吳茱萸堿對(duì)大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白表達(dá)的影響*

陜西中醫(yī)學(xué)院免疫及檢驗(yàn)學(xué)教研室(咸陽(yáng)712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

·論著·基礎(chǔ)研究·

吳茱萸堿對(duì)大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白表達(dá)的影響*

陜西中醫(yī)學(xué)院免疫及檢驗(yàn)學(xué)教研室(咸陽(yáng)712046)

施京紅 王 萍 胥 冰 張麗君 丁 輝△

目的：研究吳茱萸堿(Evo)對(duì)大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達(dá)水平的影響。方法：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，分為對(duì)照組、Evo 4mg/kg組、40 mg/kg組。Evo灌胃25d后取材；采用免疫組織化學(xué)和蛋白免疫印跡的方法，觀(guān)察Evo對(duì)下丘腦弓狀核中NPY免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)和NPY蛋白水平的影響。結(jié)果：吳茱萸堿40 mg/kg干預(yù)后，下丘腦弓狀核NPY-IR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少，同時(shí)NPY蛋白表達(dá)水平顯著降低。結(jié)論：Evo可顯著降低大鼠下丘腦弓狀核促食欲肽NPY蛋白水平，提示下丘腦可能是Evo調(diào)節(jié)攝食行為的重要中樞。

吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從蕓香科植物吳茱萸的干燥近成熟果實(shí)中提取的一種主要生物堿成分，具有多種藥理學(xué)效應(yīng)，如降低體重、調(diào)節(jié)體溫、抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛及對(duì)心血管和內(nèi)分泌系統(tǒng)的作用[1-4]。下丘腦及其回路在調(diào)制與攝食有關(guān)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)信號(hào)中起著重要作用，是調(diào)節(jié)攝食和能量代謝的主要中樞。弓狀核(The arcuate nucleus，ARC)是下丘腦中調(diào)控?cái)z食與體重的重要核團(tuán)，包含促進(jìn)攝食反應(yīng)和誘導(dǎo)厭食反應(yīng)的神經(jīng)元功能區(qū)。NPY釋放的階段性升高和降低與食欲的啟動(dòng)與終止有關(guān)。我們前期研究表明，Evo能降低下丘腦促食欲肽NPY mRNA的表達(dá)，但是，Evo是否影響下丘腦ARC中NPY蛋白水平的表達(dá)尚不清楚。我們推測(cè)下丘腦可能是Evo發(fā)揮降低體重作用的主要中樞位點(diǎn)。本研究采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry)和蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法，觀(guān)察Evo對(duì)下丘腦弓狀核中NPY免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)和NPY蛋白水平的影響。

材料與方法

1 試 劑 Evo購(gòu)自陜西匯生醫(yī)藥科技有限公司，純度99.24%，用雙蒸水配制成混懸液。①免疫組化實(shí)驗(yàn)試劑：10%小牛血清，武漢博士德生物公司；兔抗大鼠NPY多克隆抗體(bs-0071R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司；②Western Blotting實(shí)驗(yàn)試劑：兔抗大鼠NPY多克隆抗體，Chemicon，AB9608，USA；小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體，武漢博士德生物技術(shù)公司；山羊抗兔IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司；山羊抗小鼠IgG(H&L)二抗(HRP)，武漢博士德生物技術(shù)公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 1 動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)操作：選用雄性5周齡Sprague-Dawly大鼠36只，初始體重60～80g。動(dòng)物房溫度20～22°C，光暗周期為12∶12 h(8：00-20：00)，自由飲食。大鼠被隨機(jī)分為三組：每組12只。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件及實(shí)驗(yàn)操作1周后，于上午10：00灌胃。大、小劑量組分別以Evo 40 mg/kg、4 mg/kg劑量灌胃，對(duì)照組灌以雙蒸水。按1 ml/100g溶液體積根據(jù)大鼠體重灌胃，速度為1 ml/5 s，1次/d，共灌胃25 d。動(dòng)物處死取材在上午10:00-12:00進(jìn)行。大鼠進(jìn)行完前述實(shí)驗(yàn)后，在烏拉坦麻醉下(1.2 g/kg, 腹腔注射)取材。

2.1.1 NPY的免疫組織化學(xué)染色：開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，先以0.0l mol/L PBS(pH 7.4)100 ml快速灌注沖去血液，繼之以含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB(pH 7.4)灌注固定液250 ml快速灌注固定，然后再以同樣的灌注固定液250 ml緩慢滴注，持續(xù)l .5～2 h。灌注完畢后開(kāi)顱取腦組織，并將所取的腦組織置于上述新鮮固定液中后固定4 h(4℃)，然后將腦組織移入含25%蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中(4℃)過(guò)夜。待腦組織在蔗糖中完全沉底后，石蠟包埋。

2.1.2 Western Blotting檢測(cè)：開(kāi)顱骨取腦，在冰生理鹽水中沖洗并在解剖顯微鏡下切取雙測(cè)下丘腦ARC，迅速投入液氮中。將所取組織凍存于-80℃冰箱，以備檢測(cè)。

2.2 NPY的免疫組織化學(xué)染色：取各組大鼠腦組織在石蠟切片機(jī)上冠狀切取下丘腦含弓狀核腦區(qū)，片厚7 μm，按照切片順序隔2張取1張，切片分三組收集于含0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的碟子中備用，每組通常包含16～18張腦組織切片。取第一套切片，按SP法免疫組化檢測(cè)試劑盒的使用流程進(jìn)行NPY的免疫組織化學(xué)染色。取第二套切片進(jìn)行Nissl染色。以便對(duì)照觀(guān)察免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記的神經(jīng)元的位置。取第三套組腦組織切片，省略或用正常兔血清替代兔抗大鼠NPY抗體，后續(xù)步驟同前，進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有陽(yáng)性結(jié)果被檢測(cè)。圖像信號(hào)采集分析系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行觀(guān)察，NPY陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色，正常胞核蘇木素復(fù)染后呈藍(lán)色(圖1)。為了防止計(jì)數(shù)的假陽(yáng)性及重復(fù)計(jì)數(shù)，只有那些具有足夠亮度且能觀(guān)察到胞體的神經(jīng)元才被記錄。而不能清楚分辨的神經(jīng)元?jiǎng)t一律舍棄不計(jì)。因此，NPY免疫陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)僅代表最少數(shù)量的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元。

2.3 Western Blotting檢測(cè)：取出待測(cè)組織，每個(gè)樣品取20 mg左右，按20 mg/ml比例加入RIPA蛋白裂解液，同時(shí)添加Proteinase inhibitor cocktail(終濃度為40 μl/ml)和STI(終濃度為0.1 mg/ml)，得到組織樣本的總蛋白，儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆茫蛴糜诤康臏y(cè)定。使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每泳道加樣量均為30 μg，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，二抗孵育后，ECL發(fā)光并且X膠片曝光。全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)X膠片進(jìn)行掃描分析并拍照，蛋白相對(duì)表達(dá)量用光密度表示，以GAPDH一抗作為參照來(lái)糾正加樣誤差。

結(jié) 果

1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在研究的三組動(dòng)物中，均可在下丘腦弓狀核內(nèi)觀(guān)察到呈現(xiàn)棕黃色的NPY免疫陽(yáng)性的產(chǎn)物分布，主要在神經(jīng)元胞漿中，并且該免疫陽(yáng)性的神經(jīng)元主要呈圓形，部分為不規(guī)則形狀，直徑大約15～20 μm(圖1)。Evo 40 mg/kg干預(yù)后，下丘腦弓狀核NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比顯著減少(P= 0.001)，Evo 4 mg/kg干預(yù)后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)(圖2)。

圖1 免疫組化染色結(jié)果顯示不同處理組下丘腦弓狀核內(nèi)NPY免疫陽(yáng)性的表達(dá)(NPY免疫陽(yáng)性的產(chǎn)物分布在A(yíng)RC內(nèi)的神經(jīng)元的胞漿，呈棕黃色，多數(shù)為圓形，部分為不規(guī)則形。其中，A為下丘腦ARC的Nissl染色圖；B、C和D分別為對(duì)照組、Evo 4 mg/kg干預(yù)組和Evo 40 mg/kg干預(yù)組ARC內(nèi)的NPY免疫組化染色的高倍放大圖。標(biāo)尺：A = 400μm，B、C、D = 50 μm)

2 Western Blotting結(jié)果 應(yīng)用Western Blotting方法檢測(cè)了下丘腦弓狀核促攝食肽NPY的表達(dá)(圖3)。Evo 40 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對(duì)照組相比顯著降低(P< 0.05)；Evo 4 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對(duì)照組相比無(wú)顯著變化(P> 0.05)(圖4)。

圖2 Evo 40 mg/kg干預(yù)大鼠后，下丘腦弓狀核NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組(***P=0.001)；Evo4mg/kg干預(yù)后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

圖3 各組NPY免疫印跡條帶[1：對(duì)照組；2：Evo 4 mg/kg處理組；3：Evo 40 mg/kg處理組。用藥組隨著用藥量的增大，NPY的表達(dá)量逐漸降低。NPY Mol wt: 8 kDa(NPY抗體是以Ncbi 數(shù)據(jù)庫(kù)中NPY-97個(gè)氨基酸序列為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的，包含前信號(hào)肽，抗原結(jié)合位點(diǎn)是：P-G-D-E-A-P-A-E-D-M-A-R-Y)，內(nèi)參GAPDH：36 kDa]

圖4 Evo對(duì)下丘腦ARC中NPY蛋白水平的影響 (Evo 40 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Evo 4 mg/kg干預(yù)后，NPY與GAPDH的光密度比率同對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)

討 論

我們的研究顯示，Evo 40 mg/kg灌胃，大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平表達(dá)與對(duì)照組相比顯著降低。前期研究結(jié)果[5-6]顯示,Evo干預(yù)后大鼠攝食量及體重顯著下降，血清Leptin水平增高，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為Evo抑制NPY蛋白水平的表達(dá)在抑制攝食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調(diào)控?cái)z食、體重的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

實(shí)驗(yàn)證明，ARC-PVN軸NPY釋放增加與攝食行為的啟動(dòng)有關(guān)，禁食時(shí)NPY增加。應(yīng)用藥理學(xué)、生理學(xué)或基因干預(yù)的方法，實(shí)驗(yàn)性降低NPY與其受體Y1、Y5的作用可以抑制食欲，說(shuō)明NPY是大腦的自然食欲發(fā)生器[7-9]。EVO通過(guò)散熱和產(chǎn)熱分散食物熱量，增加能量消耗，抑制內(nèi)臟周?chē)竞腕w重增加[10]。NPY是生理性食欲啟動(dòng)子，下丘腦NPY釋放的異常，可產(chǎn)生過(guò)食、能量消耗的降低及一系列新陳代謝性疾病。因此，針對(duì)ARC-PVN神經(jīng)軸，研究有效調(diào)控NPY的藥物，避免或減緩這些疾病的發(fā)生和發(fā)展是臨床迫在眉睫的課題。

轉(zhuǎn)基因肥胖模型中，NPY不適當(dāng)和無(wú)限制地過(guò)度表達(dá)引起肥胖，這是由于Leptin對(duì)這些神經(jīng)元的正常抑制作用缺失所導(dǎo)致，包括：①ob/ob小鼠：無(wú)生物功能Leptin；②db/db小鼠和fa/fa fatty Zucker大鼠：Leptin受體突變[11-12]。在這些模型中，NPY mRNA表達(dá)增加伴隨NPY蛋白水平在A(yíng)RC、PVN、DMH核團(tuán)中增高，結(jié)果與禁食和IDDM模型表現(xiàn)一致[13]。

在本研究中，Evo 40 mg/kg顯著下調(diào)大鼠下丘腦弓狀核NPY蛋白水平的表達(dá)，而我們的前期結(jié)果顯示Evo明顯升高血清Leptin水平，顯著抑制下丘腦NPY mRNA的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為Evo抑制NPY蛋白水平的表達(dá)在抑制攝食中發(fā)揮關(guān)鍵作用。提示NPY蛋白水平的降低在Evo調(diào)控?cái)z食、體重的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

[1] Wang T, Wang Y, Kontani Y,etal. Evodiamine improves diet-induced obesity in a UCP1-independent manner: Involvement of anti-adipogenic mechanism and ERK/MAPK signaling[J]. Endocrinology, 2008, 149:358-366.

[2] Takada Y, Kobayashi Y, Aggarwal BB. Evodiamine abolishes constitutive and inducible NF- κappaB activation by inhibiting I κappaBalpha kinase activation, thereby suppressing NF-κappaB- regulated antiapoptotic and metastatic gene expression, up-regulating apoptosis, and inhibiting invasion[J]. J Biol Chem, 2005, 280:17203-17212.

[3] Kan SF, Yu CH, Pu HF. Anti-proliferative effects of evodiamine on human prostate cancer cell lines DU145 and PC3[J]. J Cell Biochem, 2007, 101:44-56.

[4] 常金榮，王建華，鄺棗園，等. 從miRNA-17-92途徑探討小檗堿和吳茱萸堿對(duì)大腸癌HT29細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制[J]. 中藥藥理與臨床，2014, 30( 3):19-22.

[5] 施京紅，閆劍群，丁 輝. 吳茱萸堿對(duì)大鼠下丘腦弓狀核NPY mRNA的影響[J]. 陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，32(5)：68-69.

[6] 施京紅，閆劍群，丁 輝. 吳茱萸堿對(duì)大鼠體重及血清瘦素水平的影響[J]. 陜西中醫(yī)，2009，30(10)：1425-1426.

[7] Kalra SP, Dube MG, Pu S,etal. Interacting appetite-regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weight[J]. Endocr Rev, 1999, 20:68-100.

[8] Kalra SP, Kalra PS. Neuropeptide Y: A conductor of the appetite-regulating orchestra in the hypothalamus. In: Kastin AJ, editor. The handbook of biologically active peptides. Burlington, MA: Academic Press; 2006.

[9] Kalra SP, Kalra PS. NPY and cohorts in regulating appetite, obesity and metabolic syndrome: Beneficial effects of gene therapy[J]. Neuropeptides, 2004, 38:201-211.

[10] 郭 惠，楊云云，王昌利.吳茱萸堿藥理研究進(jìn)展[J].陜西中醫(yī)，2010，31(12)：1685-1686.

[11] Tartaglia LA. The leptin receptor[J]. J Biol Chem, 1997, 272:6093-6096.

[12] Iida M, Murakami T, Ishida K,etal. Phenotype-linked amino acid alteration in leptin receptor cDNA from Zucker fatty (fa/fa) rat[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 222:19-26.

[13] Stanley BG, Daniel DR, Chin AS,etal. Paraventricular nucleus injections of peptide YY and neuropeptide Y preferentially enhance carbohydrate ingestion[J]. Peptides, 1985, 6:1205-1211.

(收稿：2014-11-07)

Influence of evodiamine on the expresstion of peptide NPY in hypothalamic ARC in rats

Department of Medical Techniques, Immunology and Science of Inspection Teaching and Research Section,Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Shi Jinghong Wang Ping Xu Bin et al

Objective: To investigate the effect of evodiamine (Evo) on the expresstion of peptide NPY in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus in rats. Methods: Male Sprague-Dawley rats (5 weeks old,n=36) were randomly divided into three groups (n=12). Intragastric administration of Evo 40 mg/kg, Evo 4 mg/kg or water was infused for 25 days, once a day. We evaluated the effect of Evo on NPY peptide expression. NPY was detected by immunohistochemistry in cytoplasm of the hypothalamic ARC. The expression of peptide NPY in hypothalamic ARC was measured by Western Blotting. Results: The frequency of NPY-IR neurons of Evo 40 mg/kg was significantly smaller than control group. The expression of orexigenic peptide NPY in hypothalamic ARC of the animals treated with Evo 40 mg/kg (Ratio of light density between NPY and GAPDH) had a noticeable drop compared with the control group. Conclusion: Our results show that intragastric administration of Evo (40 mg/kg) decreased orexigenic NPY peptide level in the arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus. This is one of the most important mechanisms of Evo in the hypothalamus.

Evodiamine/pharmacology NeuropeptideY Arcuate nucleus Hypothalamus Immunohistochemistry Rats

* 陜西省教育廳課題(2010JK489)

吳茱萸堿/藥理學(xué) 神經(jīng)肽Y 弓狀核 下丘腦 免疫組織化學(xué) 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.07.001

△ 陜西省中醫(yī)醫(yī)院