5-氟尿嘧啶對人絨毛膜癌細(xì)胞株JAR作用的觀察*

武警陜西省總隊醫(yī)院(西安710054) 龐苗苗 惠建榮 安瑞芳

5-氟尿嘧啶對人絨毛膜癌細(xì)胞株JAR作用的觀察*

武警陜西省總隊醫(yī)院(西安710054) 龐苗苗 惠建榮△安瑞芳▲

目的：觀察5-氟尿嘧啶(5-Fu)對人絨癌細(xì)胞株JAR的體外作用。方法：采用MTT比色分析法，觀察20、50、100μg/L 3種劑量的5-Fu對人絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞的生長抑制情況；通過免疫組化法檢測3種濃度5-Fu作用于JAR細(xì)胞后增殖細(xì)胞核抗原Ki67的表達(dá)情況。結(jié)果：①5-Fu能抑制JAR細(xì)胞的生長，并在一定時間及濃度范圍內(nèi),表現(xiàn)出劑量依賴性,72h內(nèi)5-Fu濃度在25～100μg/L時抑制作用比較明顯；②100μg/L的5-Fu作用于JAR細(xì)胞72h后細(xì)胞抑制率達(dá)73.19%,作用后增殖細(xì)胞核抗原Ki67明顯下降。結(jié)論：①5-Fu對人絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞的生長具有抑制作用,72h內(nèi)呈劑量依賴性；②5-Fu抑制了人絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞的增殖,細(xì)胞可能被阻滯于G0及G1期。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)作為一種抗代謝類化療藥物，已經(jīng)被作為絨癌化療一線藥物。研究證實(shí)Ki67在多種實(shí)體惡性腫瘤中呈高表達(dá)，并且數(shù)值高低與宮頸癌、絨癌等婦科腫瘤的分化程度、浸潤、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[1-4]。本實(shí)驗通過觀察體外5-Fu對人絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞的抑制作用，同時通過免疫組化檢測用藥后JAR細(xì)胞核增殖抗原Ki67的表達(dá),探討5-Fu對人絨癌細(xì)胞株JAR的體外作用。

材料和方法

1 材 料 人絨癌細(xì)胞株JAR(中科院上海細(xì)胞庫)；5-Fu(美國Sigma公司)；Ki67兔抗人mAb(北京中山生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(四季青生物公司)；ABC免疫組化試劑盒(Dako公司)；日本BH-2型Olympus雙筒顯微鏡及鏡下組織攝像系統(tǒng)；紫外分析儀(北京六一儀器廠,WD-9403C型)；PM-10AD纖維攝像儀(上海醫(yī)療器械七廠)；低溫烤箱(廣州格蘭士公司)等。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：體外常規(guī)培養(yǎng)JAR細(xì)胞株,37℃,在50ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)液采用含100 ml/L(10%)胎牛血清的無菌高糖培養(yǎng)基(DMEM)。待細(xì)胞貼壁生長后用0.25%胰酶和EDTA消化液消化傳代。②MTT比色分析法：收集處于對數(shù)生長期的JAR細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,并用無菌高糖培養(yǎng)液調(diào)至細(xì)胞懸液濃度為1×105個/ml,之后取100μl,接種于96孔培養(yǎng)板中,預(yù)培養(yǎng)24h。24h后在實(shí)驗組中加入3種不同濃度的5-Fu(25,50,100μg/L),陰性對照組不加5-Fu，空白對照組只加入培養(yǎng)液,每個組設(shè)6個復(fù)孔，各組分別在加藥后72h加入5g/L四甲基偶氮唑藍(lán)，每孔20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸凈各孔培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150μl/孔振蕩溶解10min。將空白組調(diào)零,采用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔A490nm。取6孔A490nm的均數(shù)按如下公式計算細(xì)胞抑制率(IR)=(1-實(shí)驗組A值/對照組A值)×100%。同法重復(fù)做3個培養(yǎng)板,篩選出抑制作用最強(qiáng)的濃度范圍。③檢測人絨癌JAR細(xì)胞株：JAR細(xì)胞以1×105個/ml,接種于50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)(每瓶4ml),養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗組含5-Fu 100μg/L,對照組含乙醇0.05%(V/V)。繼續(xù)培養(yǎng)72h,每組各分別取5瓶,用0.25%胰酶消化、吹打,制成涂片,采用ABC免疫組化染色,封片后在顯微鏡下觀察結(jié)果,細(xì)胞核著色的是Ki67陽性細(xì)胞,細(xì)胞核呈棕黃色,或棕色網(wǎng)狀,或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕色小顆粒。計數(shù)高倍鏡下每張涂片上500個細(xì)胞內(nèi) Ki-67抗原陽性細(xì)胞數(shù),以陽性細(xì)胞百分率為標(biāo)準(zhǔn)判斷陽性結(jié)果。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有統(tǒng)計學(xué)分析在SPSS 20.0上完成,采取方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 5-Fu對JAR細(xì)胞生長的抑制作用 見附表。MTT法檢測結(jié)果顯示25～100μg/L的5-Fu能明顯抑制JAR細(xì)胞生長,在此濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。72h內(nèi)較高濃度的5-Fu顯示較強(qiáng)的抑制作用。實(shí)驗組3種濃度的5-Fu作用于JAR細(xì)胞后,最初2d細(xì)胞變化不明顯,之后細(xì)胞增殖逐漸變慢,內(nèi)有顆粒堆積,胞質(zhì)粗糙,其中部分細(xì)胞附壁能力減弱，隨之脫落死亡,碎裂成塊。以100μg/L濃度的5-Fu作用最明顯。而對照組細(xì)胞透明,附壁能力好。

附表 不同濃度的5-Fu作用72h對JAR細(xì)胞的抑制率±s)

注：與對照組比較，*P<0.01

2 5-Fu作用人絨癌細(xì)胞株JAR細(xì)胞后Ki-67抗原的表達(dá) 見圖1、圖2。實(shí)驗組100μg/L的5-Fu與JAR細(xì)胞作用72h。Ki-67抗原表達(dá)陽性率為16.9%±0.2%，而對照組為82.1%±0.2%，實(shí)驗組細(xì)胞Ki-67抗原陽性率較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

1 5-Fu對JAR細(xì)胞生長的抑制作用 噻唑籃比色實(shí)驗(MTT),是一種檢測細(xì)胞生長和存活的常用方法[5]。MTT比色法測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗組用藥濃度(25、50、100μg/L)對JAR細(xì)胞生長均有抑制作用,并且隨藥物濃度的增加,抑制作用逐漸加強(qiáng),表現(xiàn)出劑量依賴,顯微鏡觀察結(jié)果也證實(shí)了該變化。提示5-Fu

圖1 5-Fu 100μg/L 與JAR細(xì)胞作用72h,Ki-67抗原表達(dá)陰性(ABC染色×400)

圖2 對照組JAR細(xì)胞 Ki-67 抗原表達(dá)陽性(ABC染色×400)

對絨癌生長有明顯的抑制作用,這就是之所以臨床應(yīng)用5-Fu治療絨癌的原因。但只能說明此濃度范圍的作用,超出此濃度范圍的5-Fu對絨癌細(xì)胞的作用仍不能下結(jié)論,是否會產(chǎn)生耐藥等問題均為以后研究的課題；另外本研究作用時間只是72h,5-Fu對JAR細(xì)胞生長抑制是否具有時間依賴性有待以后進(jìn)一步研究。

2 5-Fu對JAR細(xì)胞增殖的影響 Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原,其功能與有絲分裂密切相關(guān),在細(xì)胞增殖中是不可缺少,但其確切機(jī)制尚不清楚。本研究采用ABC免疫組化法結(jié)果顯示,100μg/L的5-Fu作用于JAR細(xì)胞72h,Ki-67表達(dá)陽性率較對照組明顯下降,說明細(xì)胞增殖受到明顯抑制,細(xì)胞可能被阻滯于G0期及G1早期而不被染色。

綜上所述,體外5-Fu對JAR細(xì)胞的生長具有抑制作用,并在一定時間內(nèi)呈劑量依賴性；5-Fu抑制了JAR細(xì)胞的增殖,細(xì)胞可能被阻滯于G0及G1期。

[1] 陳 靜,司明遠(yuǎn).宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌中細(xì)胞周期素D1、Ki67的表達(dá)[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(21)： 417-418.

[2] 謝偉晗,韓柏貞.Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變和鱗癌組織中表達(dá)及意義[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志,2013,21(7)：33-34.

[3] 徐本群,周 瓊.CD146與Ki67在葡萄胎組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國醫(yī)藥科學(xué),2012,2 (17)：29-31.

[4] 龐志瀾,馬麗輝.子宮內(nèi)膜癌中E2F-1、Survivin和Ki-67的表達(dá)及相關(guān)性[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013,29(7)：170-174.

[5] 楊 越,張 蕾.EGFR及Ki67在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及意義[J].中國醫(yī)療前沿,2013,16(14)：10-11.

(收稿：2015-01-29)

Effects of 5-Fluorouracil on choriocarcinoma cell line JAR

Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People's Armed Police Force(Xi’an 710054)

Pang Miaomiao Hui Jianrong An Ruifang

Objective：To investigate the effects of 5-FU on cell of human choriocarcinoma cell line JAR.Methods：The inhibitory effects of three different concentration of chemotherapeutical drug 5-Fu(5-Fluorouracil) (20,50,100μg/L) on JAR strain were assessed with methylthiazolyl tetrazolium MTT colorimetric assay.The expression of nuclear proliferative antigen Ki67 in JAR cells were detected with avidin-biotin complex method, immuno-histochemical method.Results：① 5-Fu inhibited the JAR cell growth in a dose-dependent manner . This effect was obvious at 25～100μg/L in 72h.② When the JAR cells were exposed to 100μg/L 5-Fu for 72h, the expression of Ki67 antigen was declined significantly,the inhibition rate was 73.19%. Conclusion：① 5-Fu inhibited the JAR cell growth in a dose-dependent manner at 72h.② 5-Fu inhibited the Proliferation of JAR cell，which may be inhibited at the Period of G0and G1.

Fluorouracil Choriocarcinoma Proliferating cell nuclear antigen Growth inhibitors

*陜西省教育廳課題(14JK1211)

氟尿嘧啶 絨毛膜癌 增殖細(xì)胞核抗原 生長抑制物

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.06.004

△陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

▲通訊作者：西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院