五華雞J亞群禽白血病的初步凈化

李柔,盛昌樹,徐前明,陳興勇,耿照玉*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽合肥230036

2.安徽省蕪湖市畜牧獸醫(yī)局,安徽蕪湖241000

五華雞J亞群禽白血病的初步凈化

李柔1,盛昌樹2,徐前明1,陳興勇1,耿照玉1*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,安徽合肥230036

2.安徽省蕪湖市畜牧獸醫(yī)局,安徽蕪湖241000

禽白血病是由白血病/肉瘤病毒群引起的禽類多種腫瘤型疾病的總稱。該病目前尚未有有效的商品化疫苗，控制禽白血病最主要手段是病原體的凈化。試驗選用繁昌某五華種雞場父母代雞群為研究對象，前后5次采集血樣共3059份，子代1日齡雛雞肛門棉拭子采集樣本1262份。ELISA法對該群體進行了J-亞群禽白血?。ˋvian leukosisvirus-J subgroup,ALV-J）的抗原、抗體篩查，ALV p27抗原檢測試劑盒檢測了子代1日齡胎糞中ALV p27含量。分析ELISA檢測ALV-J陽性率表明，種雞ALV-J陽性率較高，達40%；五華雞保種場的子代雛雞第1～4批ALV-J陽性率分別為9.09%、5.53%、1.42%、1.30%。由此可見，該場五華雞父母代雞群經(jīng)過1個世代，4批次子代的凈化，取得較為理想的效果。分析結(jié)果可為后期J亞群禽白血病的持續(xù)凈化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

五華雞;J亞群禽白血病;初步凈化

禽白血病(Avian leukosis，AL)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科中禽反轉(zhuǎn)錄病毒屬的成員禽白血病/肉瘤病毒群病毒(ALV/RSv)引起禽類各種可傳播的良性和惡性腫瘤。在臨床上可引起禽的腫瘤性疾病、生產(chǎn)性能下降以及免疫抑制等危害，且其可垂直傳播造成本病在種群世代間持續(xù)存在。由雞分離的ALV劃分為A、B、C、D、E和J 6個亞群，其中J-亞群禽白血病病毒(Avian leukosisvirus-J subgroup,ALV-J)是一種新的外源性ALV，它比經(jīng)典ALV具有更強的致病性和傳播能力[1]。研究表明，J亞群ALV在流行病學(xué)上表現(xiàn)出新的特點，如感染宿主種類、日齡等范圍明顯擴大，混合感染嚴重[2]。目前，禽白血病尚無有效的治療方法和疫苗，給禽白血病的防治帶來了很大的難度。

五華雞作為國家級畜禽遺傳資源保護品種，具有性情活潑、敏捷、覓食力強、抗病性強、肉鮮味美、肉質(zhì)細嫩等特點。隨著禽白血病向地方品種雞蔓延的趨勢，胡曉苗等在對五華雞開展ALV-J血清學(xué)調(diào)查中，發(fā)現(xiàn)繁昌五華雞也已出現(xiàn)J亞群禽白血病感染的情況，并從解剖病變和組織病理學(xué)等方面對其進行了深入的觀察研究，得以確診[3]。當(dāng)前，許多學(xué)者開展了從切斷該病的垂直傳播途徑入手凈化種雞場，采取綜合防治措施控制該病，從而建立無禽白血病的健康雞群[4]。p27是ALV核衣殼蛋白的群特異性抗原，具有高度保守性，利用該基因檢測可反映雞群感染ALV狀況?，F(xiàn)行檢測ALV的方法有多種，如PCR技術(shù)，瓊脂擴散試驗等，其中以ELISA方法操作簡便、快速，是適合于種群凈化的普檢方法。本試驗采用ELISA法制定五華雞祖代雞J亞群禽白血病的凈化方案，研究結(jié)果為控制禽白血病在該種雞群中蔓延，保護地方雞品種資源提供有益的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物五華雞慢羽保種雞群，選自繁昌某五華雞保種場，保種群父母代1批，子代4批次。

1.1.2 試劑盒采用美國IDEXX公司ALV-J抗體檢測試劑盒檢測血清中的ALV-J抗體，ALV p27抗原檢測試劑盒（同樣來自美國IDEXX公司），其主要組成見表1。

表1 ALV p27抗原的ELISA試劑盒組成Table 1 ELISA Kit composition for detection of ALV p27Ag

1.1.3 儀器酶標儀：Model 680自動EUSA檢測儀，美國BIO-RAD公司；精密單道移液器和多道移液器：德國eppendorf公司；培養(yǎng)箱：德國Memmert公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集選取繁昌地區(qū)最大的代表性龍頭企業(yè)種雞場（年產(chǎn)種苗在400萬只以上），分別于2012年7月20日、8月14日、10月30日和2013年2月1日、4月1日對3100只留種慢羽母雞和300只留種慢羽公雞進行了5次采血及雙拭子采集，共收集血清樣本3059份，雙拭子樣本1262份。對于子代雛雞4700只采集胎糞或泄殖腔棉拭子，經(jīng)PBS溶液處理后分離上清備用。

1.2.2 間接ELISA檢測ALV-J抗體血清和蛋清制備方法參照張恒等報道[5]，并經(jīng)56℃滅活30 min，-20℃冷凍、備用。蛋清制備方法在去除蛋黃后，加入青鏈霉素雙抗后經(jīng)PBS溶液稀釋后-20℃冷凍、備用。檢測方法參照禽白血病J亞群抗體檢測試劑盒說明書，判定過程依表2。

表2 禽白血病J亞群抗體檢測結(jié)果判定Table 2 The judgement for antibody test of ALV-J

1.2.3 p27抗原檢測從肛門擠出胎糞，胎糞置于1 mL ddH2O滅菌離心管中；胎糞已經(jīng)排出的，采取泄殖腔棉拭子法進行收集，胎糞樣品應(yīng)搖勻。糞樣經(jīng)反復(fù)凍融，使更多的病毒粒子暴露，應(yīng)用于ALV p27抗原檢測試劑盒檢測。

泄殖腔棉拭子參照試劑盒說明書，判定標準見表3。

表3 禽白血病p27抗原檢測結(jié)果判定Table 3 The judgement for p27 antigen of ALV-J

1.2.4 五華保種雞群J亞群禽白血病的凈化方法（1）母系凈化第一輪凈化選擇26～28 w收集初生蛋后，采用ELISA方法對蛋清中p27抗原檢測，若發(fā)現(xiàn)為陽性者應(yīng)淘汰；第二輪檢測34 w母雞（第一輪為陰性）血清以及泄殖腔棉拭子抗原，陽性者淘汰，陰性者同時檢測血清J抗體，若3項均為陰性，該個體留種作配套純系的原種群。

（2）父系凈化第一輪凈化選擇26 w雞群，采集血清和泄殖腔棉拭子樣本后，先檢測肛拭p27抗原，陽性者淘汰；若p27抗原檢測為陰性者，檢測其血清J抗體，若3項均為陰性的個體，留種作配套純系的原種群。第二輪篩查為34 w，檢測和留種依據(jù)同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 五華種雞J亞群禽白血病的凈化結(jié)果

經(jīng)過5次樣本采集與篩選，最后確定465只陰性慢羽母系以及75只陰性慢羽父系，作為后續(xù)試驗的陰性父母代。由表4可知，繁昌五華雞母雞J亞群禽白血病平均陽性率明顯高于公雞（P＞0.01）。

表4 5次種雞血清及棉拭子檢測結(jié)果Table 4 Serum and cotton swab test results of breeder chicks in 5 times

2.24 批次雛雞凈化

為確保凈化工作的有效性，試驗采用家系和個體淘汰制，即各家系后代中出現(xiàn)陽性個體，則淘汰此家系中所有雛雞及其母本，父本視其他母本及其雛雞的陽性感染情況而定。

4批凈化結(jié)果見表5。經(jīng)過4批次雛雞凈化，禽白血病陽性率逐步下降，在第一批次中陽性率為9.09%，經(jīng)過幾輪凈化后，第四批次降至1.30%。期間共淘汰低產(chǎn)及可疑為陽性的留種母系255只，剔除精液量持續(xù)較少及可疑為陽性的留種父系43只。剩余陰性母系198只，陰性父系28只，陰性留種父母代共計226只。

表5 4批次雛雞1日齡胎糞檢測結(jié)果Table 5 Meconium test results of 1 day old chickens in 4 batches

3 討論

黃興國等對清遠麻雞祖代開展禽白血病凈化，進行連續(xù)3個世代的泄殖腔拭子采樣和ELISA檢測，及時淘汰陽性雞。清遠麻雞祖代雞第1世代(G1)陽性率為14.01%，其中公雞的陽性率為19.04%，母雞陽性率為8.16%；第2世代(G2)陽性率為9.05%，其中公雞的陽性率為15.52%，母雞的陽性率為8.16%；第3世代(G3)陽性率為4.15%，其中公雞的陽性率為6.93%，母雞的陽性率為3.40%[6]?？梢奅LISA法用于J亞群禽白血病的凈化在早期可以起到較好的凈化效果。本試驗主要對五華雞子代雞群開展J亞群禽白血病的凈化，從凈化效果看，仍存在較低的陽性率（第四批陽性率1.30%）。ELISA法檢測p27抗原作為判斷J亞群禽白血病的依據(jù)，但無法檢測所有外源性禽白血病病毒，可能是導(dǎo)致凈化不完全的主要原因。同時，伴隨禽白血病病毒凈化工作的繼續(xù)，雞群檢測p27抗原的ELISA陽性檢出率會逐漸下降。本試驗中繁昌五華雞公雞的陽性率明顯低于母雞，有報道稱公雞的生殖細胞中沒有禽白血病病毒的繁殖，僅作為病毒攜帶者并接觸傳染給其他雞[7]，且睪酮可以增強機體對禽白血病病毒的抵抗力，此外，種雞生產(chǎn)中常采用人工授精，大大減少了公雞攜帶病毒的水平傳播。

趙鵬等認為，1個苗箱內(nèi)運輸?shù)碾r雞中若存在1只雞胎糞中帶毒，則可能造成20%～30%雞只感染禽白血病病毒[8]?？梢?，1日齡禽白血病檢測及淘汰很難徹底清除外源性禽白血病病毒。張勝斌等跟蹤不同日齡蛋雞ELISA檢測結(jié)果，顯示開產(chǎn)初期和產(chǎn)蛋高峰期p27的陽性檢測率明顯升高，公、母雞陽性率檢出高峰期亦存在明顯差異，即ALV-J陽性檢出率受日齡的影響[9]。本研究小組分析禽白血病相關(guān)基因Mx1多態(tài)與禽白血病陽性率相關(guān)性，推測禽白血病陽性檢出率可能隨日齡而發(fā)生變化（已接收，未發(fā)表）。因此，有必要繼續(xù)跟蹤五華雞子代后續(xù)ALV-J陽性檢出率，探明ALV-J在其生長過程中的陽性檢出規(guī)律，依此規(guī)律，可以開展公、母雞分階段分別凈化工作，以加快凈化速度，保證凈化效果。

[1]BAI J,PAYNE LN,SKINNER MA.HPRS-103(exogenous avian leukosis virus，subgroup J)has an env gene related to those of endogenous elements EAV-0 and E51 and an E element found previously only in sarcoma viruses[J].Journal of Virology,1995,69:779-784

[2]崔治中.我國雞群白血病流行病學(xué)和防控技術(shù)研究現(xiàn)狀[C]//崔治中.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十六次學(xué)術(shù)研討會論文集.北京:中國學(xué)術(shù)期刊電子雜志出版社,2012:1

[3]胡曉苗,戴銀,潘孝成,等.安徽省五華雞J亞群禽白血病的鑒定及其病理學(xué)觀察[J].中國動物傳染病學(xué)報,2012(3):22-26

[4]張賀楠,黃秀英,劉長清.蛋種雞場禽白血病凈化研究[C]//張賀楠.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家禽學(xué)分會.安全優(yōu)質(zhì)的家禽生產(chǎn)——第十五次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集.北京:中國學(xué)術(shù)期刊電子雜志出版社,2011:5

[5]張恒,李傳龍,楊明,等.禽白血病A亞群病毒gp85的單因子血清制備及其特異性鑒定[J].微生物學(xué)報,2011,01:134-140

[6]黃興國,高明超,王政富,等.清遠麻雞禽白血病凈化效果的觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012,21:105-108

[7]歐陽金旭.ALV-J動物疾病模型的建立及囊膜基因分析[D].荊州:長江大學(xué)動物科技學(xué)院,2012:8

[8]趙鵬,崔治中,馬誠太.種蛋中禽白血病病毒P27抗原檢出率與雞群禽白血病發(fā)病率的相關(guān)性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2012,10:1618-1622

[9]張勝斌,吳天威,韋平,等.地方優(yōu)良雞種禽白血病病毒感染調(diào)查及凈化[J].中國家禽,2010,12:11-16

Preliminary Eradication forAvian leukosisVirus-J Subgroup in Wuhua Chicken

LI Rou1,SHENG Chang-shu2,XU Qian-ming1,CHEN Xing-yong1,GENG Zhao-yu1*
1.College of Animal Science and Technology/Anhui Agricultural University,Hefei230036,China
2.Wuhu Bureau of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Wuhu241000,China

Avian leukosisvirus(ALV)is the most common oncogenetic retrovirus that emerges spontaneously as a result of recombination between exogenous viruses,exogenous viruses and endogenous viruses,and exogenous viruses and non-homologous cellular genes.While there are no effective commercialized vaccines,pathogen eradication might be more operational.Parental group from Fanchang Wuhua breed conservation station were used for pathogen eradication,5 batches with a total of 3059 blood samples were collected during July 2012 to April 2013.In addition,1262 anal swab samples from 1 day old chicks were also collected.Antigen and antibody ofALV-J from blood samples were screened using ELISA method. Anal swab samples were also detected using ALV p27 antigen detection kit.The results showed that positive ALV-J in parental group was high to 40%.ALV-J positive rate to the four batches was 9.09%、5.53%、1.42%and 1.30%,respectively. In conclusion,theALV-J positive rate was controlled in a very low percentage in parental group after this eradication process. These results could be meaningful for the further eradication ofALV-J.

Wuhua chicken;Avian leukosisvirus J-subgroup;preliminary eradication

S831.7

:A

:1000-2324(2015)06-0870-04

2013-01-23

:2014-03-19

安徽省科技攻關(guān)項目(12010302058)

李柔(1991-),女,碩士在讀,主要從事家禽遺傳育種研究.E-mail:1292284829@qq.com

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:gzy@ahau.edu.cn