云南烏金豬與約大烏豬低氧適應(yīng)性的研究

李美荃，張春勇，安清聰，潘洪彬，陳克嶙，郭榮富

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

云南烏金豬與約大烏豬低氧適應(yīng)性的研究

李美荃，張春勇，安清聰，潘洪彬，陳克嶙，郭榮富*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

旨在探明云南高原烏金豬與約大烏豬低氧適應(yīng)差異。采集60日齡烏金豬與約大烏豬各30頭(公母各半)血樣，檢測(cè)烏金豬和約大烏豬血液血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)、平均血紅蛋白含量(MCH)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)和氧飽和度生理表征參數(shù)。屠宰60日齡烏金豬與約大烏豬各12頭(公母各半)，采用Real-time PCR方法檢測(cè)心、肝、肺、腎、空腸、回腸、十二指腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢12種組織中HIF-1α、VEGF、EPO基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，烏金豬HGB和RBC極顯著(P<0.01)高于約大烏豬，而HCT和MCH低于約大烏豬，烏金豬氧飽和度高于約大烏豬，但差異不顯著 (P>0.05)。在烏金豬與約大烏豬的各個(gè)組織中均檢測(cè)到HIF-1α、VEGF、EPO基因mRNA的表達(dá)；在低氧適應(yīng)基因中，HIF-1α基因在肝、肺、胰腺、腎和皮膚組織表達(dá)量最高，VEGF基因在肝、肺和胰腺表達(dá)量最高，EPO基因在腎和肝表達(dá)量最高；HIF-1α、VEGF、EPO基因在兩豬種中的表達(dá)量趨勢(shì)一致，約大烏豬組織中的總體表達(dá)量高于烏金豬的表達(dá)量；母豬低氧適應(yīng)基因的總體表達(dá)量顯著高于公豬。烏金豬低氧適應(yīng)生理表征參數(shù)明顯高于約大烏豬，在多數(shù)組織約大烏豬低氧適應(yīng)基因的表達(dá)高于烏金豬。但對(duì)其高原低氧適應(yīng)性機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

烏金豬；約大烏豬；HIF-1α；VEGF；EPO；基因表達(dá)

高海拔低氧是高原豬種生存與種屬繁衍的重要生態(tài)環(huán)境，高原本地豬種與培育豬種相比，其貯脂能力強(qiáng)，肌肉中亞油酸、亞麻油酸和花生油酸含量高，肉質(zhì)好，其耐粗飼、抗病力和抗氧化能力更強(qiáng)，但生長(zhǎng)速度緩慢、繁殖率低。高原豬種是高原民族重要的動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源之一，是發(fā)展高原養(yǎng)豬業(yè)的珍稀種質(zhì)資源。高原豬種長(zhǎng)期生活在高原低氧生態(tài)環(huán)境條件下，形成了獨(dú)特的生物學(xué)和遺傳特性，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗逆性。本地豬種和培育豬種對(duì)高原環(huán)境的適應(yīng)性表現(xiàn)出明顯差異性，這可能與高原豬種低氧適應(yīng)基因密切相關(guān)。因此，研究不同豬種高原低氧適應(yīng)基因表達(dá)和作用，對(duì)開(kāi)發(fā)和利用高原豬種具有重要參考價(jià)值。

缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF) 和促紅細(xì)胞生成素(EPO)是哺乳動(dòng)物重要的低氧適應(yīng)基因。G.L.Semenza等首次發(fā)現(xiàn)了一種能特異性地結(jié)合于EPO的低氧反應(yīng)元件上的蛋白，稱之為HIF-1α[1]。HIF-1是由α和β兩個(gè)亞基形成的異二聚體，其中HIF-1α蛋白是在低氧調(diào)節(jié)中起主要功能的亞基，對(duì)氧敏感，而HIF-1β蛋白對(duì)氧不敏感，因此HIF-1的活性主要取決于α亞基的活性[2-4]。HIF-1通過(guò)調(diào)節(jié)多種低氧反應(yīng)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)糖與能量代謝，影響新血管的生成，細(xì)胞的發(fā)育、增殖與凋亡，鐵代謝，糖酵解等過(guò)程[5-6]。I.Mylonis等報(bào)道，低氧條件下，HIF-1還可以通過(guò)介導(dǎo)刺激Lipin1的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)甘油三脂的積累[7]。M.Parsanejad等報(bào)道，DJ-1可調(diào)控VHL/HIF-1信號(hào)傳導(dǎo)通路[8]。E.M.De Francesco等報(bào)道，GPER通過(guò)雌激素介導(dǎo)激活HIF-1α/VEGF信號(hào)通路[9]。VEGF和EPO是低氧誘導(dǎo)因子的靶基因，VEGF是細(xì)胞因子的一種，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，廣泛存在于動(dòng)物組織中具有高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂時(shí)期[10-11]，EPO對(duì)機(jī)體紅細(xì)胞的生成起著重要的調(diào)控作用，主要作用于骨髓造血細(xì)胞[12]。D.A.Vesey等通過(guò)體外試驗(yàn)證實(shí)，高濃度的EPO(400 U·mL-1)可以刺激低氧條件下的合成和細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡[13]。高原低氧環(huán)境顯著影響血液中的血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞數(shù)(RBC)。T.H.Jessen等報(bào)道，安第斯雁(Andeangoose)生活在南美海拔5 000～6 000 m高原，其血紅蛋白也顯示高的血氧親和力[14]。血紅蛋白與低氧環(huán)境密切相關(guān)，其含量變化直接影響低氧適應(yīng)基因的表達(dá)。D.Yoon報(bào)道，HIFs在調(diào)控鐵代謝與紅細(xì)胞生成中起了重要的作用[15]。

烏金豬屬于高原放牧性豬種，主要分布在云南、貴州、四川 3省接壤的烏蒙山和大、小涼山地區(qū)，已形成不同類(lèi)群，主要有貴州省的柯樂(lè)豬，云南富源的大河豬，昭通市的昭通豬和四川省的涼山豬，均屬西南型豬種。烏金豬耐粗飼，優(yōu)質(zhì)健壯，適應(yīng)高原低氧生態(tài)環(huán)境，但生長(zhǎng)速度慢、脂肪沉積高、瘦肉率低。而約大烏豬屬于新培育雜交豬種，含有25%烏金豬血緣。本地烏金豬日增重約250 g，瘦肉率約45%；而約大烏豬日增重約800 g，瘦肉率57%以上，雜交改良明顯提高了雜交豬種的瘦肉率和生長(zhǎng)速度。藏豬也是高原豬種，長(zhǎng)期生長(zhǎng)于高原環(huán)境具有較強(qiáng)低氧適應(yīng)能力，劉金鳳等報(bào)道，藏豬EPO基因相對(duì)于長(zhǎng)白豬出現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)突變，推斷藏豬可能是由于長(zhǎng)期缺氧環(huán)境導(dǎo)致基因突變[16]。高原低氧是影響高原豬種健康和遺傳生長(zhǎng)潛力的重要生態(tài)因素，云南烏金豬具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗逆性，而具有本地烏金豬血緣的約大烏豬具有較好的生長(zhǎng)速度和瘦肉率，在云南獨(dú)特的生態(tài)條件下，烏金豬與約大烏豬的健康和生產(chǎn)性能存在明顯差異，這可能與高原低氧適應(yīng)基因表達(dá)和作用密切相關(guān)。本試驗(yàn)以烏金豬和約大烏豬為研究對(duì)象，檢測(cè)高原低氧血液生理表征參數(shù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量法研究約大烏豬與烏金豬不同組織中HIF-1α、VEGF、EPO基因的差異性表達(dá)，探討烏金豬與約大烏豬高原低氧適應(yīng)基因之間的差異。

1 材料與方法

1.1 血樣和組織樣品采集

本試驗(yàn)中烏金豬來(lái)自云南省富源縣大河鎮(zhèn)的大河豬場(chǎng)，海拔2 610 m，42日齡斷奶，與培育的約大烏豬在相同日糧類(lèi)型和飼養(yǎng)管理下飼養(yǎng)至60日齡，選擇烏金豬(12.63±0.82)kg和約大烏豬(18.92±0.69)kg各30頭(1/2♂，1/2♀)，采用Pulse Oximeter Model 300，經(jīng)豬耳緣測(cè)定氧飽和度(Beijing Choice Electronic Technology Co.，Ltd.)，空腹12 h，經(jīng)前腔靜脈采血10 mL，使用肝素抗凝管獲得全血，非肝素抗凝管用于分離血清(3 000 r·min-1)，血常規(guī)采用BC-1800全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)進(jìn)行測(cè)定，采用試劑盒(南京建成公司)測(cè)定HGB、HCT、RBC、MCH和MCHC參數(shù)。隨后從已采血的烏金豬與約大烏豬中隨機(jī)各選取12頭(6♂，6♀)屠宰，共24頭，收集心、肝、肺、腎、十二指腸、空腸、回腸、皮膚、肌肉、胰腺、睪丸或卵巢12種組織，剔除脂肪組織，迅速剪碎，液氮速凍，-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取

各組織總RNA提取按照RNA simple Total RNA Kit(北京天根)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每50～100 mg 組織加1 mL裂解液。各組織經(jīng)過(guò)研磨粉碎勻漿后，加入氯仿萃取。最后得到的總RNA溶解于超純水中，總RNA的純度與濃度分別用分光光度計(jì)在260與280 nm下檢測(cè)。

1.3 反轉(zhuǎn)錄

采用相同濃度的總RNA樣品按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)要求配制RT反應(yīng)液。用于實(shí)時(shí)熒光定量的RT產(chǎn)物(cDNA)于-20 ℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

上述cDNA用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)基因根據(jù)GenBank上豬的HIF-1α、VEGF、EPO以及GAPDH、18S、β-actin序列，采用Primer Express Software設(shè)計(jì)引物。引物由生工生物公司合成(表1)。采用Eva GreenⅠ染料法，反應(yīng)在Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR Systems上進(jìn)行。反應(yīng)體系為20 μL：SsoFastTM EvaGREEN?Supermix 10 μL(BIO-RAD，美國(guó))，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，加滅菌去離子水至20 μL。樣品分裝于96孔板(BIO-RAD)中，透光蓋(BIO-RAD)蓋緊。HIF-1α反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。VEGF與HIF-1α反應(yīng)條件相同。EPO反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 RT-qPCR引物信息

Table 1 Information of primers used for RT-qPCR

基因Gene引物(5'→3')Primersequence引物長(zhǎng)度/bpLength產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductlengthGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.HIF-1αF-TAGAACATGATGGGTCACR-ACAGGCTAAGTCAGAGGG1818176EF070345VEGFF-GCTACTGCCGTCCAATCR-CACACTCCAGACCTTCG1717135AF318502EPOF-TGCTTCTGCTGTCCTTGCR-GCCCATCGTGGCATTTTCG1819134NM_214134GAPDHF-ACATCAAGAAGGTGGTGAAGR-ATTGTCGTACCAGGAAATGAG2020179NM_001206359.1β-actinF-TCTGGCACCACACCTTCTR-TGATCTGGGTCATCTTCTCAC1821114XM_003124280.218SF-GAGCGAAAGCATTTGCCAAGR-GGCATCGTTTATGGTCGGAAC2021101AY265350

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有組織低氧適應(yīng)基因的表達(dá)量均是以GAPDH、18S、β-actin為內(nèi)參基因，最終以相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示，相對(duì)熒光定量計(jì)算方法采用M.W.Pfaffl[17]的方法。所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行整理，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)烏金豬和約大烏豬生理表征參數(shù)測(cè)定結(jié)果采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用”平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，各組織間的基因表達(dá)采用Duncan法進(jìn)行多重比較；兩品種間的統(tǒng)計(jì)采用DYES進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的提取

由圖1可知，本研究所提取RNA的28S條帶的亮度大于18S，5S條帶很淡，表明RNA完整性好，無(wú)明顯降解。經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，所提取RNA的A260 nm/A280 nm為 1.8～2.0，可用于后續(xù)研究(圖1)。

2.2 相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

圖2為HIF-1α、VEGF、EPO熒光定量PCR產(chǎn)物2%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖3為HIF-1α、VEGF和EPOcDNA通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量所得熔解曲線。如圖3所示熔解曲線為單一峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

圖1 總RNA提取電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis result of total RNA

1.HIF-1α；2.VEGF；3.EPO圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)HIF-1α、VEGF、EPOFig.2 Agarose gel of the HIF-1α，VEGF and EPO

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物熔解曲線HIF-1α(a)、VEGF(b)、EPO(c)、GAPDH(d)Fig.3 Melting curve analysis for HIF-1α(a)，VEGF(b)，EPO(c)，GAPDH(d)

2.3 血液生理表征參數(shù)測(cè)定結(jié)果

烏金豬與約大烏豬的HGB、HCT、RBC、MCH、MCHC、氧飽和度檢測(cè)結(jié)果如表2所示，烏金豬血液HGB和RBC極顯著高于約大烏豬(P<0.01)，HCT、MCH、MCHC和氧飽和度兩豬種間差異不顯著(P>0.05)。

表2 烏金豬與約大烏豬血液生理表征參數(shù)測(cè)定結(jié)果

Table 2 The results of blood physiological parameters measurement

類(lèi)別Class約大烏豬Yuedawupig烏金豬Wujinpig血紅蛋白含量/(g·L-1)HGB117.500±6.868**128.530±8.047紅細(xì)胞數(shù)目/(1012·L-1)RBC7.199±0.627**7.903±0.502紅細(xì)胞壓積/(L·L-1)HCT0.461±0.0290.424±0.033平均血紅蛋白含量/pgMCH16.290±1.06616.040±0.788平均血紅蛋白濃度/(g·L-1)MCHC277.600±11.150278.750±10.208氧飽和度/(vol·dL-1)Oxygensaturation91.950±3.26893.950±4.006

**.P<0.01

2.4 不同豬種間HIF-1α、VEGF、EPOmRNA的差異表達(dá)

HIF-1α、VEGF、EPOmRNA基因在烏金豬與約大烏豬間的差異表達(dá)趨勢(shì)如圖4所示?？漳c、回腸、肌肉、睪丸、卵巢中HIF-1α 表達(dá)量烏金豬高于約大烏豬，十二指腸、睪丸和空腸中VEGF表達(dá)量烏金豬高于約大烏豬，EPOmRNA的表達(dá)各組織均為約大烏豬高于烏金豬。

烏金豬與約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)到HIF-1α mRNA的存在(圖4a)。在約大烏豬各組織中，HIF-1α 在肝、肺、胰腺表達(dá)最高，而肌肉與回腸表達(dá)最低。烏金豬與約大烏豬的表達(dá)趨勢(shì)一致。烏金豬與約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)到VEGFmRNA的存在(圖4b)。在約大烏豬各組織中，VEGF在肝、肺、胰腺表達(dá)最高，而肌肉與回腸表達(dá)最低。烏金豬與約大烏豬的表達(dá)趨勢(shì)一致。烏金豬與約大烏豬各個(gè)組織中均用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)到EPOmRNA的存在(圖4c)。在約大烏豬各組織中，EPOmRNA表達(dá)量最高的是腎和肝，表達(dá)量最低的是十二指腸和肌肉。烏金豬與約大烏豬的表達(dá)趨勢(shì)一致。可以明顯的看出EPO在十二指腸中幾乎無(wú)表達(dá)。

2.5 公豬與母豬之間HIF-1α、VEGF、EPOmRNA的差異表達(dá)

HIF-1α、VEGF、EPOmRNA基因在烏金豬與約大烏豬的公、母豬的差異表達(dá)趨勢(shì)如圖5所示。低氧適應(yīng)基因在約大烏豬的總體表達(dá)量要顯著高于烏金豬(P<0.05)，母豬低氧適應(yīng)基因平均表達(dá)量高于公豬。除烏金豬VEGF差異顯著(P<0.05)外，其他均差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

在高原低氧生態(tài)條件下，圍繞本地烏金豬與培育豬種約大烏豬的低氧適應(yīng)性，本研究檢測(cè)了烏金豬與約大烏豬血液生理表征參數(shù)、不同組織HIF-1α、VEGF、EPO基因表達(dá)量，研究結(jié)果表明，血液生理表征參數(shù)和低氧適應(yīng)基因表達(dá)與低氧適應(yīng)能力之間密切相關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.1 高原低氧環(huán)境豬種血液生理表征參數(shù)的變化

血紅蛋白作為氧的載體，其含量與血氧親和力一直是高原動(dòng)物耐受低氧環(huán)境的研究熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，高海拔地區(qū)動(dòng)物血紅蛋白含量明顯高于低海拔地區(qū)，茍瀟報(bào)道，高原安第斯雞從4 000 m運(yùn)到海平面飼養(yǎng)兩代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血氧親和力降低[18]，證實(shí)了高海拔地區(qū)動(dòng)物獨(dú)特的血紅蛋白機(jī)制。而強(qiáng)巴央宗等研究報(bào)道藏豬的RBC、HGB和HCT指標(biāo)低于高海拔飼養(yǎng)的長(zhǎng)白豬，說(shuō)明藏豬對(duì)高原低氧反應(yīng)不敏感，低氧適應(yīng)性強(qiáng)[19]。 本研究發(fā)現(xiàn)，烏金豬的血液生理表征參數(shù)HGB和RBC極顯著高于約大烏豬，而HCT、MCH低于約大烏豬，氧飽和度高于約大烏豬，但差異不顯著。烏金豬長(zhǎng)期生活在云南高海拔地區(qū)，已形成適應(yīng)低氧獨(dú)特且穩(wěn)定的血紅蛋白機(jī)制，而約大烏豬為新培育品種，其HGB、RBC和氧飽和度低于烏金豬。本研究發(fā)現(xiàn)，烏金豬和約大烏豬血液生理表征參數(shù)存在明顯差異，結(jié)果提示，低氧生理表征參數(shù)變化與低氧適應(yīng)能力有關(guān)。

3.2 烏金豬與約大烏豬不同組織中低氧適應(yīng)基因表達(dá)的特異性

本研究檢測(cè)了肝、腎、肺、胰腺、心、肌肉、皮膚、睪丸、卵巢、十二指腸、空腸和回腸12種組織HIF-1α、VEGF、EPO基因表達(dá)量，結(jié)果表明，烏金豬與約大烏豬不同組織低氧適應(yīng)基因表達(dá)譜存在明顯差異，結(jié)果顯示與高原低氧適應(yīng)性密切相關(guān)。

*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below圖4 約大烏豬與烏金豬HIF-1α(a)、VEGF(b)和EPO(c)基因在各組織的表達(dá)Fig.4 Relative gene expression of HIF-1α(a)，VEGF(b) and EPO(c) in tissues in Yuedawu pigs and Wujin pigs

圖5 約大烏豬與烏金豬的公、母豬HIF-1α(a)、VEGF(b)和EPO(c)基因的平均表達(dá)量Fig.5 Relative gene expression of HIF-1α(a)，VEGF(b) and EPO(c) in tissues of female and male in Yuedawu pigs and Wujin pigs

肝HIF-1α和VEGF基因表達(dá)最高，而EPO表達(dá)也相對(duì)較高，這表明肝與低氧適應(yīng)基因密切相關(guān)。趙同標(biāo)等采用Northem雜交技術(shù)，檢測(cè)了HIF-1αmRNA在高原鼠兔多種組織中均有表達(dá)，其中腦的表達(dá)量最高，其次為腎，而心、脾和肝的表達(dá)相對(duì)較低[20]。這與本試驗(yàn)的結(jié)果不完全一致，可能是與高原低氧特殊的生態(tài)環(huán)境及不同動(dòng)物，豬種健康狀況相關(guān)。L.Tacchini等體外試驗(yàn)證實(shí)，肝內(nèi)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子能激活 HIF-1α基因[21]。S.Anavi等報(bào)道，常氧環(huán)境下，肝內(nèi)的膽固醇可激活HIF信號(hào)通路[22]。云南本地豬與培育豬種長(zhǎng)期處于高原低氧生態(tài)環(huán)境中，低氧應(yīng)激可能使豬的肝發(fā)生適應(yīng)變化，從而誘導(dǎo)肝低氧適應(yīng)基因表達(dá)升高，這一推測(cè)有待研究證實(shí)。

在肺中，HIF-1α和VEGF基因表達(dá)相對(duì)較高，與其他組織相比差異極顯著。血紅蛋白是從肺攜帶氧經(jīng)由動(dòng)脈血運(yùn)送給機(jī)體各組織，而氧氣的供應(yīng)及血紅蛋白運(yùn)輸氧氣的能力與低氧適應(yīng)基因直接相關(guān)，這與茍瀟研究的藏雞胚胎低氧適應(yīng)的血紅蛋白分子機(jī)制是相一致的[18]。Y.Liang等與A.Abbasi等的研究也證實(shí)了高原鳥(niǎo)類(lèi)血紅蛋白有高的血氧親和力[23-24]。胰腺內(nèi)胰島分泌胰島素，調(diào)節(jié)糖代謝。鄒多宏等報(bào)道，HIF-1α可激活的下游因子包括一些糖代謝相關(guān)酶，糖酵解酶等[25]。低氧條件下，上調(diào)CD147是通過(guò)HIF-1α與Sp1共同加速糖酵解及腫瘤的進(jìn)程達(dá)到的[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧適應(yīng)基因在胰腺中表達(dá)很高，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，對(duì)低氧適應(yīng)基因在胰腺中的高表達(dá)及其作用機(jī)制值得研究。

在腎中，HIF-1α和VEGF均有表達(dá)，而EPO表達(dá)最高，與其他組織相比差異極顯著，這與E.D.Zanjani等研究結(jié)果一致[27]。腎對(duì)氧供給和氧張力的變化較敏感，很容易受到缺氧性損傷。相關(guān)報(bào)道也證實(shí)EPO在胎兒時(shí)期由肝分泌，成體主要由腎分泌。EPO是調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的多肽類(lèi)激素，在氧氣稀薄的高原，EPO可以通過(guò)促進(jìn)紅細(xì)胞生成緩解因所吸入空氣氧濃度低而導(dǎo)致的慢性缺氧損傷。N.S.Patel等報(bào)道，在缺血再灌注損傷時(shí)，每日給予EPO治療，可保護(hù)腎[28]。 在皮膚中，烏金豬和約大烏豬HIF-1α基因表達(dá)相對(duì)較高，推測(cè)可能有利于豬增強(qiáng)皮膚表面低氧適應(yīng)能力。小腸不僅是動(dòng)物飼料養(yǎng)分消化吸收和代謝的主要場(chǎng)所，也是機(jī)體重要的低氧適應(yīng)器官。本研究表明，低氧適應(yīng)基因在十二指腸、空腸和回腸中表達(dá)量有一定的差異。關(guān)于高原豬種腸道組織與低氧適應(yīng)基因及其養(yǎng)分消化吸收之間的關(guān)系仍需研究。

本研究顯示，低氧適應(yīng)基因在肌肉和心等器官中表達(dá)相對(duì)較低。但心是高原豬種和高原低氧適應(yīng)基因的重要器官，心與氧氣含量及血紅蛋白數(shù)量密切相關(guān)，推測(cè)其與低氧適應(yīng)基因也有一定關(guān)系，需進(jìn)一步研究。

3.3 低氧適應(yīng)基因?qū)ωi品種與性別的表達(dá)差異

在高原低氧環(huán)境條件下，豬品種和性別是影響低氧適應(yīng)基因表達(dá)的重要因素，從而可能改變豬的低氧適應(yīng)能力和生產(chǎn)性能。

本研究表明，約大烏豬有9個(gè)組織HIF-1α和VEGF基因表達(dá)高于烏金豬，而全部組織的EPO基因表達(dá)均為約大烏豬高于烏金豬。由此推測(cè)，由于烏金豬長(zhǎng)期生長(zhǎng)于高原地區(qū)可能已具有穩(wěn)定的低氧環(huán)境適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。約大烏豬是新培育的含烏金豬血緣的生產(chǎn)豬種，推測(cè)是由于機(jī)體尚未形成穩(wěn)定的低氧適應(yīng)機(jī)制，所以在高原低氧環(huán)境下通過(guò)上調(diào)低氧適應(yīng)基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)低氧環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，利用現(xiàn)代遺傳育種理論和技術(shù)，經(jīng)過(guò)多代選育而成的具有本地烏金豬血緣的約大烏豬不僅提高了生長(zhǎng)速度和瘦肉率，其低氧適應(yīng)性也發(fā)生了顯著變化，結(jié)果與豬的低氧適應(yīng)能力密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF、EPO基因在約大烏豬與烏金豬的各個(gè)組織中均是母豬明顯高于公豬。提示，在云南高原低氧的情況下，由于母豬的生產(chǎn)繁殖特性相對(duì)于公豬較為復(fù)雜，母豬的低氧應(yīng)激反應(yīng)可能大于公豬，母豬相對(duì)于公豬更容易受到高原低氧的應(yīng)激。因此，高原低氧環(huán)境應(yīng)激與母豬特有繁殖生理及其低氧適應(yīng)性可能形成新的研究領(lǐng)域。

4 結(jié) 論

綜上，在云南高原低氧的復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中，烏金豬低氧適應(yīng)生理表征參數(shù)明顯高于約大烏豬；多數(shù)組織約大烏豬低氧適應(yīng)基因的表達(dá)量高于烏金豬，低氧適應(yīng)基因在約大烏豬與烏金豬的表達(dá)具有組織差異性與品種特異性；母豬低氧適應(yīng)基因的表達(dá)量明顯高于公豬。低氧適應(yīng)基因表達(dá)差異與豬低氧適應(yīng)能力之間的內(nèi)在聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。

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(編輯 郭云雁)

The Study of Hypoxia Adaptive Differences of Yunnan Wujin and Yuedawu Pigs

LI Mei-quan，ZHANG Chun-yong，AN Qing-cong，PAN Hong-bin，CHEN Ke-lin，GUO Rong-fu*

(KeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeedScienceofYunnanProvince，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

This study aimed to ascertain the differences of hypoxia adaptation between Yunnan plateau Wujin pig and Yuedawu pig.Blood samples of 30 Wujin pigs and 30 Yuedawu pigs were collected(Half male and female)on 60 days.The blood HGB，HCT，RBC，MCH，MCHC and oxygen saturation were determined.The gene expressions ofHIF-1α ，VEGFandEPOwere determined by real-time PCR in heart，liver，lung，kidney，jejunum，ileum，duodenum，skin，muscle，pancreas，testes and ovaries of Yuedawu and Wujin pigs(half male and female).The results showed that HGB and RBC of Wujin pigs was significant higher than that of Yuedawu pigs(P<0.01)，and hematocrit (HCT) and MCH was lower than Yuedawu pigs.Oxygen saturation of Wujin pigs was higher than that of Yuedawu pigs，without significant differences(P>0.05).HIF-1α，VEGF，EPOmRNA were detected in various tissues of Yuedawu and Wujin pigs.The gene expressions ofHIF-1α，VEGFandEPOin most tissues of Yuedawu pigs were higher than that in Wujin pigs，and main expression tissues forHIF-1α andVEGFwere liver，lungs and pancreas in 2 pig breeds，whereasEPOwas mainly expressed in kidney and liver，the trends ofHIF-1α，VEGFandEPOgenes expression in 2 pig breeds is consistent.In 2 pig breeds，the hypoxia adaptation gene expressions of sows were significantly higher than that of boar.The HGB，RBC and oxygen saturation of Wujin pigs was significantly higher than that of Yuedawu pigs.Physiological characterization parameters of hypoxia adaptation of Wujin pig were significantly higher than Yuedawu pig.Hypoxia adaptation gene expression in most tissues of Yuedawu pig were higher than that in Wujin pig.But the mechanisms of hypoxia adaptation need to be researched in the further.

Wujin pigs；Yuedawu pigs；HIF-1α；VEGF；EPO；gene expression

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.06.012

2014-07-28

云南省重大科技專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZA018)；云南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(A3007381)

李美荃(1986-)，女，黑龍江哈爾濱人，博士生，主要從事豬抗病營(yíng)養(yǎng)的分子基礎(chǔ)研究，E-mail：limeiquan2010@163.com；張春勇(1975-)，男，碩士，講師，主要從事豬抗病營(yíng)養(yǎng)的分子基礎(chǔ)研究。二者并列為第一作者

*通信作者：郭榮富，博士，教授，博導(dǎo)，E-mail：rongfug@163.com

S828；S813.3

A

0366-6964(2015)06-0965-09