空管狀懸臂,材料為玻璃,截面尺寸為4 mm×1 mm,兩懸臂分別與正、負(fù)極緩沖液槽相連,繼而與正、負(fù)電極相連,使用時(shí),凝膠放在濾紙上,通過(guò)控制方位的裝置將正、負(fù)懸臂分別移動(dòng)至條帶的上下方,通電以進(jìn)行收集。凝膠中的蛋白質(zhì)被收集到垂直且與凝膠膠面緊密接觸的連接有正極的玻璃管中。

Buzás等[46]詳細(xì)討論了直接電洗脫與凝膠切分之后再進(jìn)行蛋白質(zhì)回收在蛋白質(zhì)層次與肽段層次的回收率的差異。直接電洗脫的速度快、回收率高,可避免凝膠中成分的污染,回收完整的蛋白質(zhì),可在酶切之前利用質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)的均一性進(jìn)行檢測(cè),唯一的不足之處是蛋白質(zhì)相對(duì)于其酶切肽段溶解度較小。對(duì)SDS-PAGE分離的2.5 μg牛血清白蛋白進(jìn)行了濃縮以及MALDI-TOF質(zhì)譜分析,在線性模式下發(fā)現(xiàn)其MH+和MH2+的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),相對(duì)分子質(zhì)量相差300 Da,這可能是由于電泳和電洗脫過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)合了小分子物質(zhì)所致。

Radko等[48]在熒光檢測(cè)、回收率、等電聚焦以及質(zhì)譜檢測(cè)方面考察了這種制備型直接電洗脫裝置。使用相對(duì)分子質(zhì)量為14～120 kDa的6種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物,經(jīng)SDS-PAGE分離,用SYPRO-red染色后進(jìn)行直接電洗脫,可以使80%以上的膠內(nèi)蛋白質(zhì)在1～12 min內(nèi)完成洗脫(洗脫電壓為1 000 V)。為了除去回收液中的鹽及SDS,使蛋白質(zhì)可直接進(jìn)行IEF分離或質(zhì)譜分析,對(duì)被回收物進(jìn)行了3次超濾離心,剩余蛋白質(zhì)質(zhì)量約為離心前的25%～33%。在質(zhì)譜分析中,回收的2 pmol胰蛋白酶抑制劑和牛血清白蛋白的信噪比約為6,這與0.2 pmol胰蛋白酶抑制劑和牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的信噪比相當(dāng)。同時(shí)回收蛋白質(zhì)的質(zhì)量數(shù)約比標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)高0.1%～0.6%,回收的牛血清白蛋白和卵白蛋白與其各自的標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量均存在較明顯的差異,而回收的碳酸酐酶與其標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)分子質(zhì)量的差異則小于0.1%,幾乎可以忽略。由于牛血清白蛋白和卵白蛋白均含有半胱氨酸,碳酸酐酶不含半胱氨酸,因此推斷出由于電泳的前處理中將蛋白質(zhì)還原,使得蛋白質(zhì)中形成了半胱氨酸-丙烯酰胺和半胱氨酸-β-巰基乙醇的結(jié)構(gòu),增加了蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量,同時(shí)SDS也可能存在部分殘留(+260 Da)。經(jīng)過(guò)超濾的蛋白質(zhì)也可進(jìn)行溶液酶切和質(zhì)譜分析,如回收的卵白蛋白的酶切產(chǎn)物在m/z1 000～2 500 之間的肽段質(zhì)量數(shù)均與其理論值相近。文獻(xiàn)中的微量級(jí)制備型電洗脫裝置在僅有25%～33%的回收量的情況下,仍然可順利進(jìn)行下游的IEF和質(zhì)譜分析,為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

相對(duì)之前的制備技術(shù),微量級(jí)制備電遷移技術(shù)已經(jīng)具有了快速、分辨率高、回收率高和成本低的優(yōu)點(diǎn)。最快的微量級(jí)制備電泳通常僅需要約2 h就可完成蛋白質(zhì)分離制備的全過(guò)程,且其回收率大都在80%以上,保證了生物體內(nèi)具有重要調(diào)控功能的低豐度蛋白質(zhì)的高靈敏檢出。而微量級(jí)制備電遷移技術(shù)也存在一些需要克服的缺點(diǎn),如裝置自動(dòng)化程度還比較低、某些商業(yè)化產(chǎn)品重現(xiàn)性差等。同時(shí)電遷移技術(shù)還有一些內(nèi)在的缺點(diǎn),比如蛋白質(zhì)在最常用的SDS-PAGE上樣前都需要進(jìn)行變性、還原、結(jié)合SDS的過(guò)程,在這一過(guò)程中蛋白質(zhì)的性質(zhì)和質(zhì)量都發(fā)生了變化。雖然一些文獻(xiàn)給出了除鹽和除SDS的方法,但回收的蛋白質(zhì)還是在質(zhì)譜分析時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量有差異,也對(duì)制備電泳的下游應(yīng)用有不利的影響。

6 結(jié)語(yǔ)

制備型電遷移技術(shù)在生物科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。在復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品的分離制備方面,制備型電遷移技術(shù)比使用最先進(jìn)的高效液相色譜技術(shù)更具優(yōu)勢(shì),微量級(jí)制備型電泳和制備型電洗脫技術(shù)不僅能提供高分辨率的快速分離,也能提供高回收率的快速洗脫,將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。制備型電遷移裝置在某種程度上開(kāi)始變得更加實(shí)用。一方面,自動(dòng)化程度越來(lái)越高的制備型電泳儀在市面上出現(xiàn),通常這些儀器都有預(yù)置的分離介質(zhì),在使用時(shí),只需要加入樣品、設(shè)置程序,即可完成目標(biāo)蛋白質(zhì)的制備。另一方面,許多設(shè)計(jì)巧妙、成本低的儀器使得分離制備不需要耗費(fèi)太多的資金也能獲得復(fù)雜程度顯著降低的蛋白質(zhì)樣品。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,例如高精度和高分辨率質(zhì)譜的出現(xiàn),整體蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析越來(lái)越受到重視,因此,整體蛋白質(zhì)的分離制備漸漸被研究人員所重視。相信在未來(lái)的研究中,將會(huì)出現(xiàn)更多的制備型電遷移裝置和技術(shù),以滿足蛋白質(zhì)科學(xué)深入研究的需要。

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Recent advances in preparative electromigration techniques for proteins

HAO Feiran, FU Bin, ZHANG Yangjun*, QIAN Xiaohong*

(StateKeyLaboratoryofProteomics,BeijingProteomeResearchCenter,BeijingInstituteofRadiationMedicine,Beijing102206,China)

Preparative electromigration techniques are a category of separation and preparation techniques based on differential electromigration principle. These techniques are widely applied in biomacromolecule and proteome researches. Related techniques mainly include preparative electrophoresis, preparative electrochromatography, preparative isoelectric focusing and free flow electrophoresis and so on. We review each kind of the preparative electromigration techniques on its apparatus designs, applications, advantages and disadvantages in detail. Microscale preparative electrophoresis is a hot spot in recent years. Its high resolution, high recovery and high efficiency make it a more prominent role in the biological sample analysis. In this review, we focus on some advances in microscale preparative electrophoresis and also give an outlook on preparative electromigration techniques in the future.

preparative electromigration technique; preparative electrophoresis; preparative electrochromatography; preparative isoelectric focusing; free flow electrophoresis; microscale preparative electrophoresis; proteins; review

10.3724/SP.J.1123.2015.09010

國(guó)家重大科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2012CB910603);國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2012AA020202);國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目(2012YQ12004407,2011YQ030139,2011YQ06008408,2013YQ14040506);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21275519,20735005,31100591).

2015-09-14

O658

A

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