萵筍多酚氧化酶、過氧化物酶的特性及抑制作用研究

周向軍,楊金龍,路宛如

(天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,甘肅天水 741001)

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萵筍多酚氧化酶、過氧化物酶的特性及抑制作用研究

周向軍,楊金龍,路宛如

(天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,甘肅天水 741001)

采用分光光度法測(cè)定萵筍多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)的活性,研究酶的穩(wěn)定性、溫度、pH、底物濃度及幾種抑制劑對(duì)其活性的影響,建立相應(yīng)酶促動(dòng)力學(xué)方程,利用正交實(shí)驗(yàn)探討最佳抑制條件。結(jié)果表明,PPO和POD最適溫度分別為50℃和40℃,最適pH分別為6.0和6.5,隨溫度不斷升高,PPO和POD活性逐漸下降。動(dòng)力學(xué)方程分別為V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])和V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S])。對(duì)PPO抑制強(qiáng)弱為:VC>L-Cys>NaHSO3>檸檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸,對(duì)POD抑制強(qiáng)弱為:EDTA>VC>L-Cys>檸檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。正交實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)PPO最佳抑制條件為:NaHSO39mmol/L、L-Cys 5mmol/L及VC5mmol/L。對(duì)POD最佳抑制條件為:VC0.2mmol/L、EDTA 0.2mmol/L及L-Cys 1.4mmol/L。

萵筍,多酚氧化酶,過氧化物酶,特性,抑制

萵筍(Asparagusplettuce)為菊科草本植物,在我國(guó)各地普遍栽培。萵筍適合鮮切或速凍等加工,但在加工過程中極易發(fā)生褐變。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)和過氧化物酶(peroxidase,POD)是引起果蔬褐變的關(guān)鍵酶,當(dāng)氧氣存在時(shí),前者能催化內(nèi)源酚氧化生成醌,醌與氨基酸(或蛋白質(zhì))作用生成高分子絡(luò)合物,從而導(dǎo)致褐色素的生成,色素分子量愈高,顏色愈暗[1-2],后者是H2O2在POD作用下,生成強(qiáng)氧化性的新生態(tài)氧,將酚類化合物氧化,生成各種自由基,隨后通過分子間聚合生成聚合物[3]。果蔬褐變將影響其感官品質(zhì)、市場(chǎng)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4-5]?？刂泼复俸肿兊姆椒ㄝ^多,物理法如漂燙,易導(dǎo)致果蔬質(zhì)地變軟[6],熱處理易影響果汁風(fēng)味,有一定局限性,因而目前化學(xué)法使用較多。王國(guó)英[7]研究西葫蘆PPO的特性,并比較了幾種抑制劑的抑制強(qiáng)弱。范騰[8]研究胡蘿卜的POD和苯丙氨酸解氨酶的特性和抑制條件。李曉莉[9]研究幾種抑制劑對(duì)山藥PPO的抑制強(qiáng)弱為:L-抗壞血酸>檸檬酸>蘋果酸。孔維寶[10]研究表明,L-cys并不是通過對(duì)PPO活性中心的結(jié)構(gòu)性修飾,或是發(fā)生共價(jià)結(jié)合來抑制其活性,而是直接與其酶促反應(yīng)產(chǎn)物醌類物質(zhì)結(jié)合生成無色的硫氫化合物,從而抑制褐變的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究萵筍 PPO和POD特性,探討了幾種抑制劑對(duì)其活性的影響,為深入明確萵筍褐變的機(jī)理、控制褐變提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮萵筍除去葉和纖維化不可食用部分,低溫儲(chǔ)存;VCsigma產(chǎn)品;L-Cys 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaHSO3天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;檸檬酸,EDTA 天津德縣化學(xué)試劑有限公司;苯甲酸 中國(guó)新中化學(xué)廠;琥珀酸 化學(xué)試劑廠,均為分析純;反應(yīng)混合液:100mmol/L pH 6.0磷酸緩沖液50mL,愈創(chuàng)木酚28μL,磁力攪拌溶解,加入30%H2O219μL,混勻備用。

722型可見分光光度計(jì) 上海欣茂有限公司;PHS-3D雷磁pH計(jì) 上海精密科學(xué)有限公司;TGL-20M型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶液的制備及活性測(cè)定 稱5.0g新鮮萵筍,置于研缽中,加少許石英沙,5.0mL磷酸緩沖液,冰浴研磨成勻漿,4℃,12000r/min離心15min,收集上清液,定至25mL[11]。PPO活性測(cè)定:試管中加入50mmol/L pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液4.0mL和50mmol/L鄰苯二酚溶液1.0mL,最后加入100μL酶液,立即開始計(jì)時(shí),420nm測(cè)吸光值。POD活性測(cè)定:試管中加入3mL,25mmol/L反應(yīng)混合液和0.1mL酶液,0.2mL 0.5mol/L H2O2,迅速混合,470nm測(cè)定。以吸光值變化表示酶活。定義:吸光值每分鐘變化0.01所需的酶量定義為一個(gè)活力單位(U)。

1.2.2 反應(yīng)進(jìn)程曲線 在0～15min范圍內(nèi),每隔1min,測(cè)定PPO吸光值。在0～8min范圍內(nèi),每隔30s,測(cè)定POD吸光值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),制作反應(yīng)進(jìn)程曲線,確定PPO和POD測(cè)定時(shí)間。

1.2.3 溫度對(duì)酶活性的影響和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液3.0mL在35、40、45、50、55、60、65℃下保溫10min,加入50mmol/L鄰苯二酚1.0mL,0.1mL酶液,混勻,測(cè)定OD420。酶在50、60、70、80、90℃下分別預(yù)熱一定時(shí)間,探討PPO穩(wěn)定性。反應(yīng)混合液3.0mL,在35、40、45、50、55、60℃下保溫10min,加入0.5mL酶液,測(cè)定OD470。酶在40、50、60、70、80、90℃下分別預(yù)熱一定時(shí)間,探討POD穩(wěn)定性。

1.2.4 pH對(duì)酶活性的影響 pH5.0,5.5,6.0,6.5,7.0乙酸-乙酸鈉緩沖液3.0mL,保溫10min,加入1mL鄰苯二酚溶液和0.1mL酶液,測(cè)定OD420,確定PPO最適pH。pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的反應(yīng)混合液3.0mL,保溫5min,加入0.5mL酶液,搖勻,測(cè)定OD470,確定POD最適pH。

1.2.5 不同底物濃度對(duì)酶活性的影響 50℃、pH6.0條件下,測(cè)定鄰苯二酚分別為0.001、0.002、0.004、0.005、0.008、0.01mol/L時(shí)吸光值,制作底物濃度隨時(shí)間的變化曲線,并擬合各直線斜率,計(jì)算PPO的Vmax和Km[12]。40℃、pH6.5條件下,測(cè)定愈創(chuàng)木酚分別為0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012mol/L時(shí)吸光值,制作底物濃度隨時(shí)間的變化曲線,并擬合各直線,計(jì)算POD的Vmax和Km。

1.2.6 不同抑制劑對(duì)酶活性的影響 以乙酸-乙酸鈉緩沖液為對(duì)照,加入終濃度分別為0、2、4、6、8、10mmol/L的L-Cys、VC、NaHSO3,0、20、40、60、80、100mmol/L的EDTA、檸檬酸、苯甲酸和琥珀酸,測(cè)定PPO吸光值,計(jì)算相對(duì)剩余酶活。0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2mmol/L的EDTA、VC,0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mmol/L的L-Cys,0、4、6、8、10、12mmol/L的NaHSO3,0、40、60、80、100、120mmol/L的檸檬酸、苯甲酸和琥珀酸,測(cè)定POD吸光值,計(jì)算相對(duì)剩余酶活。

相對(duì)剩余酶活(%)=測(cè)定管酶活性×100/對(duì)照管酶活性

1.2.7 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇抑制作用較強(qiáng)的幾種抑制劑進(jìn)行正交設(shè)計(jì),見表1和2。

表1 PPO正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiment of PPO

表2 POD正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal experiment of POD

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線的確定

由圖1a可知,2min內(nèi)PPO的反應(yīng)速率隨時(shí)間變化成線性增長(zhǎng),隨后反應(yīng)速率逐漸降低并趨于平緩。由圖1b可知,3min內(nèi)POD的反應(yīng)速率隨時(shí)間的變化呈線性增加,隨后曲線趨于平坦,反應(yīng)速率下降。反應(yīng)速率隨時(shí)間延長(zhǎng)降低的原因是底物濃度逐漸下降;產(chǎn)物增加加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行;隨時(shí)間延長(zhǎng)酶本身部分失活等,因此,酶活測(cè)定應(yīng)選擇反應(yīng)初速率,避免上述因素的干擾[13],本實(shí)驗(yàn)PPO和POD測(cè)定時(shí)間分別2min和3min。

圖1 酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線Fig.1 Standard curve of enzyme catalysis

注：a：PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線；b：POD反應(yīng)進(jìn)程曲線。

圖2 溫度對(duì)酶活性及穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on enzyme and stabilities注：a,c分別表示溫度對(duì)PPO和POD活性的影響； b,d分別表示PPO和POD對(duì)溫度的穩(wěn)定性。

2.2 PPO和POD的最適溫度及穩(wěn)定性

PPO吸光值隨溫度的變化見圖2a,在30～50℃范圍內(nèi),隨溫度升高,吸光值逐漸增大,50℃時(shí)達(dá)到最大值,隨后迅速下降,故最適溫度為50℃,這是因?yàn)殡S溫度增加,底物分子動(dòng)能增大,反應(yīng)速率增加,當(dāng)溫度高于50℃時(shí),隨著溫度增加,蛋白質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)增大,導(dǎo)致蛋白變性[14]。由圖2b可知,隨溫度升高,酶活力逐漸下降,90℃時(shí)幾乎沒有活性。由圖2c可知,POD最適溫度為40℃,40℃以下時(shí),POD活性隨溫度的升高而逐漸增加,褐變程度加深,當(dāng)溫度大于50℃時(shí),酶活性迅速下降。由圖2d可知,隨溫度不斷升高,POD活性逐漸下降,80℃時(shí)幾乎沒有活性。

2.3 pH對(duì)萵筍PPO和POD活性的影響

由圖3a可知,隨pH升高,PPO速率上升,pH6.0時(shí)達(dá)最大值,故最適pH為6.0,繼續(xù)增大pH,PPO活性迅速下降,這可能與多酚氧化酶的活性部位含有組氨酸基團(tuán)(pK=6.0)有關(guān)[15]。由圖3b可知,pH5.5時(shí)出現(xiàn)一個(gè)肩峰,這可能是由于反應(yīng)液中存在同工酶的緣故。過酸或過堿均不利于POD活性。pH大于6.5時(shí),酶活性開始降低,故POD最適pH為6.5。

圖3 pH對(duì)酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on enzyme注：a,b分別表示pH對(duì)PPO和POD活性的影響。

2.4 不同底物濃度對(duì)萵筍PPO和POD活性的影響

底物濃度對(duì)PPO的影響及其雙倒數(shù)作圖見圖4a和圖4b,PPO的Km=0.0059mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(0.0059+[S])。底物濃度對(duì)POD的影響及其雙倒數(shù)作圖見圖4(c)和(d),求得POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。

圖4 底物濃度對(duì)酶活性的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on enzyme注：a,b分別表示PPO的v-t曲線和1/V-1/S曲線; c,d分別表示POD的v-t曲線和1/V-1/S曲線。

2.5 不同抑制劑對(duì)萵筍PPO和POD活性的影響

各抑制劑對(duì)萵筍PPO及POD活性的影響見圖5a～圖5d,IC50計(jì)算結(jié)果見表3。L-Cys可與反應(yīng)所產(chǎn)生的醌結(jié)合,形成一種穩(wěn)定的無色化合物,同時(shí)其結(jié)構(gòu)中的-COOH螯合金屬離子作用很強(qiáng),可作用于PPO中的Cu2+[16]。VC可作為酶分子中Cu2+的螯合劑,抑制酶促褐變的發(fā)生,另外VC既可作為醌的還原劑,將體系中原有的醌類還原為無色物質(zhì),甚至其可被PPO直接氧化,起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用[17-18]。NaHSO3與醌不可逆的生成無色產(chǎn)物,與此同時(shí)降低了酶作用于一元酚和二羥基酚的活力,同時(shí)NaHSO3具有漂白和抑制微生物作用[19]。檸檬酸對(duì)PPO的抑制機(jī)制是由于檸檬酸分子中的-COOH對(duì)PPO中的Cu2+有較強(qiáng)的螯合作用[20]。苯甲酸和琥珀酸主要是提供酸性環(huán)境,使PPO偏離最適pH。EDTA提供堿性環(huán)境,并具有螯合金屬離子的作用[21]。

圖5 不同抑制劑對(duì)PPO和POD的影響Fig.5 Effect of different inhibitors on PPO and POD注：a：L-Cys、VC及NaHSO3對(duì)PPO活性的影響; b：檸檬酸、琥珀酸、苯甲酸及EDTA對(duì)PPO活性的影響; c：EDTA、VC及L-Cys對(duì)POD活性的影響; d：NaHSO3、檸檬酸、苯甲酸及琥珀酸對(duì)POD活性的影響。

抑制劑對(duì)PPO的IC50(mmol/L)對(duì)POD的IC50(mmol/L)VC17740100L-Cys34280700NaHSO350199712檸檬酸217766218EDTA251960064苯甲酸3080248562琥珀酸5407032210

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

由表4可知,對(duì)PPO抑制的最佳組合為A2B1C1,即NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L,VC5mmol/L,由表5可知,A(NaHSO3)和C(VC)對(duì)PPO的抑制達(dá)到極顯著(p<0.05),B(L-Cys)的影響不顯著(p>0.05)。最佳條件下重復(fù)3次,對(duì)PPO抑制率為(35.96±0.88)%。由表6可知,對(duì)POD抑制的最佳組合為A1B2C3,即VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L,L-Cys 1.4mmol/L,由表7可知,A(VC)對(duì)POD的抑制達(dá)到極顯著(p<0.05),B(EDTA)和C(L-Cys)的影響不顯著(p>0.05)。最佳條件下重復(fù)3次,對(duì)POD抑制率為(34.97±0.31)%。

表4 對(duì)PPO抑制的正交結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment for PPO

表5 PPO方差分析Table 5 Analysis of variance for PPO

表6 對(duì)POD抑制的正交結(jié)果Table 6 Results of orthogonal experiment for POD

表7 POD方差分析Table 7 Analysis of variance for POD

3 結(jié)論

萵筍PPO和POD最適溫度分別為50℃和40℃,最適pH為6.0和6.5。隨溫度不斷升高,PPO和POD活性逐漸下降。萵筍PPO的Km=5.9×10-3mol/L,Vmax=342.566U/min·g,V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])。POD的Km=6.817×10-4mol/L,Vmax=3403.008U/min·g,V=3403.008[S]/(6.817×10-4+[S])。對(duì)PPO抑制強(qiáng)弱為:VC>L-Cys>NaHSO3>檸檬酸>EDTA>苯甲酸>琥珀酸。對(duì)POD抑制強(qiáng)弱為:EDTA>VC>L-Cys>檸檬酸>NaHSO3>琥珀酸>苯甲酸。

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Properties and inhibitions of polyphenoloxidase andperoxidase fromAsparagusplettuce

ZHOU Xiang-jun,YANG Jin-long,LU Wan-ru

(College of life science and chemistry,Tianshui Normal University,Tianshui 741001,China)

The activities of polyphenoloxidase(PPO)and peroxidase(POD)fromAsparagusplettucewere determined by spectrophotometer. Enzyme stabilities,the effects of temperature,pH,substrate concentration and several inhibitors on PPO and POD,and their corresponding reaction kinetics equation were studied. Orthogonal experiments were used to optimize inhibition technology. The results showed that the optimum temperature and pH of PPO and POD were 50℃ and 40℃,pH6.0 and pH6.5,respectively. Activities of PPO and POD decreased with increasing temperature. Kinetic equation for PPO and POD were V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])and V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S]),respectively. Inhibition effects were as follows:VC>L-Cys>NaHSO3>citric acid>EDTA>benzoicacid>succinic acid for PPO,EDTA>VC>L-Cys>citric acid>NaHSO3>succinic acid>benzoic acid for POD. Orthogonal experiments showed that the optimum inhibition conditions were as follows:NaHSO39mmol/L,L-Cys 5mmol/L and VC5mmol/L for PPO,VC0.2mmol/L,EDTA 0.2mmol/L and L-Cys 1.4mmol/L for POD,respectively.

Asparagusplettuce;polyphenoloxidase;peroxidase;properties;inhibition

2014-07-08

周向軍(1980-)，男，碩士研究生，講師，研究方向：食品酶學(xué)。

TS255.3

A

1002-0306(2015)05-0166-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.026