曼氏無針烏賊墨汁黑色素的提取工藝研究

周月越， 王春琳， 母昌考， 李榮華， 宋微微

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

曼氏無針烏賊墨汁黑色素的提取工藝研究

周月越， 王春琳， 母昌考， 李榮華， 宋微微

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室， 浙江 寧波 315211)

曼氏無針烏賊墨汁的主要成分是黑色素、蛋白質(zhì)及灰分。使用酶解法去除雜質(zhì)，獲得高純度墨汁黑色素。通過對堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的水解效果進行比較，挑選出水解效果最好的蛋白酶。通過單因素實驗，比較不同pH值、溫度、加酶量、水解時間，對黑色素提取的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化黑色素的提取工藝。實驗結(jié)果表明，高純度的黑色素可以用1.5%堿性蛋白酶在溫度為50℃，pH值10.5和底物濃度為2%的條件下酶解4 h獲得。

曼氏無針烏賊；黑色素；酶解法；提取工藝

自然界中的黑色素包括褐色素和真黑色素兩大類，褐色素是由苯并噻嗪和苯并噻唑形成的聚合物，真黑色素是由兩種基本結(jié)構(gòu)單元(5，6-二羥基吲哚和5，6-二羥基-2-吲哚羧酸)形成的多聚物[1]。天然黑色素具有許多特殊的生物活性，黑色素具有抗紫外輻射作用[2-4]， DNA光保護作用[5-6]，黑色素還具有抗脂質(zhì)過氧化、清除超氧化物自由基、螯合金屬離子的能力[7-11]。天然黑色素具有特殊的生物活性且健康安全，已在美黑化妝品、天然染發(fā)劑、食品添加劑方面有一定應(yīng)用。此外，黑色素還在醫(yī)藥及仿生材料領(lǐng)域得到一定的應(yīng)用。由于黑色素具有抗輻射的作用，黑色素覆蓋的納米顆粒用來保護癌癥放療中的骨髓細胞[12]，黑色素還被制成納米藥物載體，用于腸道炎癥的治療[13]，黑色素還與TiO2合成納米仿生材料[14]。為進一步開發(fā)黑色素產(chǎn)品使之獲得更好的應(yīng)用，獲得高純度的天然黑色顯得十分重要。

曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni，Rochebrune)俗稱墨斗魚、墨魚，屬于軟體動物門、頭足綱、十腕目、烏賊科，是中國近海廣布性種[15]。曼氏無針烏賊墨汁為海產(chǎn)品加工過程中的廢棄物，中醫(yī)中把它作為一種止血劑使用[16]，它的墨汁約為總體重的1.28%[17]，是開發(fā)保健黑色素產(chǎn)品的價廉質(zhì)高的原料。曼氏無針烏賊墨汁黑色素(the melanin ofSepiellamaindroniink ,MSMI)屬于真黑色素，它與少量蛋白及金屬離子結(jié)合形成黑色不溶于水的球狀小顆粒[18-19]，故要獲得高純度的MSMI，主要是要去掉蛋白質(zhì)和灰分。提取和制備方法的不同對MSMI的結(jié)構(gòu)和生物活性會造成不同的影響，本實驗采取的酶解法能較好去除蛋白質(zhì)，保持黑色素顆粒的完整性，對于研究黑色素的生物活性來說，是一種比較理想的方法[20-22]。

1 材料與方法

1.1 材料

曼氏無針烏賊從福建省霞浦縣菜市場購得，胴長在9.2～15.7 cm之間，平均胴長10.9 cm，體重范圍97.0～231.7 g，平均體重133.7 g。

1.2 試劑與儀器

中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶(solarbio)，Biofuge Primo R臺式離心機(Thermo)，UV-2201 型紫外可見分光光度計(Shimadzu)，F(xiàn)ree Zone 4.5 臺式冷凍干燥機( Labconco)。

1.3 試驗方法

1.3.1 MSMI粗品的制備

取曼氏無針烏賊墨囊80只，擠壓沖洗墨囊獲得墨汁，3層紗布過濾防止破碎組織混入，8000 r/min離心10 min后，上清液移除，沉淀冷凍干燥，獲得MSMI粗品。

1.3.2 測定MSMI的紫外-可見吸收光譜

在6 mL 2% NaOH溶液中加入黑色素粉末0.4 mg，磁力攪拌使之完全溶解，進行紫外-可見光譜分析，確定MSMI的特征吸收波長。待測波長范圍為190～790 nm，采樣間隔0.5 nm，觀察特征吸收峰。

1.3.3 酶制劑的篩選

以MSMI粗品為原料，底物濃度2%(w/v)，用2%(質(zhì)量比)堿性蛋白酶，中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶，在各自最適宜溫度和pH下水解8 h，6000 r/min離心10 min，去上清液，離心6次。冷凍干燥后，溶于2%的NaOH溶液。比較黑色素堿性溶液在特征吸收峰處的吸光值大小，從而判斷出哪種蛋白酶提取效果最好。

1.3.4 單因素實驗和正交實驗

通過單因素實驗，比較加酶量、水解時間、pH值、反應(yīng)溫度對MSMI提取的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行4因素3水平的正交實驗，實驗按L9(34)正交表設(shè)計，進一步優(yōu)化MSMI的提取工藝參數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

分析MSMI紫外-可見光譜圖，找到MSMI的特征吸收峰。由于吸光值與物質(zhì)的量的濃度成正比，MSMI濃度越高，相應(yīng)的吸光值也大，故特征峰處的吸光值可以作為衡量MSMI含量的相對指標。

正交試驗用極差分析法進行數(shù)據(jù)分析。計算Ki和ki(i=1,2,3), K1為水平1的3次指標值之和，K2為水平2的3次指標值之和，K3為水平3的3次指標值之和，ki=Ki/3。計算極差R，R=kimax-kimin。根據(jù)極差R的大小，得到因素的主次順序，R越大，表示該因素的水平變化對實驗的影響越大，因此在實驗中這個因素就越重要，反之，R越小，這個因素就越不重要。最后根據(jù)因素的主次順序選出最優(yōu)的水平組合。

2 結(jié)果

2.1 MSMI的紫外可見光譜分析

對MSMI進行紫外-可見光譜掃描(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)在222.5 nm處有一個特征吸收峰，在可見光區(qū)域的吸光度隨著波長的變長而逐漸變小，這與已經(jīng)報道出的黑色素紫外可見光譜類似。宋茹等[23]用酶解法制備的魷魚黑色素在220 nm 附近有特征吸收峰，而可見光區(qū)域的吸光度隨著波長的變長而逐漸降低。李興旺等[24]采用酸解法制備的魷魚墨黑色素在可見光區(qū)域也未見明顯吸收峰，在紫外光區(qū)域(200～400 nm)存在2個吸收峰，其中一個強吸收峰約在215 nm 處。李曉等[29]用酶解法制備的金烏賊墨黑色素在紫外光區(qū)域( 190～ 400 nm )和可見光區(qū)域中，各存在一個明顯吸收峰( 206和557 nm )，其中在約206 nm處有較大吸收，與本實驗結(jié)果接近。由于吸光值與物質(zhì)的量的濃度成正比，MSMI濃度越高，相應(yīng)的吸光值也大，故本實驗以MSMI在222.5 nm的吸光值作為判斷MSMI含量的相對指標。

圖1 MSMI的紫外-可見光譜圖

2.2 選擇提取MSMI所用蛋白酶

以MSMI粗品為原料，將6種蛋白酶即堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的水解效果進行比較(如表1)。各種蛋白酶水解后，比較它們在222.5 nm處的吸光值(如圖2所示)，堿性蛋白酶相比其他5種酶的吸光值明顯較高，故可將堿性蛋白酶選作提取MSMI的水解酶。

圖2 各種蛋白酶對MSMI吸光值的影響

1—胰蛋白酶； 2—胃蛋白酶; 3—木瓜蛋白酶; 4—中性蛋白酶; 5—酸性蛋白酶; 6—堿性蛋白酶。

表1 各蛋白酶的酶解條件

2.3 MSMI 提取的單因素實驗

2.3.1 pH值對MSMI提取的影響

在溫度為45℃，加酶量2%，水解時間8 h，選擇不同pH值8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5和11.0進行試驗，探討pH值對MSMI提取的影響(如圖3)，根據(jù)圖3可知pH值在8.0到10.0之間，MSMI的吸光值隨著pH值的增加而增加，當pH值達10.0時，MSMI的吸光值達到最大，pH值繼續(xù)變大，吸光值隨著下降。

圖3 pH值對MSMI吸光值的影響

2.3.2 反應(yīng)溫度對MSMI提取的影響

在pH值為10.0，加酶量2%，水解時間8 h,選擇不同溫度35℃、40℃、45℃、50℃和55℃進行試驗，探討溫度對MSMI提取的影響(如圖4)，根據(jù)圖4可知溫度在35℃到50℃之間，隨著溫度的增加MSMI的吸光值也增加，在溫度為50℃時，MSMI的吸光值達到最大值，隨著溫度的繼續(xù)增高，MSMI的吸光值反而下降。

圖4 溫度對MSMI吸光值的影響

2.3.3 水解時間對MSMI提取的影響

在溫度為45℃，pH值為10.0，加酶量2%，水解時間分別為2 h、4 h、6 h和8 h進行試驗，探討水解時間對MSMI提取的影響(如圖5)，根據(jù)圖5可知4 h內(nèi)，MSMI的吸光值隨著時間的增加而增加，在4 h及大于4 h以后，吸光值幾乎不變。

圖5 反應(yīng)時間對MSMI吸光值的影響

圖6 酶用量對MSMI吸光值的影響

2.3.4 加酶量對MSMI提取的影響

在溫度為45℃，pH值為10.0，水解時間8 h的條件下，用酶量分別為0.5%、1%、2%和3%進行試驗，探討加酶量對酶解過程的影響(如圖6)，根據(jù)圖6可知加酶量在0.5%到1%之間MSMI的吸光值逐漸上升，當加酶量大于等于1%時，吸光值幾乎不變。

2.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，對堿性蛋白酶水解進行正交實驗(如表2)，以進一步優(yōu)化MSMI的提取工藝。比較4個因素(A：溫度；B：pH值；C：加酶量；D：酶解時間)的極差，結(jié)果為RA>RB>RC>RD，說明因素A即水解溫度，對MSMI提取的影響最大，其次是pH值、加酶量及酶解時間。由正交實驗結(jié)果可知，MSMI提取效果最好的組合為A3B3C2D1，即1.5 %的堿性蛋白酶在溫度為50℃、pH值10.5條件下水解4 h后MSMI提取效果最好，吸光值達到4.2672。

表2 L9(34)正交實驗設(shè)計與結(jié)果

將未經(jīng)蛋白酶水解制得的MSMI與最佳提取條件下提取的MSMI進行對比，進行驗證實驗，結(jié)果如表3所示。由表3可知，與未經(jīng)蛋白酶水解制得的MSMI相比，最佳工藝條件下提取的MSMI在222.5 nm處的吸光值明顯提高。

表3 提取工藝條件驗證

3 討論

目前提取黑色素的方法分為3種：高速離心法、酸解法及酶解法。Liu等[25]用高速離心法的方法從烏賊墨中提取了黑色素，此法操作簡單且能較好保持黑色素原有的結(jié)構(gòu)和生物活性，但與之結(jié)合的蛋白不能完全去除。Magarelli等[26]利用酸解法提取黑色素，得到的黑色素純度高且去除了結(jié)合蛋白及大部分的金屬離子，但酸解法可使真黑色素脫羧基，所以酸解法對于提取有生物活性的黑色素來說并不是一個特別好的方法[27]。Birbeck等[28]用木瓜蛋白酶從頭發(fā)中提取了黑色素，李和生[29-30]等用酶解法從金烏賊的墨汁中提取了高純度的黑色素并對其生物活性進行研究，發(fā)現(xiàn)烏賊墨對大腸桿菌具有很好的防紫外線作用，并能很好抑制大鼠自發(fā)性脂質(zhì)過氧化。李欣[31]等通過雙酶水解法提取烏骨雞的黑色素，它能夠使D-半乳糖衰老模型小鼠血和肝臟中GSH-Px 活力顯著升高，MDA 水平顯著降低，說明黑色素在體內(nèi)具有顯著的抗氧化作用。總的來說，我們選取的酶解法能較好去除蛋白質(zhì)，保持黑色素顆粒的完整性，對于研究黑色素的生物活性來說，是一種比較理想的方法。

本文研究了酶解法提取曼氏無針烏賊墨汁黑色素，高純度的黑色素可以用1.5%堿性蛋白酶在溫度為50℃，pH值為10.5和底物濃度為2%的條件下酶解4 h獲得，它為曼氏無針烏賊黑色素資源的開發(fā)利用提供參考。

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Research on the extraction method of the melanin fromSepiellamaindroniink

ZHOU Yue-yue, WANG Chun-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua, SONG Wei-wei

(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education,School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The main component ofSepiellamaindroniink is melanin, protein and ash. Highly purified melanin was extracted by enzyme decomposition method. On the basic of analyzing and comparing 6 proteases, including alcalase, dispase, acid proteinase, pepsin, papain and trypsin, the protease with the best hydrolytic result was picked out. By single-factor experiments, the effects of pH, temperature, time and enzyme concentration on the hydrolysis were studied. On that basis, orthogonal design was used to optimize the extractive craft. The experimental results showed that highly purified melanin can be obtained under the condition that 1.5% alcalase was added for 4 h in the condition of 50℃, pH10.5 and substrate concentration of 2%.

Sepiellamaindroni; melanin; enzymolysis; extraction process

2014-08-06；

2014-09-08

國家自然科學(xué)基金項目(41206114，41176124)；浙江省自然科學(xué)基金項目(LQ12C19002)；浙江省自然科學(xué)基金重點項目(Z3110482)；教育部博士點基金資助(20103305110003)

周月越，碩士研究生，E-mail：zhouyueyue2012@126.com；

宋微微，講師，研究方向為曼氏無針烏賊養(yǎng)殖及其副產(chǎn)品開發(fā)，E-mail：songweiwei@nbu.edu.cn。

TS254.9

A

2095-1736(2015)01-0028-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2015.02.028