蜂蜜酒發(fā)酵動力學研究

張 勇,李從發(fā),艾遙琴,陳文學

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

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蜂蜜酒發(fā)酵動力學研究

張 勇,李從發(fā),艾遙琴,陳文學*

(海南大學食品學院,海南海口 570228)

在前期工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,探討蜂蜜酒發(fā)酵過程中主要物質(zhì)的變化規(guī)律,并基于Logistic方程與Luedeking R經(jīng)驗方程,對蜂蜜酒發(fā)酵過程中酵母生長動力學、酒精生成動力學、基質(zhì)消耗動力學模型進行模擬。實驗結(jié)果顯示:模型預測值和實測值的擬合度分別為0.994、0.984、0.996,模型擬合良好,較好的反映了蜂蜜酒發(fā)酵過程的動力學特征。

蜂蜜酒,發(fā)酵動力學,動力學模型

蜂蜜酒是以蜂蜜作為原料,經(jīng)過稀釋、調(diào)整成分、發(fā)酵、陳釀、過濾、殺菌后所獲得的酒精飲料。由于蜂蜜營養(yǎng)成分豐富,通過酵母菌的作用,促進大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,隨著酒精度的不斷上升,蜂蜜酒的小分子物質(zhì)不斷生成,成分更加豐富,因此,以蜂蜜為原料釀造的蜂蜜酒對人體具有很強的保健價值[1]。隨著人們保健意識的增強,對保健產(chǎn)品的需求也在增加,蜂蜜酒逐漸獲得了經(jīng)濟價值[2]。

發(fā)酵動力學是對實驗過程進行定量分析,對實驗指標進行較為準確的預測,對發(fā)酵過程放大及從分批發(fā)酵過渡到流加發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵有著重要指導作用的過程[3]。為了更好地控制發(fā)酵過程,科學家引入數(shù)學模型的概念,將實際發(fā)酵實驗過程中得到的大量數(shù)據(jù)進行整理,以簡潔的形式表達出來,更易于理解,同時可以利用小實驗得到數(shù)據(jù)設(shè)計大型的發(fā)酵工藝[4-5]。

在菌體生長動力學中,最常用的是Monod方程和logistic方程。如林巧[6]等應(yīng)用Logistic方程描述了酵母菌體生長、酒精合成和底物消耗在內(nèi)的動力學參數(shù)與數(shù)學模型,為建立櫻桃酒代謝控制發(fā)酵的現(xiàn)代化發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供了基礎(chǔ)。李俠[7]等采用經(jīng)驗模型中的Logistic模型對實驗數(shù)據(jù)進行非線性擬合,建立菌體生長模型、酒精生成模型和底物消耗模型,為紅棗酒的發(fā)酵生產(chǎn)控制提供了基礎(chǔ)。產(chǎn)物生成動力學模型,目前較為通用的是Luedeking和Piret于1959年描述乳酸發(fā)酵時所提出的數(shù)學模型。

蜂蜜酒發(fā)酵容易出現(xiàn)發(fā)酵停滯或發(fā)酵遲緩的現(xiàn)象[2]?？赡芘c蜂蜜中存在一些抑菌物質(zhì)有關(guān)[8],同時蜂蜜中缺乏一些發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)[9-12],如氮源,可能也會影響發(fā)酵?；谶@些原因,課題組前期對四種常用的活性干酵母進行了比較研究[13],篩選得出EC1118活性干酵母適于蜂蜜酒發(fā)酵。還對EC1118和安琪酵母制備蜂蜜酒的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化[14]。在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究對蜂蜜酒的發(fā)酵動力學做了研究。

本實驗采用Logistic方程與Luedeking R經(jīng)驗方程,分別建立蜂蜜酒發(fā)酵過程中菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物(酒精)生成的動力學模型,根據(jù)物料平衡原理建立底物消耗動力學模型。雖然各種果酒的發(fā)酵動力學研究很多,但蜂蜜酒的發(fā)酵動力學研究尚未見有報道。而且本實驗采用低質(zhì)蜂蜜釀制蜂蜜酒可以很大程度增加蜂蜜業(yè)的經(jīng)濟效益,發(fā)酵動力學模型能夠很好的預測發(fā)酵過程[15],因此研究蜂蜜酒的發(fā)酵動力學,這將對蜂蜜酒的工業(yè)化生產(chǎn)具有理論指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EC1118 活性干酵母 上海杰兔工貿(mào)有限公司;蜂蜜 海南卓津蜂業(yè)有限公司提供;檸檬酸、磷酸氫二銨 分析純。

SPX型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;TP-313型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司;G154DW型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋 致微儀器有限公司。

1.2 實驗方法

本實驗在前期工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上,研究蜂蜜酒發(fā)酵動力學。

1.2.1 蜂蜜酒發(fā)酵工藝流程

1.2.2 菌種活化 稱取一定量的干酵母,與10倍體積的5%蔗糖溶液混合均勻,于40℃條件下復水30min。

1.2.3 發(fā)酵液的制備及成分調(diào)整 發(fā)酵用無菌水稀釋蜂蜜,按37g蜂蜜加100mL水的比例,混合均勻。加檸檬酸調(diào)整pH到5.0,按1g/L的濃度添加磷酸氫二銨補充氮源。然后65℃巴氏殺菌10min,室溫冷卻至常溫。

1.2.4 發(fā)酵方法 按質(zhì)量濃度0.8%接入活化后的酵母菌,室溫下發(fā)酵。每隔24h取樣1次,測定殘?zhí)菨舛?、酒精度和菌體生物量。

1.2.5 檢測方法 酵母細胞數(shù)量:血球計數(shù)板法,采用直接計數(shù)法對酵母菌數(shù)進行測定,取發(fā)酵液直接滴于血球計數(shù)板上,在光學顯微鏡下觀察酵母菌個數(shù);糖含量:費林試劑法,根據(jù)GB/T 15038.2006葡萄酒、果酒通用分析方法規(guī)定,采用費林試劑滴定法測定還原糖含量;酒精度:酒精計法,根據(jù)GB/T 10345-2007白酒通用分析方法規(guī)定,采用酒精計法測定發(fā)酵過程中的酒精度數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法 實驗中做三次平行,取其平均值。應(yīng)用Origin8.0軟件進行動力學模型建立。

1.3 建立發(fā)酵動力學模型

1.3.1 菌體生長動力學模型 Logistic模型是一個典型的S形曲線方程,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵的細胞生長過程。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析,釀酒酵母的生長呈“S”型曲線,可以用Logistic模型來描述[16-18]:

dx/dt=μm(1-X/Xm)X

式(1)

上式兩邊積分得:

X(t)=X0exp(μmt)/{1-(X0/Xm)[1-exp(μmt)]}

式(2)

式中:t為發(fā)酵時間(h);X為菌體量(×107cfu/mL);Xm為最大菌體量(×107cfu/mL);X0為初始菌體量(×107cfu/mL);μm為最大比生長速率(1/h)。

1.3.2 產(chǎn)物生成動力學模型 目前較為通用的是有Luedeking和Piret于1959年描述乳酸發(fā)酵時所提出的數(shù)學模(dp/dt=a dx/dt+bx)[16-18]。乙醇發(fā)酵為生長偶聯(lián)型,所以a≠0,b=0。所以模型可以簡化為:

dp/dt=a dx/dt

式(3)

上式兩邊積分得,P(0)=0:

P(t)=a(X(t)-X(0))

式(4)

式中:t為發(fā)酵時間(h);a為生長偶聯(lián)參數(shù);P為產(chǎn)物濃度(%vol)。

1.3.3 基質(zhì)消耗動力學模型 蜂蜜酒發(fā)酵過程中,底物消耗模型應(yīng)從底物消耗的3個部分來考慮:形成產(chǎn)物,供給菌體生長,維持細胞呼吸新陳代謝作用,根據(jù)物料平衡原理,可以建立方程式為[16-18]:

-ds/dt=dx/dt/Yx/s+dp/dt/Yp/s+M0×X

式(5)

上式兩邊積分得:

S(t)=S(0)-(X(t)-X(0))/Yx/s-P(t)/Yp/s-M0(Xm/μm)ln((Xm-X0+X0exp(μmt))/Xm

式(6)

式中:t為發(fā)酵時間(h);S(0)為初始底物濃度(g/L);Yx/s為最大細胞得率系數(shù);X為菌體量(×107cfu/mL);Yp/s為產(chǎn)物得率系數(shù);P為產(chǎn)物濃度(%vol);M0為菌體細胞維持相關(guān)常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜酒發(fā)酵過程中菌體量、基質(zhì)及產(chǎn)物的變化

將釀造蜂蜜酒所有原輔料投入到5L錐形瓶中,室溫下發(fā)酵釀造蜂蜜酒,每隔24h,測定殘?zhí)菨舛取⒕凭群途w生長量,所得蜂蜜酒發(fā)酵過程中主要物質(zhì)變化曲線見圖1。

圖1 蜂蜜酒發(fā)酵過程主要物質(zhì)變化曲線Fig.1 The metabolic curves of fermentation process of mead

由圖1可知,酵母EC1118的菌體生長曲線比較典型,各個生長階段比較分明,發(fā)酵72h后進入對數(shù)期;當酵母菌發(fā)酵至168h后菌體生長進入了穩(wěn)定期,此時菌體生物量達到最高值7.1×107cfu/mL。A.P. Pereira[12]通過提高初始菌體濃度,發(fā)酵48h菌體生物量達到最高值1.0×108cfu/mL;A.Mendes-Ferreira[2]研究了添加磷酸氫二銨對發(fā)酵速率的影響,發(fā)酵200h,菌體生物量達到最高值且趨于平穩(wěn)。出現(xiàn)這些差異的原因可能與菌種、初始菌體濃度和發(fā)酵基質(zhì)有關(guān)。

對于產(chǎn)物酒精,發(fā)酵產(chǎn)生的酒精隨菌體生長不斷上升,其產(chǎn)量在前216h內(nèi)快速增長。發(fā)酵216h酒精含量可達9.9%。Teresa Gomes[10]采用響應(yīng)面法對蜂蜜酒工藝進行優(yōu)化,發(fā)酵220h達到最高酒精含量10.2%;Ana Paula Pereira[11]從蜂蜜中篩選酵母菌,發(fā)酵150h酒精含量達到最大。本實驗發(fā)酵216h,酒精度達到9.9%,與Teresa Gomes等人的研究接近,但比一般果酒發(fā)酵速度慢,可能與蜂蜜中存在一些抑菌物質(zhì)有關(guān),這些抑菌物質(zhì)可能會阻礙酵母菌的生長;同時蜂蜜的品種可能也會對結(jié)果產(chǎn)生影響[8]。

體系中的還原糖因維持菌體生長,形成產(chǎn)物,維持細胞呼吸新陳代謝作用而不斷消耗,因此不斷減小,在前216h消耗比較快,之后趨于平穩(wěn)。A. Roldn[12]等研究花粉對發(fā)酵的影響,發(fā)酵240h,發(fā)酵結(jié)束。

2.2 模型參數(shù)求解

2.2.1 菌體生長動力學模型的建立 由Xm的物理意義和實驗數(shù)據(jù)直接讀出Xm=7.10×107cfu/mL,并由此結(jié)合不同時間菌體量實驗數(shù)據(jù)(X值),用Origin8.0軟件進行非線性擬合,經(jīng)過運算得到X0=1.44×107cfu/mL,μm=0.02h-1。將計算所得參數(shù)的值帶入方程(2),得到蜂蜜酒發(fā)酵過程中菌體生長的動力學模型為:

X(t)=1.44exp(0.02t)/{1-0.2[1-exp(0.02t)]}

式(7)

通過Origin8.0軟件對實驗結(jié)果分析,EC1118生長擬合曲線如圖2所示,從圖2可知,發(fā)酵初期預測值和實測值誤差比較大,而對數(shù)生長期和平衡期時的實測值和擬合值吻合程度比較高。再由Origin8.0軟件分析可知蜂蜜酒發(fā)酵過程中的Logistic模型R2=0.994,表明EC1118酵母菌生長的Logistic模型與實測值的相關(guān)性達到極顯著水平,較好的反映了酵母的生長變化。

圖2 菌體生長實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.2 Fitting curve of experimental versus predicted values for cell growth

2.2.2 產(chǎn)物生成動力學模型的建立 由不同時間酒精含量實驗數(shù)據(jù)(P 值),將式(7)和X(0)代入式(4),用Origin8.0軟件進行非線性擬合,經(jīng)過運算得到a=1.90。將計算所得參數(shù)的值帶入方程(4),得到蜂蜜酒發(fā)酵過程中產(chǎn)物生成動力學模型為:

P(t)=2.74exp(0.02t)/{1-0.2[1-exp(0.02t)]} - 2.74

式(8)

酒精生成擬合曲線如圖3所示,從圖3可知,蜂蜜酒發(fā)酵過程中酒精生成動力學模型的預測值和實測值的平均相對誤差較小,在蜂蜜酒發(fā)酵的前168h,酒精生成量的擬合值和實測值基本吻合,192h后的擬合值和實測值誤差增加。再由Origin8.0軟件分析可知蜂蜜酒發(fā)酵過程中的酒精生成動力學模型R2=0.986,表明酒精生成的動力學模型與實測值的相關(guān)性達到極顯著水平,較好的反映了酒精生成的變化。

圖3 產(chǎn)物生成實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.3 Fitting curve of experimental and predicted values for alcohol production

2.2.3 基質(zhì)消耗動力學模型的建立 由不同時間殘?zhí)菨舛葘嶒灁?shù)據(jù)(S值),現(xiàn)將不同時點t下的式(7),式(8)及X0,μm,Xm值代入上式(6),用Origin8.0軟件進行非線性擬合,經(jīng)過運算得到Y(jié)x/s=0.14,Yp/s=0.10,S(0)=178.75(g/L)。將計算所得參數(shù)的值帶入方程(6),得到蜂蜜酒發(fā)酵過程中基質(zhì)消耗動力學模型為:

S(t)=216.26-37.51exp(0.02t)/{1-0.2[1exp(0.02t)]}-5.4ln(0.8+0.2exp(0.02t))

式(9)

基質(zhì)消耗擬合曲線如圖4所示,由圖4可知,發(fā)酵過程前期、中期和后期的糖濃度測定值和糖消耗動力學模型的擬合值較吻合。再由Origin8.0軟件分析可知蜂蜜酒發(fā)酵過程中的Logistic模型R2=0.996,表明糖消耗的動力學模型與實測值的相關(guān)性達到極顯著水平,較好的反映了糖消耗的變化。

圖4 基質(zhì)消耗實驗值與預測值模型擬合曲線Fig.4 Fitting curve of experimental and predicted values for substrate Consumption

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究主要考察蜂蜜酒發(fā)酵過程中的菌體濃度和特征物質(zhì)的變化規(guī)律。實驗結(jié)果表明:酵母菌細胞在接種72h后生長速率較快,在第168h時達到7.10×107cfu/mL;殘?zhí)菨舛仍谇?16h內(nèi)消耗比較快,之后殘?zhí)蔷徛档?酒精度發(fā)酵前216h內(nèi)增加較快,之后增加緩慢。

3.2 通過采用Origin8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)分析,用Logistic方程描述了酵母EC1118對蜂蜜酒發(fā)酵的菌體生長動力學,得到菌體生長擬合方程,其相關(guān)系數(shù)為0.994,得到數(shù)學模型X(t)=1.44 exp(0.02t)/{1-0.2[1-exp(0.02t)]};用Luedeking R經(jīng)驗方程描述蜂蜜酒發(fā)酵的產(chǎn)物生成動力學,酒精生成擬合方程,其相關(guān)系數(shù)為0.984,得到數(shù)學模型P(t)=2.74exp(0.02t)/{1-0.2[1-exp(0.02t)]}- 2.74;基于消耗的含碳基質(zhì)平衡原理建立底物消耗動力學方程描述蜂蜜酒發(fā)酵,其相關(guān)系數(shù)為0.996,得到數(shù)學模型S(t)=216.26-37.51exp(0.02t)/{1-0.2[1exp(0.02t)]}-5.4ln(0.8+0.2exp(0.02t))。動力學模型與實測值的相關(guān)性達到極顯著水平,所選模型能夠較好描述發(fā)酵過程的變化。

3.3 本文研究的蜂蜜酒發(fā)酵與一些研究果酒發(fā)酵的結(jié)論存在差異,可能與蜂蜜本身存在一些抑菌物質(zhì)有關(guān),這些抑菌物質(zhì)可能會阻礙EC1118酵母菌的發(fā)酵。有待對蜂蜜抑菌物質(zhì)對發(fā)酵的影響進一步進行研究。同時通過發(fā)酵動力學的研究,進一步了解微生物的生理特征,菌體生長和產(chǎn)物形成的合適條件,以及各種發(fā)酵參數(shù)之間的關(guān)系,為發(fā)酵過程的工藝控制、發(fā)酵罐的設(shè)計和利用計算機對發(fā)酵過程的控制創(chuàng)造條件。

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Study on fermentation kinetics of mead

ZHANG Yong,LI Cong-fa,AI Yao-qin,CHEN Wen-xue*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Based on the optimization of mead production,the variation of the essential substances in the process of mead fermentation was investigated. In addition,the fermentation kinetics of mead was studied by determining the change in the concentration of yeast,alcohol and total sugar content in this paper. Based on Logistic equation and Luedeking equation,the kinetics models of cell growth,alcohol production and substrate consumption were set up. The fit values of the three models were 0.994,0.984,and 0.996,respectively. The model was found to be capable of reflecting all batch culture phases to a certain degree of accuracy.

mead;fermentation kinetics;kinetics models

2014-04-02

張勇(1989-),男,在讀研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工。

*通訊作者:陳文學(1968-),男,教授,博士,研究方向：熱帶農(nóng)產(chǎn)品加工。

?？谑兄攸c科技計劃項目(2012055)。

TS201.7

A

1002-0306(2015)05-0136-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.020