雞新城疫免疫膠體金診斷技術(shù)

摘要：雞新城疫是由新城疫病毒引起的、具有高度感染性和致死性的疾病。這種病毒主要通過病雞的腦、血液、糞便、內(nèi)臟和口鼻傳播，侵害雞的呼吸道、胃腸道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前國內(nèi)外對雞新城疫不能很好地控制病毒的傳播和蔓延。膠體金診斷技術(shù)是用于對雞新城疫的檢測技術(shù)，本文主要從膠體金診斷技術(shù)的材料與方法、結(jié)果與診斷等方面進行闡述。

雞新城疫是侵害雞和火雞的主要疾病之一，它是一種急性傳染病，對養(yǎng)禽業(yè)的危害很大。目前實驗室對該病的診斷技術(shù)主要有3種，即血凝抑制試驗（HI）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） [1]。然而，血凝抑制試驗不敏感、檢測的樣本數(shù)量比較少、不同實驗室檢測出的結(jié)果會有很大差異，而且受人為因素的影響較大。其他幾種方法操作起來比較麻煩，而且技術(shù)含量比較高，無法大面積或者在基層推廣，因而建立一種簡便快捷、操作性強的診斷技術(shù)勢在必行，這種技術(shù)就是膠體金診斷技術(shù)。

膠體金是一種依靠靜電排斥作用來維持自身穩(wěn)定的膠體體系，吸附作用強，其顆粒是單個存在的帶負(fù)電荷的疏水膠，必須被大分子包裹起來才能在電解質(zhì)中穩(wěn)定存在，而且它可以同糖蛋白、毒素、抗生素、酶及激素等物質(zhì)的非蛋白質(zhì)進行結(jié)合，因而可以作為免疫反應(yīng)的標(biāo)記。用蛋白質(zhì)標(biāo)記膠體金，方法簡便快捷，試劑性能好，反應(yīng)時間短，結(jié)果用肉眼即可鑒定。

1　材料

疫苗為新城疫Ι系疫苗和新城疫Lasota毒株；實驗動物為病雞（非免疫）、土雞和家兔（健康）；藥品為氯化金、葡萄糖凝膠、硝酸纖維素膜、去離子水、牛血清蛋白、玻璃纖維、檸檬酸鈉、聚乙二醇和透析袋。

2　方法

（1）IgG的分離與提純。IgG的提取采用鹽析法，將50mL雞血清與50mL生理鹽水混合，緩慢加入到100mL35%硫酸銨溶液，并不斷攪拌，在4℃冰箱中過夜，然后離心棄去上清液。將沉淀物再次進行懸浮與離心洗滌。沉淀物在緩沖液中透析、除鹽，直到將硫酸除盡，獲得粗提純。將泡好的葡萄糖凝膠與緩沖液進行平衡，然后將其裝在長25cm、半徑1cm的層析柱中。1小時后待多余液體流出來再加樣，用少量緩沖液清洗管壁內(nèi)側(cè)，流出大約20mL的洗脫液時用20%磺基水楊酸進行檢測，收集所需蛋白質(zhì)并用蔗糖濃縮。

（2）抗體制備。將2月齡以上的雞用雞新城疫Ι系疫苗進行免疫，2周以后再次免疫。10天后進行試血，如果達到理想標(biāo)準(zhǔn)則進行心臟采血與血清分離，采集到的即為雞新城疫抗體。用鹽析法進行初步提純，然后用離子交換柱法進一步提純。將提純后的抗體在PEG-20000透析袋內(nèi)濃縮，并對蛋白質(zhì)濃度進行測試且調(diào)為1mg/mL，檢測抗體效價并進行冷凍保存。

將制得的雞新城疫抗體制成弗氏完全佐劑對家兔進行初次免疫，1個月以后再用弗氏不完全佐劑進行免疫，10天后進行試血，達到預(yù)期的效果后對其進行心臟采血與血清分離。用鹽析法進行初步提純，然后用離子交換柱法進一步提純，將提純后的抗體在PEG-20000透析袋內(nèi)濃縮，并對蛋白質(zhì)濃度進行測試且調(diào)為1mg/mL，檢測抗體的效價并進行冷凍保存。

（3）膠體金的制備。膠體金的制備采用檸檬酸鈉還原法。首先用去離子水配置氯化金溶液，配置的比例為0.01%。取100mL配置好的氯化金溶液進行加熱，加熱至沸騰時快速攪拌，在攪拌劇烈的情況下將配置好的檸檬酸鈉溶液迅速加入，繼續(xù)加熱至沸騰，5~8分鐘后溶液變?yōu)榫萍t色。用去離子水將溶液調(diào)為直徑約20nm的膠體金顆粒溶液，并在4℃下保存。

（4）膠體金標(biāo)記物的制備。取20mL膠體金顆粒溶液，用碳酸鉀溶液將pH調(diào)至9.0~9.2，在磁力的攪拌下慢慢加入0.4mL純化的一抗，攪拌20分鐘以后加入0.8mL聚乙二醇溶液，再加入0.4mL穩(wěn)定劑以防止發(fā)生非特異性凝聚。攪拌均勻后高速離心棄去上清液，將得到的沉淀物-膠體金蛋白質(zhì)結(jié)合物放入PBS中，制成包裹著蛋白質(zhì)的膠體金溶液，冷藏保存 [2]。

（5）膠體金試紙條的制備。將配置好的膠體金標(biāo)記均勻涂在玻璃纖維上，干燥后冷凍保存。

將一抗和二抗用pH7.5的PBS溶液稀釋，包裹在硝酸纖維素膜上，線的寬度保持在1nm左右，兩條線之間的距離控制在0.5cm。雞新城疫抗體線作為檢測線，兔抗雞抗體線作為質(zhì)控線，干燥以后用含1%BSA 的PBS進行封閉，保存?zhèn)溆谩?/p>

3　結(jié)語

膠體金診斷技術(shù)作為一種檢測雞新城疫的手段，具有可推廣性強及操作簡便快捷的優(yōu)點。膠體金的制備方法有很多，但是單一粒度膠體金顆粒的制備通常采用檸檬酸鈉還原法，使用這種方法制備效果更好。