氨磷汀對小鼠腸型急性放射病的防護作用及其機制

趙致維,崔 宇,王麗梅,善亞君,柳曉蘭,唐紅衛(wèi),從玉文

氨磷汀對小鼠腸型急性放射病的防護作用及其機制

趙致維1,2,崔 宇2,王麗梅2,善亞君2,柳曉蘭2,唐紅衛(wèi)3,從玉文2

目的 研究氨磷汀(amifostine, WR2721)對小鼠腸型急性放射病的防護作用及其機制。方法 建立小鼠腸型急性放射病模型。C57BL/6J小鼠隨機分為對照組和WR2721給藥組,接受15 Gy60Co-γ全身照射，照后移植健康小鼠骨髓細胞，觀察小鼠受照后30 d的存活率和平均生存時間，以及用隱窩細胞微克隆實驗，研究照后3.5 d隱窩細胞數(shù)量及小腸黏膜情況。結果 對照組小鼠均在10 d內(nèi)死亡，WR2721給藥組存活率提高到80%；對照組和WR2721給藥組平均隱窩數(shù)分別為(6.1±0.7)個、(28.0±1.1)個，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；對照組和WR2721給藥組絨毛高度分別為(51.48±2.04)μm、(73.29±3.24)μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。結論 WR2721對腸型急性放射病小鼠有保護作用，通過提高隱窩干細胞增殖活性，促進黏膜的恢復，提高小鼠的存活率。

WR2721；防護；腸型急性放射??；機制

腸型急性放射病是機體受到大劑量照射后，出現(xiàn)以嘔吐、腹瀉、血水便等胃腸道癥狀為主要特征的極嚴重的急性放射病。當機體受到>10 Gy照射后，小腸干細胞出現(xiàn)死亡，絨毛不可逆損傷，整個消化道上皮失去完整性，導致吸收不良、液體丟失和電解質(zhì)紊亂，從而促使腸道菌群進入血液，最終引起菌血癥而死亡[1,2]，死亡時間一般為7～10 d。目前，腸型急性放射病的主要治療手段是全身階段性應用高強抗生素防治細菌感染[3,4]，及補充電解質(zhì)等對癥治療，但因缺乏特效的防治藥物，最終死于敗血癥和多器官衰竭。因此開發(fā)安全有效的輻射防護劑逐漸引起科學家的重視。

氨磷汀(WR2721)是一種磷酸化巰基胺，作為細胞廣譜保護藥，被FDA批準用于頭頸部腫瘤的輻射保護藥。WR2721在體內(nèi)通過其活性成分WRl065發(fā)揮作用，清除放射引起的氧自由基，保護正常細胞，促進造血細胞恢復[5-7]。研究表明，WR2721對放射引起的小腸損傷有保護作用[8,9]，但對大劑量照射引起的腸型急性放射病的輻射保護作用很少報道。本實驗通過照射后骨髓細胞移植建立腸型急性放射病模型，客觀地評價WR2721對腸型急性放射病的輻射保護作用，探討防護作用的初步機制，為其應用于腸型急性放射病的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 WR2721購自解放軍軍事醫(yī)學科學院條件處；5-溴脫氧尿嘧啶核苷購自北京中杉金橋生物技術有限公司；抗尿嘧啶核苷抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠二步試劑法(PV-6002)購自北京中山金橋生物技術有限公司；甲醛溶液購自天津市福晨化學試劑有限公司；伊紅染液(AR-0731) 購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；蘇木紫染液購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司 ；肝素鈉注射液購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；胎牛血清購自北京元亨金馬生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 動物來源與給藥 C57BL/6小鼠，雄性，體重22～23 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，每籠5只飼養(yǎng)在軍事醫(yī)學科學院SPF級實驗動物中心。標準飼料經(jīng)60Co-γ射線照射除菌后喂養(yǎng)，飲用水消毒后供小鼠自由飲用。實驗分組每組10只，對照組照前腹腔注射生理鹽水0.2 ml， WR2721給藥組照射前30 min腹腔注射WR2721 150 mg/kg。

1.3 照射 將裝有實驗動物的有機玻璃盒置于鉛板背面，接受劑量率約為55 cGy/min的屏蔽后的全身照射。

1.4 小鼠照后骨髓細胞移植 將供體小鼠處死，取雙側(cè)股骨，沖出骨髓細胞，1300 r/min離心5 min，去掉上清，收集骨髓細胞，1640培養(yǎng)液定容至4 ml，重懸沉淀，制備骨髓單細胞懸液。取10 μl細胞懸液，用3%冰醋酸稀釋后計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結果，調(diào)整細胞濃度。受體小鼠經(jīng)尾靜脈移植骨髓細胞5×106個/只。

1.5 隱窩細胞微克隆實驗 取材前3 h Brdu 120 mg/kg摻入，每只0.2 ml腹腔注射。剖腹取小腸，每只小鼠各截取5個1 cm的腸管，放在包埋盒里，固定于10%福爾馬林24 h。小腸組織經(jīng)過脫水、包埋、切片等前期處理，檸檬酸鈉水浴30 min，鹽酸酸化25 min、胃蛋白酶消化12 min，3%H2O215 min，血清封閉1 h后，抗Brdu抗體4 ℃過夜，小鼠二步法(PV-6002)1 h，DAB顯色10 sec，蘇木染色1 min，脫水封片。DAB染色為深棕色的細胞為陽性細胞，逐個腸環(huán)計數(shù)，每組至少15個腸環(huán)。

1.6 HE染色 剖腹取小腸，每只小鼠各截取5個1 cm的腸管，放在包埋盒里，固定于10%甲醛溶液24 h。小腸組織經(jīng)過脫水、包埋、切片等前期處理，蘇木染色1 min，伊紅染色15 s，脫水后封片。

2 結 果

2.1 小鼠腸型急性放射病模型的建立 腸型急性放射病小鼠主要是胃腸損傷，即使給予骨髓移植恢復造血，也不能延長存活時間，死亡時間在7～10 d。正常小鼠在分別接受 13、14、15、16 Gy照射后6 h進行健康小鼠骨髓細胞移植，結果顯示：13 Gy照射組小鼠存活率為70%；14 Gy照射組存活率為50%；15 Gy、16 Gy照射組小鼠均在7 d內(nèi)死亡，平均存活時間分別為(6.0±0.9) d，(5.3±0.9) d(圖1A)。通過HE染色觀察小腸形態(tài)發(fā)現(xiàn)，13Gy與14Gy照射組與正常小鼠相比小腸絨毛開始脫落、縮短，絨毛數(shù)量減少；15Gy、16Gy照射組小腸絨毛脫落明顯、數(shù)量明顯減少，上皮不完整(圖1B,1C)。綜合以上結果說明15Gy、16Gy這兩個照射劑量下可達到腸型急性放射病損傷程度，腸型急性放射病模型建立成功。

2.2 WR2721對腸型急性放射病小鼠存活的影響 對照組、WR2721給藥組同時接受15 Gy照射，照后6 h移植健康小鼠骨髓細胞，結果如圖2所示：對照組聯(lián)合骨髓細胞移植后小鼠在10 d內(nèi)死亡，平均存活時間為(5.6±0.5) d，WR2721給藥組聯(lián)合骨髓細胞移植后存活率提高到80%。應用Mantel log-rank方法進行生存分析， WR2721組P<0.0001，與IR組相比差異具有統(tǒng)計學意義。結果表明，WR2721能顯著提高腸型急性放射病小鼠的存活率。

2.3 WR2721對腸型急性放射病小鼠隱窩及黏膜損傷的保護作用 3.5 d隱窩細胞微克隆實驗是評價隱窩干細胞再生能力的重要指標，5個或5個以上陽性細胞計為一個再生隱窩， Brdu標記細胞增殖，在隱窩細胞計數(shù)上更準確、清楚、主觀判斷成分減低，誤差更小。實驗結果顯示，對照組隱窩細胞數(shù)明顯減少，平均隱窩數(shù)為(6.1±0.7)個；WR2721給藥組平均隱窩細胞數(shù)為(28.0±1.1)個，P<0.0001,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。實驗結果表明，WR2721可以明顯促進隱窩細胞的再生(圖3A)。

圖1 腸型急性放射病模型的建立

圖2 WR2721對腸型急性放射病小鼠存活的影響

小腸絨毛3～5 d更新1次，如果隱窩干細胞不能補充損傷的上皮細胞，小腸絨毛就會脫落。HE染色觀察照后5 d小鼠小腸黏膜，如圖3B所示對照組小鼠絨毛大部分脫落，殘存的絨毛高度縮短，上皮細胞連接不完整，隱窩細胞減少；與對照組相比，WR2721給藥組小鼠絨毛高度增加，脫落減少，用Image-pro plus6.0軟件對絨毛高度進行測量，對照組絨毛高度(51.48±2.04)μm，WR2721給藥組絨毛高度(73.29±3.24)μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。

3 討 論

目前，國內(nèi)外研究和開發(fā)了多種對骨髓型急性放射病有效的輻射防護劑，如5-AED、rhTPO、rhlL-12，但對腸型急性放射病有效的防護藥物還沒有發(fā)現(xiàn)，因此開發(fā)有效的腸型急性放射病防護藥物成為研究熱點。動物存活作為評價藥物的一個重要指標，應用全身照射，胃腸和造血等多器官受損，很難分辨出小鼠是死于胃腸損傷還是造血損傷，因此本

圖3 WR2721對腸型急性放射病小鼠隱窩細胞及絨毛的影響

實驗應用照后6 h聯(lián)合骨髓細胞移植，早期進行造血重建，避免造血損傷對存活的遠期影響，客觀的評價WR2721對腸型急性放射病的防護作用。

輻射直接導致小腸隱窩快速增殖的上皮細胞死亡，隱窩干細胞無法補充和更新小腸絨毛處的上皮細胞，導致絨毛的死亡、脫落[10]。近年來，隱窩干細胞特征標志的不斷被發(fā)現(xiàn)，Bmi1和Hopx蛋白分別是+4位隱窩干細胞特征標志；Bmi1陽性細胞主要分布于小腸上1/3處，而Hopx陽性細胞分布在全部小腸，這些細胞為小腸隱窩多功能干細胞，且Lgr5陽性CBC細胞和Bmi1或Hopx陽性+4位隱窩干細胞可以相互轉(zhuǎn)換[11,12]。Lgr5標記的連續(xù)分裂的隱窩干細胞主要用于維護腸黏膜穩(wěn)態(tài)重建，而Bmi1標記的靜態(tài)的隱窩干細胞主要參與放射等損傷后的腸黏膜重建[13]。

WR2721對腸型急性放射病的輻射防護作用機制復雜，推測其可能的機制：一方面WR2721提高細胞核P53的積累，細胞周期阻滯，促進DNA的修復[14,15]，減少凋亡[16]，促進隱窩干細胞的增殖；另一方面，放射不僅引起干細胞的損傷，還會影響造血微環(huán)境。電離輻射可誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡，導致血管功能障礙、出血，以及新血管生成困難增加[17,18]。有研究表明，WR2721增加微血管密度、血管厚度，促進新生血管形成，促進內(nèi)皮細胞增殖[19-21],這可能也是其對腸型急性放射病有輻射防護作用的原因。另外，WR2721可以減少血漿IL-2水平，抑制放射引起的免疫反應和提高粒細胞集落刺激因子，這些都有利于放射損傷的組織修復[22]。WR2721對腸型急性放射病的輻射防護作用是否通過上述機制介導，還有待進一步研究。

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(2015-01-20收稿 2015-03-09修回)

(責任編輯 岳建華)

Protective effect and mechanism of amifostine on intestinal acute radiation sickness

ZHAO Zhiwei1,2, CUI Yu2,WANG Limei2, SHAN Yajun2,TANG Hongwei3,and CONG Yuwen2.

1.Graduate School，Xuzhou Medical College, Xuzhou 221000, China;2.Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Science，Beijing 100850，China;3.Department of Gastroenterology,The General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing100039，China

Objective To study the radioprotection effect and mechanism of amifostine (WR2721) on intestinal acute radiation sickness. Methods Based on the intestinal acute radiation sickness model, C57BL/6J mice were randomly divided into control group and group WR2721. Bone marrow cells from healthy mice were transplanted after 15 Gy60Co-γ shielded body irradiation. Then the survival rate in 30 d after irradiation, and the number of proliferative crypt cells and the small intestine mucosa situation with micro-cloning survival assay of mouse crypt cells at 3.5d post-irradiation were observed . Results The mice in control group died within 10 days, survival rate in WR2721 administrered group increased to 80%; in the control group and WR2721 drug group, the average number of crypts were 6.1±0.7, 28±1.1, the difference was statistically significant (P<0.0001); in control group and WR2721 administered group, villus heights were(51.48±2.04)μm, (73.29±3.24)μm, the difference was statistically significant (P<0.0001). Conclusions WR2721 has significantly radioprotective effect on intestinal acute radiation sickness by improving the survival rate of mice, promoting crypt cells regeneration and protecting the intestinal mucosa.

WR2721；radioprotection；intestinal acute radiation sickness; mechanism

國家新藥創(chuàng)制重大專項(2013ZX09J13102-02C)；國家自然科學基金面上項目(81272997)

趙致維，碩士研究生，醫(yī)師，E-mall：happyzhaozhiwei@163.com

1.221000，徐州醫(yī)學院；2.100850北京，解放軍軍事醫(yī)學科學院放射研究所；3.100039 北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

唐紅衛(wèi)，E-mall：thwwjp@hotmail.com

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