組織細(xì)胞在炎性腸病鑒別診斷中的意義

徐 薪，紀(jì)小龍，徐明志

組織細(xì)胞在炎性腸病鑒別診斷中的意義

徐 薪1，紀(jì)小龍1，徐明志2

目的 研究炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)腸黏膜內(nèi)組織細(xì)胞種類與分布特點(diǎn),為其鑒別診斷尋找線索。方法 參照2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)新制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)選取病例，結(jié)合臨床病史及內(nèi)鏡下表現(xiàn)做出診斷,確定潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)組 30例，克羅恩病(Crohn’s disease,CD)組 26例，選取10例正常腸黏膜作為對(duì)照組。所有病例均HE染色及加做6項(xiàng)免疫組化染色(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67)。所有切片均掃描進(jìn)入優(yōu)納ISCAN系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果 UC(80.72±17.15)個(gè)/104μm2及CD(78.59±16.37)個(gè)/104μm2的固有層內(nèi)細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組(59.57±14.04)個(gè)/104μm2相比均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CD1a在正常腸黏膜及UC內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)[(0.72±0.79)個(gè)/104μm2， CD(22.19±10.19)個(gè)/104μm2]統(tǒng)計(jì)分析比較與正常對(duì)照組及UC(1.32±2.26)個(gè)/104μm2均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD21在組織學(xué)上的鑒別診斷意義不大。S-100三組的組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD68 CD組(16.02±7.33)個(gè)/104μm2的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于正常對(duì)照組(21.92±6.18)個(gè)/104μm2和UC組(19.96±11.31)個(gè)/104μm2，與UC及正常對(duì)照組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD163染色時(shí)CD與UC組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Ki67三組的組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 通過(guò)多種組織細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果可以綜合判斷IBD的免疫狀態(tài)及對(duì)UC和CD進(jìn)行鑒別診斷。

炎性反應(yīng)性腸??； 組織細(xì)胞； 免疫組織化學(xué)染色； 形態(tài)學(xué)

炎性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種常見(jiàn)的慢性腸道疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)。兩者的鑒別診斷一直是一大難題。本研究旨在為IBD的診斷及鑒別診斷方法發(fā)現(xiàn)新問(wèn)題，找到新思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2011-01-01至2013-06-30武警總醫(yī)院病理科經(jīng)消化科及病理科共同診斷為IBD的病例187例，重新查閱病史、內(nèi)鏡資料及重新閱片，根據(jù)2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎性反應(yīng)性腸病學(xué)組的炎性反應(yīng)性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)[1]的標(biāo)準(zhǔn)重新診斷，經(jīng)篩選后的病例UC組 30例，CD組 26例，病變部位集中在回盲部距肛門(mén)口5 cm內(nèi)。另外通過(guò)正常體檢腸鏡檢查，選取10例正常大腸腸壁組織作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 每個(gè)蠟塊按病理號(hào)進(jìn)行連續(xù)切片7張，厚約5 μm，HE染色1張，選取了6種抗體分別進(jìn)行標(biāo)記，分別為CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67。所選用抗體除CD163為中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供外，均由北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司提供。方法：常規(guī)兩步法免疫組化染色。

1.3 計(jì)算分析 所有切片均掃描進(jìn)入優(yōu)納ISCAN系統(tǒng)(由優(yōu)納數(shù)字醫(yī)療進(jìn)行分析，半定量標(biāo)準(zhǔn)：在×40放大倍數(shù)下(目鏡×10,物鏡×4)，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，取該放大倍數(shù)下細(xì)胞數(shù)/104μm2[3]。系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算出ROI線內(nèi)包含的細(xì)胞數(shù)，得出最終細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 正常對(duì)照組五種染色結(jié)果 正常對(duì)照組中，DC染色除CD1a與CD21比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他各抗體的比較結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。巨噬細(xì)胞染色的CD68和CD163比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 ,表1)。

2.2 UC組五種染色結(jié)果分析 UC組的組織細(xì)胞染色結(jié)果為CD21、CD68和CD163(圖1)，三組之間的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD1a與其他四組抗體比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 正常對(duì)照組組織細(xì)胞染色抗體的組間比較 ±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

圖1 UC組抗體染色圖(×40)

±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

2.3 CD組五種染色結(jié)果分析 CD組組織細(xì)胞染色結(jié)果分析(圖2)，除CD163與CD1a及S-100比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各抗體之間的比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

表3 CD組組織細(xì)胞染色抗體的組間比較 ±s)

注：CD1a與其他抗體比較,①P<0.05； CD21與其他抗體比較,②P<0.05；CD68與其他抗體比較,③P<0.05； CD163與其他抗體比較,④P<0.05；與其他抗體比較, ⑤P<0.05

3 討 論

正常腸道的腺體之間散布著的細(xì)胞數(shù)量不是很多，平均細(xì)胞數(shù)為(59.57±14.04)個(gè)/104μm2。本研究發(fā)現(xiàn)，UC鏡下表現(xiàn)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，UC及CD的細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

單核巨噬細(xì)胞作為黏膜免疫的第一道防線，在炎性反應(yīng)時(shí)對(duì)病原體具有很強(qiáng)的吞噬和溶解功能，同時(shí)還通過(guò)抗原遞呈和分泌細(xì)胞因子激活特異性的宿主免疫反應(yīng)。樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是兩類最重要的專職抗原呈遞細(xì)胞[3]。

3.1 樹(shù)突狀細(xì)胞 在體內(nèi)數(shù)量較少，但分布較廣，DC作為體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞,不僅可以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，而且可以誘導(dǎo)免疫耐受。

CD1a為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(immature DC，iDC)的特異性表面標(biāo)志[4]。在正常腸黏膜內(nèi)幾乎沒(méi)有表達(dá)。CD1a在UC固有層內(nèi)可見(jiàn)到極個(gè)別陽(yáng)性細(xì)胞，與正常腸黏膜內(nèi)的分布比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，淋巴濾泡內(nèi)則未見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞。CD的CD1a陽(yáng)性DCs主要在靠近上皮的固有層內(nèi)聚集分布，部分散在。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)要比正常對(duì)照組和UC多，小血管周?chē)傲馨图?xì)胞周?chē)梢?jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞,平均細(xì)胞數(shù)：(22.19±10.19)個(gè)/104μm2。統(tǒng)計(jì)分析比較與正常對(duì)照組及UC均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。CD1a染色在正常腸黏膜及IBD的這種差別還沒(méi)有報(bào)道。UC與CD雖然同為免疫性疾病，但二者的發(fā)病機(jī)制不同。

S-100蛋白是DC較好的標(biāo)記物，S-100陽(yáng)性DC作為一種免疫抗原提呈細(xì)胞分布于全身各器官組織中。正常對(duì)照組中S-100固有層內(nèi)(陽(yáng)性)。UC組S-100在固有層內(nèi)分布廣，與淋巴細(xì)胞接觸緊密，且越靠近表面數(shù)量越多，平均細(xì)胞數(shù)：(37.14±15.04)個(gè)/104μm2。CD陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于UC(20.27±7.57個(gè)/104μm2)。三組的組間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。S-100染色陽(yáng)性的DC細(xì)胞是比較成熟的DC細(xì)胞，三組間的差異，說(shuō)明了正常對(duì)照組與IBD免疫狀態(tài)的不同，并且UC的抗原提呈細(xì)胞要多于CD。

CD21用來(lái)標(biāo)記濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞(follicular dendritic cell,FDC)。正常腸黏膜內(nèi)，CD21顯示明確的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。UC的CD21陽(yáng)性細(xì)胞在固有層內(nèi)可見(jiàn)到散在分布細(xì)胞。CD的CD21陽(yáng)性細(xì)胞與上皮細(xì)胞及血管的關(guān)系比較密切。三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)際工作中，CD21主要用來(lái)標(biāo)記濾泡樹(shù)突細(xì)胞網(wǎng)，固有層內(nèi)也可以見(jiàn)到散在分布的CD21陽(yáng)性細(xì)胞， 由于CD21也可以使部分T、B染色，在組織學(xué)上的鑒別診斷意義不大。

3.2 巨噬細(xì)胞 在體內(nèi)分布廣，且具有強(qiáng)大的吞噬功能。巨噬細(xì)胞本身也是免疫效應(yīng)細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞[5]。

CD68染色組織細(xì)胞呈陽(yáng)性。正常對(duì)照組CD68在固有層內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，但上皮細(xì)胞之間未見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞，越靠近上皮部位陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。UC組的陽(yáng)性細(xì)胞在固有層內(nèi)密集分布，淋巴細(xì)胞聚集區(qū)則為陰性，與上皮細(xì)胞接觸緊密，偶可見(jiàn)CD68陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)入到上皮細(xì)胞之間。CD組中的CD68分布情況與UC大致相同，在形成肉芽組織部位可見(jiàn)聚集現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，UC組與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 而CD組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于正常對(duì)照組和UC組，與UC及正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。文獻(xiàn)[6]報(bào)道，IBD時(shí)腸黏膜固有層內(nèi)存在大量的CD68陽(yáng)性細(xì)胞，與正常腸黏膜相比具有顯著差異，提示IBD的發(fā)生與固有層內(nèi)免疫細(xì)胞的增多可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，CD的CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞少于UC組， CD68染色可作為UC與CD的鑒別診斷方法。

CD163限制性表達(dá)于單核/巨噬細(xì)胞系。文獻(xiàn)[7]報(bào)道，CD163是單核巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記，早期免疫組化研究多用CD68作為巨噬細(xì)胞標(biāo)記，但發(fā)現(xiàn)CD68還可表達(dá)于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞，因此不能作為巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記。

綜上所述，消化內(nèi)鏡下取得的鉗夾標(biāo)本，只要取到了黏膜固有層，通過(guò)多種抗體的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果綜合分析，可以對(duì)UC與CD予以鑒別，為臨床治療提供參考。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎性反應(yīng)性腸病學(xué)組.炎性反應(yīng)性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)(2012.廣州)[J].中華內(nèi)科雜志，2012，51(10)：818-831.

[2] 高英茂，宋天保.組織學(xué)與胚胎學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：153-155.

[3] 紀(jì)小龍.消化道病理學(xué)[M].北京: 人民軍醫(yī)出版社,2010:383-387.

[4] 紀(jì)小龍，張 雷.診斷免疫組織化學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2011：45-53.

[5] Caballero T, Nogueras F, Medina M T,etal. Intraepithelial and lamina proprialeuecxtyle subsets in inflammatory bowel disease: an immunohistocheical study of colon and biospy specimens[J]. J Clin Pathol, 1995, 48:743-748.

[6] 李 寧，劉冠賢，石詠軍，等.樹(shù)突狀細(xì)胞與免疫調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展[J].西南軍醫(yī)，2010,12(3)：504-506.

[7] Steinman R M，Hawiger D，Liu K，etal. Dendritic cell funtion in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance [J]. Ann NY Acad Sci, 2003,987:15-25.

(2014-11-11收稿 2015-01-12修回)

(責(zé)任編輯 尤偉杰)

Significance of tissue cells in diagnosis of inflammatory bowel disease

XU Xin1，JI Xiaolong1，and XU Mingzhi2.

1. Department of Pathology，General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces，Beijing 100039,China;2.the Second Clinic, National Defense University of PLA, Beijing 100063,China

Objective Inflammatory bowel disease(IBD) includes ulcerative colitis(UC) and Crohn’s disease(CD). Definitive diagnosis of UC and CD relies on colonoscopy and biopsy, but it is difficult to give a definitive diagnosis for pathologists by specimens taken from colonoscopy. We hope that through the study for distribution and types of tissue cells within lesions ,looking for new clues to differential diagnosis.Methods Combining clinical history, endoscopy and the new standard, we remade the diagnosis, finally made sure of 30 cases of UC, 26 cases of CD, and 10 cases of normal intestine mucosa taken as the control. All the cases were re-stained by HE and two-step IHC for 6 items of antigens(CD1a、CD21、CD68、CD163、S-100、Ki-67), and these sections were analyzed by UNISCAN system to do semi-quota standard. The SPSS13.0 was used for statistics. The IHC was also analyzed through dividing the strength of the positive staining. Results The cell number in the CD and UC was significantly different from the control(P<0.01). In the CD mucosa, there were more positive cells than in the normal control and UC, with statistically significant difference(P<0.05).The CD21 expression could be the result of other cells stained, and had little diagnostic value. The S-100 positive cell types were rich in these 3 groups, in every two group with statistically significant difference(P<0.05).There was no CD68 expression statistically significant difference in the UC group compared with normal control(P>0.05), but the positive cell number in the CD group were less compared with the normal control and UC group, with statistically significant difference(P<0.05). There were rare Ki67 positive cells in the control group. In the UC group the Ki67 positive cells were more than in the CD group. Three groups of comparisons between groups were statistically significantly different (P<0.05).Conclusions These antibodies can be used as staining differential diagnosis of UC and CD. CD1a:UC(-),CD(+); Ki67 UC(+>10%),CD(+1%-2%);number of positive cells of S-100 and CD68， UC〉CD. The other antibodies can be used as auxiliary diagnositic means.

inflammatory bowel disease; tissue cells; immunohistochemistry; morphology

徐 薪，博士，主治醫(yī)師，E-mail:xxblueflower@163.com

1.100039 北京，武警總醫(yī)院病理科;2.100063 北京，國(guó)防大學(xué)第二門(mén)診部

紀(jì)小龍，E-mail: geexl@126.com

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