大豆轉(zhuǎn)基因研究進展

*基金項目：天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項目（15004）

摘要：本文介紹了大豆轉(zhuǎn)基因中常用的方法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電擊法、PEG轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法等轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法的研究進展及其在大豆抗蟲、抗病、抗除草劑等方面轉(zhuǎn)化外源基因上的應(yīng)用狀況。

文獻標志碼：A

文章編號：1674-3547(2015)05-0018-09

收稿日期：2015－08－25

第一作者：姚丙晨，碩士，研究實習(xí)員，從事大豆與水稻基因功能組學(xué)研究

Transgenic Techniques and Application in Soybeans

YaoBingchen,YanShuangyong,Sujingping,MaZhongyou,WangXiaojing,SunYue, LiuXuejun

（Tianjin Crop Research Institute, Tianjin 300112, China）

Abstract: This article introduced the recent development of common used transgenic techniques in soybeans, including agrobacterium medium, electro- pulse method, PEG, particle bombing, and transformation in situ mediated by agrobacterium. The application of these techniques in insect pest resistance, disease resistance, herbicide resistance were summarized.

Key words: Soybean; Transgenic method; Progress

當生物學(xué)進入分子生物學(xué)時代以后，有關(guān)大豆的科學(xué)研究也進入快速發(fā)展的時期，尤其大豆的基因工程研究工作給生產(chǎn)上帶來了巨大的經(jīng)濟效益。但是相對于水稻、煙草等作物來說，大豆的高效遺傳轉(zhuǎn)化一直是植物基因工程領(lǐng)域的難點之一。

植物轉(zhuǎn)基因有很多的方法，主要分為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、植物病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化、DNA直接介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化、種植系統(tǒng)介導(dǎo)等，其中，DNA直接介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化包括：PEG法、基因槍法、顯微注射法、超聲波法、激光微束法、電激法等；種植系統(tǒng)介導(dǎo)包括花粉管通道法、萌動種胚浸泡法、胚囊和子房注射法等 [1-2]。大豆轉(zhuǎn)基因的方法主要有，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、PEG法、電激法、花粉管通道法和顯微注射法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法為主要的研究方法 [3]。

1　農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化是利用生物學(xué)載體和農(nóng)桿菌把理想的外源基因?qū)氲街参锘蚪M中 [4-5]。其具有操作簡單，成本低，遺傳穩(wěn)定，整合完整，拷貝數(shù)少，甚至是單拷貝以及受目的基因分子量限制小的優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化 [6-7]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化利用的外植體有子葉節(jié)、未成熟胚、幼胚懸浮培養(yǎng)、胚尖 [8-12]。最初的方法依賴于大豆對農(nóng)桿菌感染的易感性和植株再生的可用性的基因型 [8, 13-14]。最近幾年的研究進展，如下所述，已經(jīng)克服了這些缺點 [15-17]。

通過農(nóng)桿菌侵染吸脹成熟種子和未成熟的子葉節(jié)已經(jīng)成功的得到了轉(zhuǎn)基因大豆和較好的重復(fù)率 [8, 18-21]。子葉節(jié)區(qū)域包含子葉和下胚軸之間交界處的腋芽生分生組織。腋芽分生組織的增殖和再生，通過在含有細胞分裂素—6-BA上形成多個不定芽實現(xiàn)的。芽體形成的能力外植體的基因型起主要作用，大多數(shù)基因型都它可以在子葉節(jié)點形成不定芽。在一般的情況下外植體需要用手術(shù)刀或小針預(yù)先制造一個傷口，但是這需要良好的實驗技能來為細菌準備充分的靶組織供其侵染，相比之下，實驗人員通過微型刷就可以很容易的創(chuàng)造出來均勻的傷口組織 [21-24]。

在固體的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入抗氧化劑L-半胱氨酸和巰基化合物可以顯著地提高子葉節(jié)初細胞的轉(zhuǎn)化效率 [20, 23]和轉(zhuǎn)基因植株的再生效率 [17,20,23]?？寡趸瘎┛梢酝ㄟ^抑制傷口和病原體發(fā)生的反應(yīng)，從而增加農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化效率 [20]。抗氧化劑組合，超級雙元載體，乙酰丁香酮可以提高效率和大豆基因型的轉(zhuǎn)化能力 [26-28]。第一個轉(zhuǎn)基因大豆是以抗卡那霉素的nptII基因為標記基因產(chǎn)生的 [8]?，F(xiàn)在是通過bar基因和抗除草劑基因篩選轉(zhuǎn)化細胞，篩選濃度極大地影響了轉(zhuǎn)化率，因此，對不同的大豆基因型要選擇適當?shù)牟煌瑵舛?[22, 29]。

這些被改進的轉(zhuǎn)化體系被廣泛的應(yīng)用于許多的國內(nèi)品種，比如，合豐35、合豐25、綏農(nóng)14、東農(nóng)50、東引小粒豆、東農(nóng)42等 [30-34]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆的效率是0.2%到10% [19-20, 29, 35]，大豆的轉(zhuǎn)化效率依然依賴于實驗人員的技術(shù)和大豆的基因型。和基因槍相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率依然比較低。

2　基因槍

粒子轟擊，也被稱為基因槍或基因槍技術(shù)，指用涂有目的基因的小鎢或金顆粒朝目標植物細胞轟擊 [36]。自從1988年第一次基因槍轉(zhuǎn)化大豆獲得成功后，科學(xué)家先后以未成熟種子的分生組織、莖尖分生組織、體細胞胚組織為外植體進行基因槍轉(zhuǎn)化獲得成功 [37-39]。

最初體細胞胚是作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的目標，后來發(fā)現(xiàn)它更適合于粒子轟擊轉(zhuǎn)化 [38, 40-42]。1983年，Christianson等 [43]首先報道了大豆體細胞發(fā)生，未成熟子葉體細胞胚在含有高濃度生長素，如2,4-D中誘導(dǎo)，用于生成增殖胚培養(yǎng)和恢復(fù)整個植物 [44-48]。由于增生胚組織的形成取決于基因型，因此利用轉(zhuǎn)化的基因型一直局限于幾個大豆品種。鑒于其具有體細胞胚誘導(dǎo)能力，胚增殖能力，恢復(fù)整個植株的能力等優(yōu)點，Jack已被確認為一個進行大豆遺傳轉(zhuǎn)化的主要基因型，并已專門用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因大豆 [49-51]，因此組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化只需要克服基因型的影響 [52-53]。這樣的限制導(dǎo)致我們不能在特定的品種中進行轉(zhuǎn)基因功能分析和品種改良。體細胞胚胎再生是一種可以通過雜交育種改善的遺傳性狀 [54]，體細胞胚胎再生能力成功的轉(zhuǎn)移并結(jié)合在其他基因型上 [55-56]。

轉(zhuǎn)化的物理過程往往會導(dǎo)致大的復(fù)合物、碎片和重組目的基因的整合，這有時會導(dǎo)致目的基因或同源的內(nèi)源基因的沉默 [57-59]和DsRed2基因作為報告基因可以幫助減少相關(guān)物理問題改造的基因沉默與系統(tǒng)和促進目的基因的在轉(zhuǎn)基因植物中穩(wěn)定表達 [57, 60]。如水稻遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果中所示，線性轉(zhuǎn)基因構(gòu)造缺乏載體骨干序列也可能產(chǎn)生簡單的整合拷貝數(shù)低轉(zhuǎn)基因大豆植株[61]。

大豆體細胞胚作為合子胚模型已經(jīng)吸引了更多的關(guān)注。增殖體細胞胚胎可以保留一年多的分化和發(fā)育再生特性，當它需要時比較容易誘導(dǎo) [44, 47]。成熟的體細胞胚積累的貯藏蛋白與種子發(fā)育在時間和空降上相同 [62-63]，其脂肪酸組成也和種子相似 [64-65]。通常在帶有外緣基因的粒子轟擊體細胞胚7天后可以獲得轉(zhuǎn)基因胚胎，轉(zhuǎn)基因胚胎的同質(zhì)群體可隨時和重復(fù)誘導(dǎo)分化 [66]。因此，在再生為植株前體細胞胚已經(jīng)被用于評估轉(zhuǎn)基因種子性狀，然后篩選克隆讓其成為轉(zhuǎn)基因植株 [67-71]。

正如前面提到的體細胞胚粒子轟擊介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的改進使整個實驗時的廣泛重現(xiàn)性好，但是仍有一定的局限性 [56-57, 66, 72-81]。2008年，日本RIKEN研究所植物科學(xué)中心支持轉(zhuǎn)化網(wǎng)絡(luò)聯(lián)盟，以加強日本植物生物學(xué)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究；日本的學(xué)術(shù)研究人員的要求下，根據(jù)合作研究協(xié)議，在北海道地區(qū)的國家農(nóng)業(yè)研究中心的工作人員將創(chuàng)建粒子轟擊介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因大豆 [84]。

3　聚乙二烯（PEG）

PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是Davay等在1980年首先建立的。PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鳥氨酸（PLO）、磷酸鈣以及高pH條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外緣DNA分子，其中聚乙二醇、聚乙烯醇（PVA）和多聚L-鳥氨酸等都是細胞融合劑。PEG可以是細胞膜之間或是DNA與膜形成分子橋，促使相互間的接觸和粘連，另外，有實驗證明，PEG是通過引起膜表面的電荷紊亂，干擾細胞間的識別，有利于細胞膜間的融合和外源DNA進入原生質(zhì)體，因此稱之為PEG誘導(dǎo)法 [2, 83]。PEG直接轉(zhuǎn)化法對禾本科作物有重要的作用，已經(jīng)在水稻、高粱和小麥等重要糧食作物都獲得了轉(zhuǎn)基因植株 [84]。PEG在大豆上的應(yīng)用，目前僅有衛(wèi)志明和南相陽兩例報道 [85-86]。

4　電激法

電激法是利用植物原生質(zhì)體具有整合和表達外源DNA的能力，是細胞膜透性在高壓脈沖處理下發(fā)生變化，出現(xiàn)一顆可逆性空隙，促進外源DNA的攝取和整合，并可以穩(wěn)定遺傳。李寶劍等人首次將其用于植物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。用電激法轉(zhuǎn)化大豆的報道并不多見。Christou等和Lin等均于1987年最先報道了電激法在大豆遺傳轉(zhuǎn)化上的應(yīng)用，他們分別以合子胚和子葉分離的原生質(zhì)體為外植體，他們都成功地導(dǎo)入了基因，但是并沒有獲得再生植株 [87-88]。Chowrira等對活體芽進行點擊，得到了帶有標記基因的轉(zhuǎn)基因植株 [89-90]。

5　顯微注射

顯微注射法進行基因轉(zhuǎn)化是一種比較經(jīng)典的技術(shù)，其理論和技術(shù)方面的研究都比較成熟。特別是在動物細胞或卵細胞的遺傳轉(zhuǎn)化、核移植及細胞器的移植等方面應(yīng)用很多。近年來，這項技術(shù)以培養(yǎng)細胞或胚性細胞團為受體 [91]。在大豆遺傳轉(zhuǎn)化方面，其是利用專門的儀器將目的基因或載體注入大豆的合子期子房或豆莢。1989年，劉博林等 [92]翔冬龍葵阿特拉津抗性psbA基因在合子期時注入對阿特拉津敏感的大豆子房中，得到了頻率很高的psbA基因在大豆葉綠體基因組上的表達；同年，Chee等 [93]在大豆無菌苗的腋芽區(qū)域注射農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化，得到的轉(zhuǎn)化頻率較低的大豆轉(zhuǎn)基因植株。2000年張燕君等 [94]將牛酪蛋白基因CaseinB用注射法導(dǎo)入大豆受精子房中獲得轉(zhuǎn)基因植株。2009年劉建鳳 [95]將耐鹽基因AIHX1通過子房滴注入大豆子房中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率達到3.18%。

6　花粉管通道

花粉管通道技術(shù)是利用花粉管通道導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)，他是由我國生物化學(xué)家周光召首先建立的，但是其機制尚不明確。在我國首批批準釋放的大田轉(zhuǎn)基因作物中，中國農(nóng)科院培育的具有Bt殺蟲蛋白基因和豇豆胰蛋白酶抑制基因的雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花正是利用花粉管通道法獲得的 [96]，由此可以證明花粉管通道法是可以應(yīng)用于基因表達載體和總DNA等多種形態(tài)的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

因其具有，操作簡單，育種時間縮短，外源DNA來源豐富等優(yōu)點，在植株遺傳轉(zhuǎn)化和作物育種上有重要的應(yīng)用價值。雷勃鈞等 [97]用花粉管通道技術(shù)，將外源DNA直接導(dǎo)入栽培大豆，轉(zhuǎn)化后代表現(xiàn)出在熟期、種皮顏色、蛋白質(zhì)含量等方面的變異。劉德璞等 [98]在大豆自花授粉后，使用同一技術(shù)向栽培大豆導(dǎo)入外源DNA，獲得了生育期、生長習(xí)性、株高、節(jié)數(shù)、分枝等傾向供體的變異性狀，對SMV的抗性也得到了提高。2001年吳秀紅 [99]報道了大豆花粉管通道法導(dǎo)入外源DNA后，在后代中發(fā)現(xiàn)外源基因在大豆細胞內(nèi)存在、并表現(xiàn)多種變異性狀。2009年高曉蓉 [100]利用花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)化植酸酶基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率達到13%。

7　展望

近些年來大豆的轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了較大的進展，大豆轉(zhuǎn)基因已不是限制大豆功能基因組學(xué)研究的主要因素，隨著大豆基因組計劃的完成也有大批重要農(nóng)藝性狀的基因被克隆，這樣會促進大豆基因工程的全面展開，從而不再局限于抗蟲、抗除草劑等研究，真正從分子水平有針對性的改良大豆的品質(zhì)，人類也必將因此更加受益。