細菌在氨基酸首過腸道代謝中的作用

楊宇翔 慕春龍 朱偉云

(南京農業(yè)大學消化道微生物研究室，南京 210095)

單胃動物的腸道中定植著大量的細菌，其數量大約是宿主機體細胞總數的10倍。腸道細菌在體內作為獨立的一個“器官”，對宿主健康及腸道免疫起重要作用［1］。近年來研究表明，腸道細菌參與腸道中營養(yǎng)素的代謝，尤其是氨基酸。Stoll等［2］的研究表明，飼糧中有30%～60%的必需氨基酸在首過腸道代謝中被腸上皮細胞分解利用。然而，Chen等［3］通過體外培養(yǎng)發(fā)現，豬小腸上皮細胞只能代謝支鏈氨基酸，無法氧化其他必需氨基酸，故作者推測氨基酸在首過腸道代謝中的分解很有可能是腸道細菌的作用。本實驗室先前通過體外培養(yǎng)研究證明了以下觀點:來自豬小腸的腸腔細菌具有降解必需氨基酸的能力［4］。此外，我們近期的研究還發(fā)現，腸腔細菌與腸壁附著細菌對氨基酸的代謝表現出不同的能力［5］。因此，本文綜述了小腸細菌在氨基酸首過腸道代謝中的作用，以及氨基酸在小腸細菌代謝中的去路。

1 小腸細菌參與氨基酸首過腸道代謝

飼糧和內源分泌的蛋白質進入小腸后，被來源于宿主和細菌的蛋白酶、肽酶消化，生成的小肽進一步在小腸上皮細胞內分解，生成寡肽和氨基酸。這些寡肽和氨基酸可以被刷狀緣上的轉運載體從腸腔轉運至血液中［6］。然而，在仔豬上的研究發(fā)現，大量的飼糧氨基酸不能吸收入血從而供機體利用，其中有30%～60%的必需氨基酸被門靜脈排流組織(portal-drained viscera，PDV)截?。?］。已有的研究表明，小腸上皮細胞可以降解非必需氨基酸［2］。已有研究顯示，豬小腸上皮細胞能夠大量代謝支鏈氨基酸，但是缺乏分解代謝其他必需氨基酸的酶，如蘇氨酸脫氫酶、組氨酸脫羧酶和苯丙氨酸羥化酶等［3，7］，故有推測，細菌可能介導了小腸對飼糧氨基酸的首過代謝。

賴氨酸在體外培養(yǎng)的仔豬腸道上皮細胞中幾乎不被氧化［7］，然而約有35%的飼糧賴氨酸在首過腸道代謝中消失，其中只有18%用來合成黏膜蛋白質［2］。在體外培養(yǎng)中，仔豬腸道上皮細胞不能代謝蛋氨酸和苯丙氨酸［7］，然而有報道表明仔豬腸道內可以代謝約20%的飼糧蛋氨酸［8］以及約35%的苯丙氨酸［2］。這些報道證明蛋氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸的首過腸道代謝很有可能是細菌的作用。

本實驗室先前的研究利用厭氧培養(yǎng)技術，研究了豬小腸細菌對游離氨基酸的代謝。試驗表明，十二指腸、空腸和回腸細菌能大量代謝必需氨基酸［4］。根據培養(yǎng)基中氨基酸的消失率，可分為3組。賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸、谷氨酸、亮氨酸屬于高消失率組，24 h的消失率在90%以上;異亮氨酸、纈氨酸和組氨酸屬于中等消失率組，24 h的消失率在50%～80%之間;而脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸屬于低消失率組，24 h消失率低于35%。繼代培養(yǎng)30代后，小腸細菌仍能大量代謝賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸和谷氨酸，其24 h消失率均在50%以上［4］。而組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的消失率顯著下降，培養(yǎng)30代后氨基酸的24 h的消失率在30%左右。這些研究均證實，細菌的確參與了氨基酸的腸道首過代謝。

2 腸道中的氨基酸代謝細菌

氨基酸利用菌廣泛存在于人和動物的消化道中。近幾十年來的研究主要集中在細菌在后腸對氨基酸的發(fā)酵上。氨基酸的發(fā)酵產物主要包括氨類物質、生物胺、酚及吲哚類物質。產生這些代謝物的細菌主要有擬桿菌(Bacteroides spp.，spp.為該屬的某些種)、丙酸桿菌(Propionibacterium spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus)和梭菌屬(Clostridium)［9］。梭菌屬的細菌包括 Clostridium spp.、梭桿菌(Fusobacterium spp.)、消化鏈球菌(Peptostreptococcus spp.)、韋 榮 氏 球 菌 (Veillonella spp.)、埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)、發(fā)酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)及反芻月形單胞菌(Selenomonas ruminantium)等，它們被認為是單胃動物后腸中主要的氨基酸發(fā)酵細菌。對于小腸，本實驗室結合基于16S rDNA基因的PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術和傳統的分離培養(yǎng)技術，首次對豬小腸中氨基酸代謝菌群展開了系統分析，比較了豬小腸中代謝不同氨基酸的細菌區(qū)系，發(fā)現豬小腸代謝氨基酸的優(yōu)勢細菌包括克雷伯菌(Klebsiella sp.，sp.為該屬的某個種)、大腸桿菌(Escherichia coli)、鏈球菌(Streptococcus sp.)、溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibrio dextrinosolvens)、埃氏巨球形菌、光崗菌(Mitsuokella sp.)、解脂厭氧弧菌(Anaerovibrio lipolytica)及發(fā)酵氨基酸球菌等［4］，并分離獲得了若干株能夠特異性地代謝氨基酸的細菌［10］。這些小腸氨基酸代謝菌可以分泌多種蛋白酶和肽酶。研究表明，反芻普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、埃氏巨球形菌、Mitsuokella multiacidas、反芻月形單胞菌及牛鏈球菌(Streptococcus bovis)等細菌能夠分泌高活性的二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)及二肽酶(dipeptidase)，這可能與單胃動物消化道中的蛋白質消化與吸收有關。氨基酸代謝關鍵菌的發(fā)現能夠為靶向腸道細菌，通過營養(yǎng)干預減少氨基酸的發(fā)酵，促進宿主的氨基酸利用提供參考。目前，小腸氨基酸代謝菌的研究還很缺乏，通過體外培養(yǎng)結合分子生物學技術分離鑒定潛在的氨基酸代謝關鍵細菌，這可能對研究單胃動物腸道氨基酸代謝具有重要價值。

3 小腸細菌對氨基酸代謝的去路

蛋白質被宿主和細菌來源的酶分解成小肽和氨基酸后，經氨基酸轉運載體進入細菌胞內。研究發(fā)現，鈉依賴轉運和協助擴散是氨基酸代謝菌內主要的氨基酸轉運系統［11］。氨基酸的轉運還受胞內pH影響，pH在6.0～7.0時氨基酸的轉運達到最大，而在pH大于7.0時急劇降低［12］。這些研究表明氨基酸的轉運模式受到細菌胞外環(huán)境的影響。

細菌內的氨基酸可能還來源于細菌的合成。Torrallardona等［13］給小鼠腸內注射15N標記的氯化銨(15NH4Cl)，結果在血液中發(fā)現了15N-賴氨酸。由于哺乳動物并不能通過轉氨基作用合成賴氨酸，小鼠體內的15N-賴氨酸只可能來自于腸道細菌的合成。進一步研究證實，細菌產生的賴氨酸中，大約75%是在小腸被吸收的［14］。此外，細菌還可以通過水解尿素后合成氨基酸供機體利用。有研究表明，給人提供15N標記的尿素后，在血液中檢測到了15N-蘇氨酸［14］。這有可能是細菌水解尿素后合成了蘇氨酸供宿主利用。最新研究發(fā)現，人腸道細菌組的核心功能基因中含有蘇氨酸合成基因［15］，這也在一定程度上證實了腸道上皮與細菌之間氨基酸的交換是雙向的［9］。作為代謝途徑之一，相當部分的飼糧氨基酸在首過腸道代謝中被腸細胞所降解。Dai等［4］通過對腸道食糜細菌的繼代培養(yǎng)發(fā)現，豬小腸細菌可快速并大量利用賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸和谷氨酸。然而，這些被細菌利用的氨基酸的代謝去路并不清楚。有研究表明，用于小腸菌體蛋白合成的纈氨酸有90%來自于飼糧與宿主，新合成的可能只占少部分。這說明細菌從頭合成的氨基酸對菌體蛋白的貢獻可能并不大。

目前對于氨基酸在小腸細菌中的代謝去路以及可能參與的代謝途徑的研究還很缺乏。Dai等［16］利用同位素標記技術測定了在體外條件下，不同氨基酸在不同腸段的小腸細菌中的代謝去路，結果發(fā)現回腸腸腔細菌降解脯氨酸和亮氨酸產生CO2的量很少，細菌對賴氨酸、蘇氨酸和精氨酸的脫羧代謝只占相對氨基酸凈利用的10%，而賴氨酸脫羧代謝占小腸混合細菌對賴氨酸凈利用的15%。然而，在蛋白質合成方面，用于合成菌體蛋白的氨基酸占相應氨基酸凈利用比例較高的有亮氨酸(50%～70%)、蘇氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(25%)、賴氨酸和精氨酸(15%)以及谷氨酰胺(10%)。結合豬小腸細菌對氨基酸凈利用的數據，約50%以上被細菌利用的氨基酸既沒被氧化產生CO2，也沒有用來合成菌體蛋白，而是進入了其他代謝途徑，這可能包括脫氨基、轉氨基、發(fā)酵成短鏈脂肪酸以及斯提柯蘭氏反應［4，14］。

4 小腸細菌對氨基酸代謝的區(qū)室化(compartmentalization)

由于消化道不同部位的細菌組成存在差異，細菌對氨基酸的代謝可能也是區(qū)室化的。Dai等［4］的研究表明，豬小腸不同腸段的細菌對氨基酸的代謝存在差異，十二指腸細菌對氨基酸的利用明顯低于空腸和回腸。細菌體外培養(yǎng)12 h后，空腸細菌對賴氨酸的利用顯著高于回腸細菌。然而，回腸細菌對精氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸和亮氨酸的利用顯著高于空腸細菌。我們近期的研究進一步表明，回腸細菌對蘇氨酸、組氨酸和支鏈氨基酸的利用高于空腸細菌［5］。空腸回腸細菌對谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸和精氨酸的利用并無顯著差異。然而，腸道細菌的區(qū)室化不僅僅體現在不同腸段上，還可能存在于不同腸道層面上。Berg［17］將腸道細菌分為4層，腸腔(lumen)、黏液層(mucus layer)、黏液下層(deep layer of mucus)和腸上皮層(surfaces of epithelial)。而Van Den Abbeele等［18］將黏液層與黏液下層統稱為為黏膜層，故將腸道細菌分為3層，腸腔細菌、黏膜細菌和腸壁細菌。不同層次的細菌對氨基酸的代謝也存在差異。我們利用體外發(fā)酵技術研究腸壁松散連接細菌和腸壁緊密連接細菌對氨基酸的代謝，結果表明腸壁緊密連接細菌對氨基酸主要表現出較強的合成能力，而腸壁松散連接細菌對氨基酸既存在合成也存在利用［5］?？漳c腸壁緊密連接細菌在體外發(fā)酵的前12 h均表現為對氨基酸的合成，合成率最高可達40%，而回腸腸壁緊密連接細菌對氨基酸的合成作用主要集中在前6 h，合成率在0～20%。對于腸壁松散連接細菌，除了蛋氨酸、賴氨酸，空腸組在培養(yǎng)前12 h表現出較強的合成能力，在12～24 h以分解為主，24 h以后，除了谷氨酰胺、賴氨酸、谷氨酸和蛋氨酸，其余氨基酸均表現出凈合成。這些結果表明小腸細菌對氨基酸代謝的區(qū)室化不僅存在于不同腸段，還表現在小腸的不同層面上。小腸細菌對氨基酸的區(qū)室化代謝可能是由于腸壁與腸腔中可利用的底物不同造成［19］，不同的細菌組成也是造成氨基酸代謝區(qū)室化的重要原因［5］。

5 小腸細菌代謝氨基酸的產物對宿主的影響

小腸是氨基酸吸收的主要部位，而大腸對氨基酸的吸收有限，因此傳統營養(yǎng)學往往認為小腸細菌對氨基酸的利用可能是一種營養(yǎng)上的浪費。然而，作為人和動物的另一個“器官”，小腸細菌對氨基酸以及其他含氮化合物的代謝對宿主十分重要。

作為小腸內蛋白質的水解產物，多肽和氨基酸具有廣泛的生物學效應。有研究發(fā)現，腸道細菌能夠代謝蛋白質產生宿主細胞不能產生的肽類物質，如精氨酰谷氨酰胺和丙氨酰丙氨酸［20］。新生小鼠飼糧中補充精氨酰谷氨酰胺能夠調節(jié)高氧暴露引起的腦損傷，該二肽補充能夠抑制乳酸脫氫酶的過度活化并減少促炎癥細胞因子白介素6的表達［21］。但是，細菌代謝產生的二肽類活性物質還有待更深入研究。

多胺是腸道細菌代謝氨基酸的脫羧產物，包括腐胺、亞精胺和精胺。腐胺主要由鳥氨酸經鳥氨酸脫羧酶的脫羧作用生成，再經亞精胺合成酶和精胺合成酶的作用生成亞精胺和精胺。這些酶主要由腸道細菌所分泌。盡管目前對于小腸多胺生成的研究較少，但Dai等［16］的研究發(fā)現進入細菌的精氨酸，約有70%既不被氧化又不用于合成蛋白質，提示這些氨基酸有可能被脫羧形成多胺。多胺對腸道健康有重要的作用。腐胺具有促進細胞分裂分化，促進RNA、蛋白質等大分子物質合成以及促進炎癥修復的作用［22］。Peulen 等［23］給大鼠連續(xù)3 d口腔灌服精胺，發(fā)現精胺可以提高小腸絨毛高度、降低隱窩深度，增加腸道黏膜重量。Peulen等［24］還發(fā)現，灌注亞精胺或精胺能顯著降低斷奶應激反應，表現為腸道長度、重量及蔗糖酶、乳糖酶不受斷奶影響，亞精胺和精胺還能顯著提高斷奶后腸道酸性細胞數量。多胺帶正電荷，可以與RNA、DNA、核酸、蛋白質及其他帶負電荷的分子結合從而參與細胞內的各種反應。通過這些互作，多胺能調控細胞的基因表達、信號轉導、離子通道功能、DNA及蛋白質合成以及凋亡。因此，多胺對于細菌及腸細胞的增殖、分化及功能至關重要［22］。

小腸中的含氮物質除了來自于飼糧蛋白質，還來自于分泌到腸腔中的含氮化合物，如消化酶、膽汁、黏液、細胞脫落物及尿素。這些含氮化合物可在小腸中進一步被消化與發(fā)酵［25］。而細菌可利用這些蛋白質、氨基酸及尿素降解產生的氨合成菌體蛋白［26］，并供機體利用。本實驗室最新研究［5］也發(fā)現，腸壁緊密連接細菌偏愛利用氨合成氨基酸;同時，研究表明，尿素可以通過血液循環(huán)至腸道，腸道表面定植著尿素降解菌，可以將尿素分解成氨［25］。這提示細菌參與了尿素的重新利用，這種尿素分解再合成氨基酸被認為是一種對氮的再循環(huán)，其對飼喂低蛋白質飼糧的動物可能在營養(yǎng)上是重要的。

6 小結

腸道細胞和腸道細菌間的代謝互作廣泛存在，腸道細菌能夠代謝蛋白質和氨基酸，調節(jié)腸上皮細胞的代謝穩(wěn)態(tài)。小腸細菌還可以利用其他含氮物質合成氨基酸和菌體蛋白供宿主利用。小腸細菌通過調控氨基酸合成與分解，影響宿主的營養(yǎng)物質供應以及代謝健康。由于腸道內細菌種類眾多，分離并鑒定小腸氨基酸關鍵代謝菌還存在一定的困難。綜上所述，腸道細菌參與并調節(jié)氨基酸的吸收和利用，因此揭示小腸細菌在小腸蛋白質和氨基酸代謝過程中的作用，有助于理解腸道細菌在宿主營養(yǎng)和健康的重要影響。

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