典型熱加工對花生致敏蛋白及其免疫反應性的影響

李穎超,錢 和,孫秀蘭,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀華

(江南大學食品科學與工程學院,江蘇無錫 214122)

?

典型熱加工對花生致敏蛋白及其免疫反應性的影響

李穎超,錢 和*,孫秀蘭,汪何雅,崔 燕,杜 超,夏秀華

(江南大學食品科學與工程學院,江蘇無錫 214122)

通過免疫學方法檢測了花生制品加工過程中幾種典型熱加工方式對花生致敏蛋白的免疫反應性的影響。結(jié)果表明:烘焙、水煮、油炸和高溫高壓處理均使花生可溶性蛋白含量顯著降低;隨之,處理后樣品中蛋白提取物的免疫反應性也顯著下降,其中高溫高壓處理最為顯著;熱處理對花生致敏蛋白Ara h 2的溶解性及免疫反應性的影響較小,而對Ara h1和Ara h 3的影響則比較明顯。

花生,過敏,致敏蛋白,免疫反應性

花生是世界衛(wèi)生組織公布的8大食物致敏原之一,其引起過敏反應的最小劑量非常低,安全劑量僅為0.1mg,是蛋和奶的1/30,大豆的1/4000。另外,與蛋和奶等過敏原不同,花生過敏往往伴隨終生[1]。加拿大一項大型調(diào)查顯示,成人診斷明確的花生過敏率為1%,另有0.93%的調(diào)查對象為疑似對象[2]。在我國,一項針對青島市過敏性疾病兒童的過敏原構(gòu)成研究顯示,超過40%的過敏體質(zhì)兒童對花生過敏[3]。在食物過敏引起的死亡病例中,過半是由花生引起。然而,花生又是一種營養(yǎng)豐富、具有香溢口感的大宗食品,它作為原料或配料廣泛用于生產(chǎn)各種加工食品。在花生的加工和烹調(diào)過程中,常常用到高溫加熱工藝,如水煮、烘烤、油炸、殺菌等。自1925年發(fā)現(xiàn)第一例花生過敏病例以來,已有幾十種花生蛋白被指與花生導致的過敏有關,但其中有11種(Ara h 1～11)被普遍認可并正式命名[4]。這些致敏蛋白大多(Ara h 1～4,6,7)屬于種子貯藏蛋白,其中Ara h 1和 Ara h 2是主要致敏蛋白,能被95%的花生過敏患者血清所識別[5]。這些蛋白在食物的加工過程中會發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化,如展開、聚集,以及化學修飾。這些變化導致花生致敏性的變化。目前,國內(nèi)有關加工方式對花生致敏性的研究十分鮮見。因此,本文將通過免疫學方法,對典型熱加工方式對花生致敏蛋白組分及其免疫反應性的影響做初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

C3H/HeJ小鼠(五周齡) 上海斯萊克實驗動物有限公司;霍亂毒素(CT) Sigma;花生(紅皮) 購于無錫市區(qū)超市;醋酸纖維膜(1.2μm) 德國Sartorius;TMB/DAB顯色液 上海生物工程有限公司;96孔聚苯乙烯酶標板 Costar;HRP標記羊抗鼠IgE Southern Biotech 美國;蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒 上海生物工程有限公司;其它常規(guī)試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生過敏小鼠模型的建立與血清的保存 方法參考文獻[6]，致敏:花生研磨成漿與CT混合,每只小鼠灌胃劑量為15mg花生(PN)與10μg CT;在第1、2、3d用花生漿液于CT的混合液連續(xù)灌胃3天,之后同樣配方灌胃,每周一次,連續(xù)3周。激發(fā):最后一次致敏后一周,小鼠空腹過夜,花生漿灌胃激發(fā)。灌胃劑量為每只小鼠30mg PN,分兩次灌胃。共設3組:空白組:蒸餾水;對照組:10μg CT;過敏組:15mg PN+10μg CT。激發(fā)后通過摘眼球取血獲得過敏小鼠血液,常溫下放置3 h后,4000×g離心10 min,血清析出,分裝后于超低溫冰箱(-76℃)保存。

1.2.2 花生的加熱處理 油炸(YZ):160℃花生油油炸5min;烘焙(HB):鼓風干燥箱160℃,40min;水煮(SZ):100℃沸水20min;高溫高壓(GG):121℃,0.1MPa,30min。處理后將潮濕的樣品在30℃下干燥,水分含量低于6.0%。樣品置于-20℃保存。

1.2.3 花生總蛋白(PE)的浸提液的制備 選新鮮優(yōu)質(zhì)的花生仁,揉搓去除紅衣后在組織搗碎機中粉碎,過40目篩。再將花生粉與正己烷按1∶10(g/mL)混合,在4℃下磁力攪拌脫脂2h,靜置1h,棄去上清液,重復脫脂一次。將脫脂花生粉在通風櫥中放置過夜,使正己烷揮發(fā)干凈。將脫脂后花生粉與預冷的0.01mol/L PBS(pH7.4,含0.01mol/L β-巰基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10(g/mL)混合,4℃下磁力攪拌過夜。次日將浸提液在4℃,11000×g離心30min,收集上清液,沉淀用浸提液再提取4h,離心后合并上清液,分裝后保存在超低溫冰箱(-76℃)。

1.2.4 樣品中可溶性蛋白的提取及其含量的測定 稱取干物質(zhì)量為0.5g的樣品,加入0.01mol/L PBS(pH 7.4,含0.01mol/L β-巰基乙醇和0.05% EDTA·2Na)1∶10研磨浸提,在4℃下11000×g離心30min,收集上清液待用。將上清液梯度稀釋后按照說明書(蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒)操作。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 本實驗采用不連續(xù)體系SDS-PAGE垂直平板凝膠電泳,濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為12.5%,濃縮膠內(nèi)的電壓為80V,分離膠內(nèi)的電壓為120V。電泳后,考馬斯亮藍R-250染色、甲醇-冰醋酸脫色、凝膠成像得到電泳結(jié)果。低分子量標準蛋白分子量為14.4～97.4ku。樣品上清液與上樣緩沖液1∶4混合煮沸3～5min,上樣量為10μL。

為了調(diào)查油田方言的調(diào)值和歷史演變，采訪了三名不同年齡段的被試，三人都為本地常住居民，皆沒有長期離開居住地；年齡差異較明顯，三人的發(fā)音器官健康正常，沒有影響發(fā)音的缺陷，因此能夠代表油田話的發(fā)音人。表2是三位被試的具體信息。

1.2.6 免疫印跡(Western blotting)

1.2.6.1 電泳 SDS-PAGE電泳后,凝膠不染色,放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡至少5min。

1.2.6.2 轉(zhuǎn)膜(半干法) NC膜、濾紙和無紡纖維墊在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡20min,從陰極到陽極,依次放置無紡纖維墊、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、無紡纖維墊,制作“三明治”電轉(zhuǎn)芯,期間用玻璃棒趕走氣泡,將其放入轉(zhuǎn)印槽,200mA轉(zhuǎn)膜70min。

1.2.6.3 封閉 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,37℃下TBS漂洗3次,每次5min。漂洗后,加入封閉液,4℃過夜。

1.2.6.4 加一抗 TBST漂洗3次,每次5min。加入一抗(1∶10,過敏小鼠血清),在37℃孵育3h。

1.2.6.5 加二抗 TBST漂洗3次,每次5min,加入二抗(1∶2500,HRP標記羊抗鼠IgE),37℃孵育2h;

1.2.7 間接競爭ELISA 1μg/mL的PE在4℃下包被過夜,洗滌后加入一抗(1∶10,過敏小鼠血清)與待測樣品液(稀釋3倍)的混合物(1∶1),37℃孵育1h孵育。再次洗滌3次,加入二抗(1∶2500,HRP標記羊抗鼠IgE)37℃孵育1h孵育。再洗滌4次后,加入TMB顯色液,37℃孵育0.5h孵育。之后加入1mol/L的硫酸溶液終止反應,37℃孵育15min后立即在450nm下測定吸光度值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用EXCEL2003進行均值和標準差計算,結(jié)果以“均數(shù)±標準差”表示,并采用SPSS13.0進行Doucan’s多重檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 可溶性蛋白含量

由圖1可見,熱加工處理后的花生仁,其SPE的含量均顯著降低。烘焙處理和高溫高壓處理后,樣品中可溶性蛋白含量顯著降低,僅為對照的40%～45%,同時這兩個處理間無顯著性差異。水煮和油炸處理后,樣品中SPE含量的下降程度更大,僅為對照的23%～27%,且兩處理間也無顯著差異。熱處理可使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的改變。當溫度高于70～80℃時,其三級結(jié)構(gòu)將發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變;當溫度高于80～90℃時,蛋白質(zhì)分子會發(fā)生分子內(nèi)或分子間相互作用,以及二硫鍵的重排;當溫度達到90～100℃時蛋白質(zhì)分子就會發(fā)生聚集[7]。Schmitt等[8]同樣水煮、油炸和烘焙花生后,其可溶性蛋白含量發(fā)生明顯下降,且隨著處理時間的延長下降程度越大。Mondulet等[9]也得到相似結(jié)果,且烘焙處理的花生中的SPE含量為總蛋白含量的60%,而水煮花生中SPE含量更低(約為總蛋白含量的30%)。叢艷君[10]等學者的研究結(jié)果則表明,花生中SPE的含量受到加工方式和提取緩沖液的影響,尿素溶液的提取率最高,磷酸緩沖液提取率也較高,而檸檬酸、醋酸緩沖液提取效率較低,主要受pH影響。目前,花生致敏性研究中大多用pH為7.4的磷酸緩沖液。一方面是致敏蛋白提取率較為理想,另一方面使其活性保持較好。而不同處理對可溶性蛋白含量的影響主要是由處理溫度和時間的差異造成的。處理溫度越高,時間越長,蛋白質(zhì)發(fā)生變性和共價修飾的程度就高,其可溶性可能變化就越大。本研究中,油炸處理的溫度很高,且這種加工方式的熱傳遞速度很快,所以花生在較短時間就達到加工要求,嚴酷的處理條件是花生中可溶性蛋白含量顯著降低的一個因素。另外,水煮處理后花生中SPE含量也很低,這主要是由于花生中部分蛋白轉(zhuǎn)移到了處理水中,這在Schmitt 等和Mondulet 等的研究中都得以證實[8-9]。

圖1 熱加工處理對花生中可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of heat treatment on content of soluble proteins of peanut seeds

2.2 SDS-PAGE電泳

由圖2可以看出，花生經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)提取物的電泳特征均發(fā)生了明顯變化。首先，處理后樣品蛋白提取物的電泳條帶較對照淺，這說明處理后樣品的蛋白提取物含量有所下降，這與可溶性蛋白含量的變化結(jié)果一致。其次，分子量大約在66、31～43、20ku左右的6個條帶，不同處理的樣品這些條帶的變化不同。其中，烘焙和水煮樣品66ku的條帶較對照都明顯變窄，而高溫高壓和油炸處理的樣品該條帶幾乎看不到；油炸處理樣品31～43ku之間分子量較大的條帶與對照無明顯差異，而其他處理樣品該條帶皆明顯變淺；而31～43ku之間分子量較小的條帶除在烘焙處理樣品中有顯現(xiàn)痕跡外，其他處理樣品該條帶均沒有顯現(xiàn)；烘焙和水煮樣品中20ku左右的3個條帶較對照均無明顯變化，高溫高壓處理樣品未形成明顯條帶，而油炸處理樣品只剩其中較大和較小的2個條帶，中間1條帶消失。由此結(jié)果可得出，熱加工處理對樣品蛋白質(zhì)提取物中20ku左右的低分子量蛋白的影響較小，而對66、31～43ku分子量較大的蛋白影響比較明顯。這與其他研究學者的結(jié)果相似[8-9,11]。

圖2 熱加工處理后花生蛋白質(zhì)提取物的 SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Electrophoretic pattern of the protein extracts from different heated peanuts

2.3 ELISA和Western blotting

致敏原蛋白與特異性IgE的結(jié)合能力,即其免疫反應性是反映致敏原蛋白激發(fā)能力的一個重要體外檢測指標。本研究為了檢測熱加工處理后樣品可溶性蛋白提取物的與花生致敏蛋白特異性IgE的結(jié)合能力的變化,用間接競爭ELISA和Western blotting兩種方法從總IgE的結(jié)合能力和花生致敏原不同組分的IgE的結(jié)合能力進行了分析。熱加工處理樣品可溶性蛋白提取物的IgE的結(jié)合能力均顯著低于對照,其中高溫高壓處理者最低(圖3a)。然而,這種降低并不能說明加工一定會降低花生中致敏原蛋白的免疫反應性。因為,熱加工處理使蛋白質(zhì)變性,樣品中可溶性蛋白含量降低。因此,本研究中處理后樣品的抑制率下降很大一部分原因是蛋白質(zhì)含量降低所致。國外大多學者研究表明,HB處理會增加花生的致敏性[9,11-12],并且認為這種增加與美拉德反應有密切關系[12-14]。同樣,油炸花生也會發(fā)生美拉德反應[9]。相反,水煮與高溫高壓處理的樣品,由于水的存在,美拉德反應較弱,而樣品的免疫反應性也有所降低[8-9,11,15]。水煮處理之所以降低花生致敏性是由于一部分致敏原在水煮過程中轉(zhuǎn)移到了處理用水中[10]。高溫高壓處理樣品的IgE的結(jié)合能力的下降主要歸因于致敏蛋白結(jié)構(gòu)的改變,同時其致敏蛋白的消化穩(wěn)定性的降低也為其致敏性的下降提供了可能[15]。高溫高壓降低致敏蛋白的免疫反應性的研究不僅僅局限于花生,在綠豌豆和羽扇豆的相關研究中也得到類似結(jié)果[16-18]。但是,高溫高壓處理并不能降低杏仁和桃子中致敏原蛋白的IgE的結(jié)合能力[19-20]。綜上所述,濕熱處理可通過移除致敏原或改變其構(gòu)象而降低其免疫反應性,為致敏性的降低提供了極大空間。但也并不適用于任何致敏原蛋白,需要進行驗證。

圖3 熱加工處理后花生蛋白質(zhì)提取物的 ELISA結(jié)果(a)和West blotting(b)Fig.3 The ELISA(a)and Western blotting performed on the protein extracts(b) from different heated peanuts

Ara h1和Ara h2是最重要的兩種致敏蛋白,其分子量分別為65和17～19ku,且前者占種子總蛋白的12%～16%左右[21]。Ara h 3也是一種比較重要的花生致敏原,其分子量在14～45ku[22]。本研究結(jié)果表明,熱加工處理對Ara h2的影響較小,而Ara h 3與IgE的結(jié)合則大大減少或檢測不到,尤其是高溫高壓處理后樣品中分子量較大的蛋白在SDS-PAGE和Western blotting中均未檢測到,同時油炸處理樣品中Ara h1也幾乎檢測不到;而烘焙和水煮處理樣品中Ara h1可明顯檢測到(圖3b)。由此可見,熱加工處理后,花生中可溶性蛋白提取物樣品免疫反應性的變化主要是由于Ara h1和Ara h3數(shù)量和IgE的結(jié)合活性的變化引起。同時,高溫高壓處理是一種降低花生致敏性很具潛力的處理方法。

Beyer等認為[11],水煮和油炸花生中Ara h1的顯著減少是樣品IgE的結(jié)合能力下降的主要原因,也是中國花生過敏人口較少(以水煮和油炸為主要食用方式)的原因。然而,Cabanillas等研究發(fā)現(xiàn)[15],熱處理后樣品中不溶性蛋白質(zhì)成分中致敏原含量很高。因此,目前的研究都是基于處理后可用緩沖液提取出來的部分蛋白質(zhì)的理化和生物特性而進行的,而因為加工處理而變性的那一部分的性質(zhì)無法得以表征。近期的一些研究中,也有對不溶性部分做研究的結(jié)果[8,15],然而用于電泳實驗的上樣緩沖液也并不能完全提取出所有致敏蛋白。因此,體外檢測食品的致敏性,尤其是在定量方面,局限性較大,需要尋求更加全面和說服力的定量檢測方法。

3 結(jié)論

熱加工處理可顯著影響花生蛋白提取物中致敏原蛋白的含量和特性。由于熱變性花生提取物中致敏蛋白含量均顯著下降,其中Ara h1和Ara h3的變化較大,而Ara h2相對穩(wěn)定。水煮處理可使樣品中較多致敏蛋白溶于處理用水而移除致敏原;高溫高壓處理則通過改變致敏蛋白構(gòu)象,在降低花生致敏性方面具有一定潛力。

[1]Cordle C T. Soy protein allergy:Incidence and relative severity[J]. The Journal of Nutrition,2004,134(5):1213S-1219S.

[2]Ben-Shoshan M,Harrington D W,Soller L,et al. A population-based study on peanut,tree nut,fish,shellfish,and sesame allergy prevalence in Canada[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2010,125(6):1327-1335.

[3]金蓉,林榮軍,車淑玉. 青島市過敏性疾病病兒過敏原皮膚點刺實驗構(gòu)成特征[J]. 青島大學醫(yī)學院學報,2010,46(1):60-62.

[4]ANSCIUIS. Allergen nomenclature sub-committee of the international union of immunological societies[OL]. 2009:Available from:http://www.allergen.org/Allergen.aspx.

[5]Scurlock A M,Burks A W. Peanut allergenicity. Annals of Allergy[J]. Asthma,and Immunology,2004(93):S12-S18.

[6]Li X M,Serebrisky D,Lee S Y,et al. A murine model of peanut anaphylaxis:T-and B-cell responses to a major peanut allergen mimic human responses[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2000,106(1):150-158.

[7]Davis P J,Williams S C. Protein modification by thermal processing s[J]. Allergy,1998(53):102-105.

[8]Schmitt D A,Nesbit J B,Hurlburt B K,et al. Processing Can Alter the properties of peanut extract preparations[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010(58):1138-1143.

[9]Mondulet L,Paty E,Drumare M F,et al. Influence of thermal processing on the allergenicity of peanut proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005(53):4547-4553.

[10]叢艷君,薛文通,張惠,等. 加工方式和蛋白提取方法對花生蛋白致敏性的影響[J]. 食品科學,2007,28(11):207-210.

[11]Beyer K,Ellen-Morrow M D,Li X M,et al. Effects of cooking methods on peanut allergenicity[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2001,107(6):1077-1081.

[12]Maleki S J,Chung S Y,Champagne E T,et al. The effects of roasting on the allergenic properties of peanut proteins[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2000,106(4):763-768.

[13]Chung S Y,Champagne E T. Association of End-Product Adducts with increased IgE binding of roasted peanuts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001(49):3911-3916.

[14]Maleki S J,Chung S Y,Champagne E T,et al. Allergic and biophysical properties of peanut proteins before and after roasting[J]. Food Allergy Intolerance,2001(2):211-221.

[15]Cabanillas B,Maleki S J,Rodríguez J,et al. Heat and pressure treatments effects on peanut allergenicity[J]. Food Chemistry,2012(132):360-366.

[16]Alvarez-Alvarez J,Guillamón E,Crespo J F,et al. Effects of extrusion,boiling,autoclaving and microwave heating on lupine allergenicity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(4):1294-1298.

[17]Guillamón E,Burbano C,Cuadrado C,et al. Effect of an instantaneous controlled pressure drop oninvitroallergenicity to lupins(Lupinus albus var Multolupa)[J]. International Archives of Allergy and Immunology,2008,145(1):9-14.

[18]Malley A,Baecher L,Mackler B,et al. The isolation of allergens from the green pea[J]. The Journal of Allergy and Clinical Immunology,1975,56(4):282-290.

[19]Brenna O,Pompei C,Ortolani C,et al. Technological processes to decrease the allergenicity of peach juice and nectar[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(2):493-497.

[20]Venkatachalam M,Teuber S S,Roux K H,et al. Effects of roasting,blanching,autoclaving,and microwave heating on antigenicity of almond(PrunusdulcisL.)proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(12):3544-3548.

[21]Szymkiewicz A. Peanut(Arachishypogea)Allergens[M]. Boca Raton:Jedrychowski L and Wichers H J,2010:267-279.

[22]Koppelman S J,Knol E F,Vlooswijk R A A,et al. Peanut allergen Ara h 3:Isolation from peanuts and biochemical characterization[J]. Allergy,2003(58):1144-1151.

Effect of thermal processing on the immunoreactive propertiesof allergenic proteins from peanut seeds

LI Ying-chao,QIAN He*,SUN Xiu-lan,WANG He-ya,CUI Yan,DU Chao,XIA Xiu-hua

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The aim of this study was to assess the effect of thermal processing on the IgE-binding capacity of whole peanut protein extracts. The results showed that:the content of soluble protein extracts was less marked in roasted,boiled,fried and autoclaved than in raw peanuts,and the IgE immunoreactivity of processed peanuts also decreased significantly,especially of autoclaved peanuts. The immunoreactive properties of allergens(Ara h1,Ara h2 and Ara h3)were altered by heat treatment and in particular of Ara h1and Ara h2.

peanut;allergy;allergenic protein;immunoreactivity

2014-05-14

李穎超(1984-),女,博士,研究方向:食品營養(yǎng)與安全。

*通訊作者:錢和(1962),女，博士，教授，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

國家科技支撐計劃課題(2011BAK10B03);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(1026010241120600)。

TS255.1

A

1002-0306(2015)05-0095-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.011